多抗優(yōu)質(zhì)櫻桃番茄資源鑒定及篩選

王珊珊 楊超沙 尹偉平 王國華 張立永 尹慶珍*

(1.河北省農(nóng)林科學院 經(jīng)濟作物研究所，石家莊 050051； 2.承德市農(nóng)林科學院，河北 承德 067055； 3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院，石家莊 050026)

番茄是我國主要的蔬菜作物之一，櫻桃番茄口感好，維生素含量豐富，營養(yǎng)價值高，廣泛受到人們喜愛。目前口感較好的櫻桃番茄品種主要由櫻桃番茄育種起步較早的日本和荷蘭等國家選育，但都存在種植成本高或無法滿足消費者日益增長的需求或?qū)ΜF(xiàn)在的茬口適應(yīng)性下降等問題。此外，隨著各地櫻桃番茄種植面積不斷增加，病害也逐漸加重。目前世界范圍內(nèi)已有200余種番茄病害，其中造成我國番茄明顯減產(chǎn)的病害就有10多種，包括番茄黃化曲葉病毒病、根結(jié)線蟲病、葉霉病、斑萎病毒病、晚疫病、頸腐根腐病、枯萎病和灰葉斑病等，導(dǎo)致櫻桃番茄產(chǎn)量損失嚴重。為了緩解這一情況，目前已有學者在番茄抗病基因篩選方面開展了研究。陳寶玲等對56份大、中果型番茄進行了煙草花葉病毒病抗性基因

Tm-2

、番茄黃化曲葉病毒病抗性基因

Ty-1

、

Ty-2

和

Ty-3

、葉霉病抗性基因

Cf-9

、晚疫病抗性基因

Ph-3

、枯萎病抗性基因

I-2

和根結(jié)線蟲病抗性基因

Mi-1

共6種病害8個抗性基因的檢測，檢測出含有7個抗病基因的材料1份，含有6個抗性基因的5份，含有5個抗性基因的2份；陳莉菁等利用功能標記對234份番茄材料進行5個抗病基因(

Cf-9

、

Mi-1

、

I-2

、

Ph-3

和

Tm-2

)的檢測，檢測出含4個抗病基因的材料6份，含3個抗病基因的23份，含2個抗病基因的70份，含1個抗病基因的106份；暴會會等對32份番茄材料進行抗性基因(

Ty-2

、

Ty-3

、

I-2

、

Ph-3

、

Tm-1

、

Mi

和

Rin

)分子標記輔助選擇，結(jié)果表明含有

Ty-3

的材料2份，含

I-2

的23份，含

Mi-1

的8份，含

Rin

的5份。隨著人民生活水平的不斷提高，人們更加關(guān)注于番茄的口感、風味和營養(yǎng)物質(zhì)，對優(yōu)質(zhì)番茄需求量增加，學者們對番茄品質(zhì)特性的研究也從未停止。趙鶴等對5個中果型番茄和5個小果型番茄進行了果形、果色、心室數(shù)和果肉厚等外觀品質(zhì)以及可溶性固形物含量(TSS)、可滴定酸含量和番茄紅素等營養(yǎng)品質(zhì)進行了對比，篩選出了糖酸比和可溶性糖含量較高，果實風味品質(zhì)較好的中果型番茄‘絕粉702’‘桃星’及櫻桃番茄‘千禧’‘維納斯’。但目前利用分子標記輔助和營養(yǎng)品質(zhì)篩選優(yōu)質(zhì)多抗資源的綜合選育研究工作較少。因此，培育抗病(尤其是多抗)、高品質(zhì)和適合國內(nèi)設(shè)施栽培的櫻桃番茄新品種是今后一段時期我們面臨的最重要的育種任務(wù)。本研究利用分子標記技術(shù)對已有的及新引進的櫻桃番茄資源進行了黃化曲葉病毒病抗病基因

