青稞轉(zhuǎn)錄因子HvnANT1基因的克隆與表達(dá)分析

陳 林 姚曉華* 蘇樂平，4 姚有華 魏 嬋 吳昆侖

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016； 2.國家麥類改良中心青海青稞分中心，西寧 810016； 3.青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016； 4. 延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 延安 716000)

青稞(

Hordeum

vulgare

L. var.

nudum

Hook. f.)屬于禾本科大麥屬，也稱為裸大麥或米大麥(一些地區(qū)稱為元麥)。青稞因具有抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，因此能適應(yīng)高寒地區(qū)的環(huán)境。它還是青藏高原重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和飼料作物，距今已有約3 500年的種植歷史。青稞的生產(chǎn)直接影響著藏區(qū)的糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

大麥籽粒顏色分為黑、紫和藍(lán)色等，大麥顏色的差異主要是由花青素的積累引起的。花青素在植物中廣泛存在，是一類水溶性色素，屬于黃酮類次生代謝產(chǎn)物。有研究表明，花青素在籽粒的糊粉層積累，形成藍(lán)粒大麥；在籽粒的穎和穎片中積累會(huì)形成黑、紅和紫粒大麥。大麥籽粒中含有纖維、酚酸、黃酮類和植物甾醇等30多種功能成分，能輔助糖尿病、癌癥、降低膽固醇治療和預(yù)防心血管疾病的等功效，可防治20多種慢性病，大麥籽粒中的15種功能成分可預(yù)防11種慢性病。β-葡聚糖是具有降膽固醇、降血脂、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病的多糖，西藏青稞品種‘藏青25’中β-葡聚糖的含量高達(dá)8.62%。青稞中的維生素E具有抗氧化和抗癌等生理功能，黑青稞中B族維生素豐富，有助于維持人體的正常代謝活動(dòng)。因此，大麥作為功能性食品而受到學(xué)者們地廣泛關(guān)注。

已有研究表明，

ANT1

基因是屬于花青素合成通路中R2R3-MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子，是MBW調(diào)控復(fù)合體中的一部分。

ANT1

在植物生長(zhǎng)發(fā)育和花器官發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，Liu等研究認(rèn)為玉米

ANT1

能通過靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖和葉片生長(zhǎng)、維管和葉脈發(fā)育、葉綠體發(fā)育和光合作用。Shoeva等研究認(rèn)為大麥

ANT1

的啟動(dòng)子區(qū)域含有與光、生物、非生物逆境脅迫因子、植物激素相關(guān)的順式調(diào)控元件和控制植物生長(zhǎng)、發(fā)育及組織分化的一系列信號(hào)識(shí)別的元件。目前，關(guān)于大麥(青稞)粒色方面的研究主要集中在含量測(cè)定和基因定位等方面，尚未見花青素合成調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道。目前，青稞紫?；蚨ㄎ坏?H候選區(qū)段內(nèi)獲得1個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子

ANT1

，但并未進(jìn)行該基因的克隆及表達(dá)研究。本研究以紫粒青稞品種‘涅如姆扎’和白粒青稞品種‘昆侖10號(hào)’為試驗(yàn)材料，從中克隆了該基因，并對(duì)其序列進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位分析及

HvnANT1

基因與花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因

HvnCHI

、

HvnANS

、

HvnDFR

在不同生育階段的表達(dá)模式分析，旨在探究

HvnANT1

基因在青稞粒色形成過程中的基因表達(dá)模式，以期為揭示青稞紫粒形成的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試青稞品種為‘涅如姆扎’和‘昆侖10號(hào)’由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物栽培與育種研究所青稞研究室提供。2020年4月栽植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田，根據(jù)Zadoks等對(duì)谷物生長(zhǎng)階段的分類，在籽粒著色不同時(shí)期：乳熟早期(播種后11周)、乳熟晚期(播種后13周)和軟面團(tuán)期(播種后15周)取籽粒種皮，每樣品3次生物學(xué)重復(fù)。在液氮中進(jìn)行速凍后于-80 ℃保存。

1.2 青稞HvnANT1基因的克隆

利用簡(jiǎn)化基因組GBS(Genotyping-by-Sequencing)對(duì)青稞紫粒進(jìn)行基因定位，在7H染色體上84.30—86.00 cM候選區(qū)段內(nèi)獲得1個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子