Ty-1

、

Ty-2

(BBC83286)、斑萎病抗病基因

Sw-5

(LOC101248920)、根結(jié)線蟲病抗病基因

Mi-1

(AF039681)、頸腐根腐病抗病基因

Frl

、葉霉病抗病基因

Cf-5

(101266520)、

Cf-9

(U15936)、灰葉斑病抗病基因

Sm

(XP_015159005)、枯萎病抗病基因

I-2

(AF118127)、

I-3

(PRJNA413174)和晚疫病抗病基因

Ph-3

(KJ563933)共11個抗性基因(8種病害)的檢測，同時對篩選出的多抗資源進行TSS含量、總酸含量、固酸比、

L

(Luminosity，代表明亮度)、

a

(Redness，代表從紅色至綠色的范圍)、

b

(Yellowness，代表從黃色至藍色的范圍)、番茄紅素和硬度等營養(yǎng)品質(zhì)、風味品質(zhì)和貯藏品質(zhì)進行綜合分析，以期獲得多抗且優(yōu)質(zhì)的櫻桃番茄資源，為櫻桃番茄新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用櫻桃番茄植株葉片及果實采于河北省農(nóng)科院經(jīng)作所大河園區(qū)三連棟日光溫室內(nèi)。本研究選擇的59個番茄品種，品種名稱及編號見表1。每個品種選取10～12株采集幼嫩葉片，共696份番茄材料。

表1 櫻桃番茄種質(zhì)資源
Table 1 Number and source of cherry tomato germplasm resources

編號Number品種名稱Species name編號Number品種名稱Species name編號Number品種名稱Species name165S18-01 F2185WT-21 F2205壽光紅櫻桃 F2166粉雅 F2186WT-23 F2206粉妃 F2167粉90 F2187紅鉆2號 F2207皇妃 F2168貝絲 F2188黃鉆 F22082024 F2169廣櫻1號 F2189櫻莎黃 F22092029 F2170廣櫻2號 F2190哈研花生柿子 F22102028 F2171廣櫻3號 F2191JS502 F22112027 F2172廣櫻4號 F2192酒賓1號F22122026 F2173廣櫻5號 F2193Y18-04 黃 F2213櫻桃50號 F2-1174廣櫻6號 F2194Y18-04 紅 F2214櫻桃50號 F2-4175廣櫻7號 F2195冀東310 F2215櫻桃51號 F2-18176廣櫻8號 F2196黃蜜 F2216豐賓 F2-8177華美1718-4 F2197金陽蜜珠 F2217豐賓 F2-10178華美1718-26 F2198惠紅 F22191665 F2-8179華美1718-70 F2199金鈺2號 F22201665 F2-9180Sweet honey F2200金鈺 F2224櫻桃29號F2-2-7181華美yingzi F2201石引1號 F2225櫻桃29號F2-2-10182華美 Sweet heart F2202花生番茄 F2226涿櫻1號 F2-1-1183華美 Sweet heat F2203夏日陽光 F2227櫻桃55號 F2-M2184WT-11 F2204冰淇淋番茄 F2

1.2 儀器和設(shè)備

ATAGO PAL-BX ACID F5糖度計(ATAGO公司，日本)，游標卡尺(天津市量具刃具有限公司，天津)，JA21002電子天平(上海精密科學儀器有限公司，上海)。

1.3 測定方法

1

.

3

.

1

縱徑、橫徑、果肉厚和單果重的測定

參照李錫香等的方法進行測定。

1

.

3

.