HvnANT1

(Gene ID: MLOC_6171)。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)該基因引物(表1)。取‘涅如姆扎’和‘昆侖10號(hào)’的籽粒種皮，按照植物提取RNA試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit)提取青稞籽粒種皮的總RNA，用超微量核酸蛋白測(cè)量?jī)x(Nano Photometer)測(cè)定RNA的濃度和純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。參照cDNA合成試劑盒(PrimeScript 1 st Strand cDNA Synthesis Kit)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存。

以青稞種皮的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果參考姚曉華等的方法。目的條帶用柱式DNA膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)回收，用超微量核酸蛋白測(cè)量?jī)x(NanoPhotometer)測(cè)定回收產(chǎn)物的濃度和純度，與全式金生物公司的亞克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.3 青稞HvtANT1基因生物信息學(xué)分析

HvnANT1蛋白的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)用Expasy Protparma(http:∥www.expasy.org/tools/protparam.html)和Protscale(https:∥web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。HvnANT1蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)分別用SignalP4.1(http:∥www.Detaibio.com/tools/signal-peptide.html)和TMHMM-2.0(http:∥www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域。HvnANT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)運(yùn)用SPOMA(https:∥npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)分別預(yù)測(cè)。在NCBI的Blastp功能中，查詢與HvnANT1蛋白同源植株的ANT1蛋白序列，DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Mega 7.0軟件的Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 亞細(xì)胞定位

采用pBI221-GFP載體用于亞細(xì)胞定位研究，設(shè)計(jì)帶有

Xba

Ⅰ和

Kpn

Ⅰ酶切位點(diǎn)的正向引物與反向引物，采用高保真酶KOD-FX擴(kuò)增

HvnANT1

基因，構(gòu)建C端與GFP融合的表達(dá)載體。PCR擴(kuò)增體系與

HvnANT1

基因克隆時(shí)體系相同。PCR產(chǎn)物和PBI221-GFP載體質(zhì)粒經(jīng)

Kpn

I 和

Xba

I雙酶切后，T連接酶連接混合后的產(chǎn)物并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌

DH5α

感受態(tài)中，篩選陽性克隆及測(cè)序驗(yàn)證。將青稞種子在30 ℃黑暗萌發(fā)15 d取葉片切成碎段(<0.5 mm)，總量5～10 g，用于原生質(zhì)體制備，具體操作步驟參考李彥華等方法。

1.5 青稞HvnANT1基因表達(dá)模式分析

根據(jù)擴(kuò)增獲得的

HvnANT1

基因序列和大麥參考基因組(ftp: ∥ ftp.gramene.org/pub/gramene/release-63/fasta/hordeum_vulgare/dna/)的

HvnCHI

、

HvnANS

、

HvnDFR

基因序列(https: ∥ www.gramene.org/)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)

HvnANT1

、

HvnCHI

、

HvnANS

和

HvnDFR

的qRT-PCR引物(表1)。以‘涅如姆扎’和‘昆侖10號(hào)’的乳熟早期、乳熟晚期和軟面團(tuán)期的籽粒種皮cDNA為模板，

18SrRNA

作為內(nèi)參基因(表1)，采用TB Greenpremix ExTaq Ⅱ (TaKaRa公司)熒光染料利用Light Cycler 480 System進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系參考蘇樂平的方法。用2法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性檢測(cè)。

表1 本試驗(yàn)用到的引物序列
Table 1 Primers used in this study

引物名稱Primer name引物序列(5'→3')Primer sequence (5'→3')用途PurposeHvnANT1-1F: ATGGGGAGGAGGGCR: CGCAACGTACGGG基因克隆GenecloneHvnANT1-2F: AACAGCACGCTCGGCAGGAAR: AAGAAGAGGCCGCCAGTGCAqRT-PCR引物qRT-PCR primerHvnCHI F: GAACCACGATAAAACGCCCGR: AACGGAATGCCCTCCACTTCqRT-PCR引物qRT-PCR primerHvnANSF: GTATCTGCGAGCCAGACGATR: GTGCGCTATCCAGAAGACGGqRT-PCR引物qRT-PCR primerHvnDFRF: CCGTTCATCGAGCCATTGTCR: AGACGTAGTCGCCGTAAACCqRT-PCR引物qRT-PCR primerHvnANT1-GFPF: CGGCTACCACATCCAAGGAAR: CGGGTACCCACCGGCCATGTGCAGGGAC亞細(xì)胞定位載體Subcellular localization vector18SrRNAF: CGGCTACCACATCCAAGGAAR: GCTGGAATTACCGCGGCT內(nèi)參引物Control primer

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞HvnANT1基因的克隆及序列分析

以‘涅如姆扎’和‘昆侖10號(hào)’種皮反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用表1中

HvnANT1-1

(Geneclone)為引物，擴(kuò)增得到1條1 033 bp的目的條帶(圖1(a))。經(jīng)測(cè)序后用DNAMAN 6.0分析表明，該基因完整開放閱讀框(ORF)為762 bp，編碼253個(gè)氨基酸。

(a)HvnANT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物；(b)HvnANT蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；(c)HvnANT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖；(d)HvnANT蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)M，ML2000；1，青稞品種涅如姆扎PCR產(chǎn)物；2，青稞品種昆侖10號(hào)PCR產(chǎn)物；藍(lán)色表示α-螺旋；紅色表示延伸鏈；綠色表示β-轉(zhuǎn)角；橙色表示無規(guī)則卷曲。(a) PCR amplified product of HvnANT1; (b) Domain prediction of HvnANT1 protein; (c) Secondary structure prediction of HvnANT1; (d) Teritary structure prediction of HvnANT1M, DL2 000; 1, PCR product of Nierumuzha; 2, PCR product of Kunlun10; Blue color, α-helix; Red color, extended chain; Green color, β- turn; Orange color, randon coil.圖1 HvnANT1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及序列預(yù)測(cè)Fig.1 PCR amplification products and sequence prediction of HvnANT1 gene

測(cè)序后比對(duì)，‘涅如姆扎’和‘昆侖10號(hào)’的ORF區(qū)堿基序列和氨基酸序列一致性為100%，啟動(dòng)子序列比對(duì)結(jié)果為82.77%。利用SMART對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因具有2個(gè)典型的SANT結(jié)構(gòu)域，分別位于第13—第63個(gè)和第66—第114個(gè)氨基酸(圖1(b))。

HvnANT1蛋白分子式為CHNOS，分子量為27.14 kU，不穩(wěn)定指數(shù)為71.53，脂溶系數(shù)是69.21，pI 9.32，其中負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)為27個(gè)，正電荷殘基(Asp+Glu)為35個(gè)。平均疏水性為-0.464。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HvnANT1蛋白是一個(gè)親水性的不穩(wěn)定堿性蛋白。HvnANT1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，且無信號(hào)肽。

通過對(duì)HvnANT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，HvnANT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由無規(guī)卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角組成，其中無規(guī)卷曲占47.04%，α-螺旋39.13%，延伸鏈5.93%，β-轉(zhuǎn)角7.91%，可見該蛋白是以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)在蛋白行使功能時(shí)可能發(fā)揮重要作用(圖1(c))。HvnANT1蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HvnANT1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域?yàn)椤甐’形(圖1(d))。Uniprot基因注釋結(jié)果表明該蛋白為HvnANT1。

2.2 HvnANT1蛋白的同源比較及進(jìn)化樹分析

由圖2可知，青稞HvnANT1蛋白與大麥(

Hordeum

vulgare

)、烏拉爾圖小麥(

Triticum

turgidum

)、高粱(

Sorghum

bicolor

)、玉米(

Zea

mays

L

)、二型花(

Dichanthelium

oligosanthes

)、小米(

Setaria

italica

)、水稻(

Oryza

rufipogon

)、土瓶草(

Cephalotus

follicularis

)、車軸草(

Trifolium

affine

)和楊梅(

Morella

rubra

)10種植物的ANT1蛋白序列相似性分別為100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05% 和36.33%，這些序列都具有2個(gè)高度保守的SANT結(jié)構(gòu)域。由圖3可知，在7種禾本科植物中，青稞HvnANT1蛋白與大麥的親緣關(guān)系最近，與水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

Hvn，青稞；Hv，大麥；Tu，烏拉爾小麥；Zm，玉米；Do，二型花；Si，小米；Or，水稻；Sb，高粱；Ta，車軸草；Mr，楊梅；Cf，土瓶草。紅色箭頭之間代表HvnANT1蛋白的SANT保守功能域。Hvn, Hordeum vulgare; Hv, Hordeum vulgare; Tu, Triticum urart; Zm, Zea mays; Do, Dichanthelium oligosanthes; Si, Setaria italica; Or, Oryza rufipogon; Sb, Sorghum bicolor; Ta, Trifolium affine; Mr, Morella rubra; Cf, Cephalotus follicularis. The red arrows represent the SANT conserved functional domain of HvnANT1 protein.圖2 HvnANT1與其他植物ANT1蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of amino acids sequences of HvnANT1 and ANT1 proteins from other plants

圖3 HvnANT1蛋白與其他植物系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of the HvnANT1 protein and other plants

2.3 HvnANT1亞細(xì)胞定位

由圖4可知，HvnANT1-GFP融合蛋白在細(xì)胞核中有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，說明青稞HvnANT1蛋白定位于細(xì)胞核中。

激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)的設(shè)置為：GFP 448 nm(綠色)；葉綠體400 nm(紅色)。The excitation wavelength of the confocal laser microscope： Chloroplaste ia set as GFP 448 nm (green), chloroplasts 400 nm (red).圖4 HvnANT1亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular location of HvnANT1

2.4 HvnANT1基因表達(dá)分析

由圖5可知,在青稞籽粒顏色形成的乳熟早期、乳熟晚期和軟面團(tuán)期，‘涅如姆扎’的

HvnANT1

基因的表達(dá)量逐漸升高，乳熟晚期表達(dá)量為乳熟早期的5.76倍，軟面團(tuán)期表達(dá)量為乳熟晚期的6.96倍；而‘昆侖10號(hào)’3個(gè)時(shí)期

HvnANT1

表達(dá)量差異均不顯著；且軟面團(tuán)期‘涅如姆扎’籽粒

HvnANT1

基因的表達(dá)量極顯著高于‘昆侖10號(hào)’(

P

<0.01)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。Different capital letters are extremely significantly different at P<0.01.圖5 HvnANT1(a)、HvnCHI(b)、HvnANS(c)和HvnDFR(d)在不同青稞品種乳熟早期、乳熟晚期和軟面團(tuán)期的表達(dá)量Fig.5 Expression of HvnANT1 (a), HvnCHI (b), HvnANS (c) and HvnDFR (d) in the early milk, late milk and soft dough of different hulless barley varieties

HvnCHI

和

HvnANS

與

HvnANT1

表達(dá)量趨勢(shì)一致(圖5(b)和(c))；

HvnDFR

基因在‘涅如姆扎’的乳熟早期、乳熟晚期的表達(dá)量均低于‘昆侖10號(hào)’但差異不顯著；但在軟面團(tuán)期，高于‘昆侖10號(hào)’且具有極顯著差異(

P

<0.01)，與乳熟早期和乳熟晚期相反。

3 討 論

花青素廣泛的存在于植物中，是一種黃酮類化合物，通過普遍存在的次生代謝途徑合成。常見的花青素有天竺葵素(pelargonidin)、矢車菊素(cyanidin)、飛燕草素(delphinidin)、芍藥素(peonidin)、矮牽牛素(petunidin)和錦葵素(malvidin)?；ㄇ嗨刈鳛樘烊簧囟哂泻軓?qiáng)的藥用價(jià)值，例如抗氧化性、抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤、抗糖尿病和抗癌等作用。MBW(MYB-bHLH-WD40)復(fù)合物在花青素生物合成途徑中發(fā)揮重要的作用，MYB、bHLH和WD40三類轉(zhuǎn)錄因子常通過形成三元復(fù)合體來發(fā)揮功能。其中MYB基因在植物界中是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，也是植物花青素合成途徑中最廣泛的調(diào)節(jié)因子。本研究中的

HvnANT1

基因即屬于MYB家族，因此，探究該基因?qū)η囡ㄇ嗨氐暮铣捎兄匾囊饬x。擬南芥

ANT

基因家族相關(guān)研究較多，與生長(zhǎng)發(fā)育有著密不可分的關(guān)系，

ANT

是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，含有2個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)胚珠、胚珠發(fā)育和花器官生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用。在擬南芥中，ANT蛋白屬于AP2相關(guān)基因家族，對(duì)胚珠發(fā)育至關(guān)重要。大麥

ANT1

是玉米

C1

基因的同源物，

C1

基因是編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，在大麥中

ANT1

基因(或稱為

Rs

)被定位在7H染色體短臂的著絲粒區(qū)域內(nèi)。本研究中，青稞HvnANT1和大麥ANT1蛋白相似性為100%(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹也表明，兩者遺傳距離最近。Zakhrabekova等研究表明，大麥

ANT1

是一個(gè)MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子，與高粱Sb10g006700相似，可能具有編碼花青素C1/MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能。因此推測(cè)青稞

HvnANT1

也具有類似的功能。HvnANT1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白含有2個(gè)高度保守的SANT結(jié)構(gòu)域。Aasland等研究表明，SANT結(jié)構(gòu)域與MYB相關(guān)蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似性很高。通過亞細(xì)胞定位分析，

HvnANT1

基因定位在細(xì)胞核中，這與暴志茹在二球懸鈴木(

Platanus

acerifolia

)中的研究結(jié)果一致，符合轉(zhuǎn)錄因子的特性。因此推測(cè)在花青素合成過程中，轉(zhuǎn)錄因子HvnANT1在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮重要作用。已有研究表明，

ANT1

基因在花青素合成的途徑中起關(guān)鍵作用，Jende等與Franckowiak等研究認(rèn)為

ANT1

突變后在大麥的莖、葉耳、芒、外稃或基生葉鞘中花青素均不再累積，

ANT1

基因可決定大麥葉鞘的花青素色素沉著；

ANT

1是玉米

C1

基因的同源物，是花青素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，Zakhrabekova等研究表明，對(duì)無花色素苷1(ert-m ant1)雙突變體表型觀察可知，

ANT

1基因產(chǎn)物參與花青素的生物合成；等研究表明，番茄中過量表達(dá)

ANT1

基因，會(huì)使花青素大量積累導(dǎo)致植株變?yōu)樽仙?。本研究認(rèn)為紫粒青稞品種‘涅如姆扎’隨種皮顏色的加深，

HvnANT1

基因表達(dá)量顯著升高；且在青稞籽粒顏色形成的過程中，尤其是軟面團(tuán)期紫粒種皮的

HvnANT

1表達(dá)量極顯著高于白粒品種種皮中的表達(dá)量；與花青素合成相關(guān)的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因

HvnANS

、

HvnDFR

和

HvnCHS

的表達(dá)量也具有類似的結(jié)果(圖5)。已有研究表明，

CHI

、

F3

′

H

、

DFR

和

ANS

這4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄依賴于

ANT1

的等位基因狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)

HvnCHI

和

HvnANS

表達(dá)量與

HvnANT1

趨勢(shì)一致。推測(cè)，

HvnANT1

基因在紫粒青稞‘涅如姆扎’粒色形成過程中對(duì)花青素合成關(guān)鍵基因

HvnANS

、

HvnDFR

和

HvnCHI

存在調(diào)控的作用。Nakatsuka等研究結(jié)果表明，

DFR

基因的表達(dá)量在被片、花藥、花絲、雌蕊和紅色的鱗片中隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育而增加，因此認(rèn)為該基因僅在花色素苷著色的器官中表達(dá)，并且此種基因的表達(dá)量與花色素苷的含量呈正相關(guān)。本研究中，乳熟早期和乳熟晚期

HvnDFR

基因在‘昆侖10號(hào)’和‘涅如姆扎’中均有顯著表達(dá)，但差異不顯著，這可能是由于

DFR

基因不僅是催化生成不穩(wěn)定花色素苷的限速酶，而且還是單寧和蘆丁等次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶。由此推測(cè)

DFR

基因參與了單寧和蘆丁等次生代謝物的合成，但具體調(diào)控過程尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究從簡(jiǎn)化基因組GBS中對(duì)青稞紫?；ㄇ嗨睾铣上嚓P(guān)基因定位，在7H染色體的84.30—86.00 cM中定位到

HvnANT1

基因，分別在‘昆侖10號(hào)’和‘涅如姆扎’中克隆到該基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，青稞

HvnANT1

完整開放閱讀框?yàn)?62 bp，編碼253個(gè)氨基酸，屬于MYB家族，定位于細(xì)胞核。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在乳熟晚期青稞

HvnANT1

、

HvnANS

、

HvnDFR

和

HvnCHI

基因在‘涅如姆扎’中的表達(dá)量均顯著高于‘昆侖10號(hào)’。