2

可溶性固形物含量、總酸含量和固酸比的測定

使用ATAGO PAL-BX ACID F5糖度計測定，測前以蒸餾水調(diào)零。測定可溶性固形物含量時，在第二穗果實成熟期，隨機選取第二穗果上有代表性、成熟度適宜且無污染的櫻桃番茄果實，切碎，混勻，用紗布擠出勻漿汁液測定。取100 μL溶液滴加在感應(yīng)器上，打開儀器，測量可溶性固形物的含量，重復(fù)3次后取平均值，并計算標準差?？偹岷繙y量時，取1 g上述勻漿汁液加蒸餾水至50 g，攪拌均勻，取100 μL溶液滴加在感應(yīng)器上，在測糖的基礎(chǔ)上點擊儀器Start按鍵繼續(xù)測量，即可得到總酸含量。固酸比為可溶性固形物含量和總酸含量的比值。

1

.

3

.

3

色度的檢測參照裴嬌艷等的方法，用CS-580分光測色儀測定。隨機選擇充分成熟的果實，沿果面赤道一周均勻取3個點，測量

L

、

a

和

b

值。

L

值反映了果實的亮度，

a

值和

b

值反映果實的顏色。

a

值大，則紅色越深；

b

值大，則黃色越深。

1

.

3

.

4

抗性基因的檢測利用PARMS SNP檢測技術(shù)對

Ty-1

和

Ty-2

等11個抗性基因進行檢測。所用引物由武漢市景肽生物科技有限公司提供(尚未公開)。其依據(jù)的基本原理是：

Taq

DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，因此對于3′末端錯配的引物，以低于正常末端配對引物的速度延伸。當錯配堿基的數(shù)目達到一定程度或者條件達到一定的嚴謹程度時，3′末端堿基則因磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸，反應(yīng)終止，也就得不到特異長度的擴增條帶，從而表明模板DNA沒有與引物3′末端相應(yīng)的突變。針對不同的已知突變，設(shè)計3′末端堿基不同的等位基因正向引物分別對應(yīng)檢測位點的不同堿基。根據(jù)PARMS master mix(武漢市景肽生物科技有限公司)說明書配制PCR反應(yīng)體系后進行PCR的擴增，PARMS采用FAM和HEX作為報告熒光，ROX作為參比熒光，可在具有這3種熒光檢測通道的酶標儀以及定量PCR儀中進行快速檢測。本次檢測采用Tecan F200，掃描FAM、HEX和ROX信號，利用SNP Decoder對數(shù)據(jù)進行分析并統(tǒng)計結(jié)果。反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL；2×PARMS master mix 5 μL；標記引物(10 mmol/L)各0.15 μL；通用反向引物(10 mmol/L)0.4 μL，以ddHO補足至10 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，65 ℃(每循環(huán)下降0.8 ℃) 1 min，10個循環(huán)；95 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，10個循環(huán)。

1

.

3

.

5

番茄紅素含量計算

番茄紅素質(zhì)量分數(shù)(mg/g)測定時，選取測定可溶性固形物時的勻漿汁液，根據(jù)GB 10474—1989直接測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

營養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)后取平均值，并利用SPSS的Duncan進行標準差分析及顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃番茄材料抗性基因檢測結(jié)果

試驗結(jié)果表明，含黃化曲葉病毒病抗性基因

Ty-1

的材料共246份，占總植株的35.3%,其中含純合抗性基因的共99份，雜合的147份;不含有

Ty-1

抗性基因的有447份，因擴增信號無法明確判讀具體分群而無法判斷的材料3份。含黃化曲葉病毒病抗性基因

Ty-2

的材料共124份，占總植株的17.8%，其中含有純合抗性基因的材料共34份，雜合基因材料90份；不含有

Ty-2

抗性基因的有567份，無法判斷的材料5份。從檢測結(jié)果來看，番茄材料中含

Ty-2

的材料少于含

Ty-1

的材料。材料中含根結(jié)線蟲病抗性基因

Mi-1

的共403份，占總植株的57.9%，含有純合抗性基因材料共227份，雜合基因材料176份；不含有

Mi-1

抗性基因的有285份，無法判斷的材料8份。材料中含葉霉病抗性基因

Cf-5

的共514份，占總植株的73.8%，其中含純合抗性基因的材料共277份，雜合基因的材料237份；不含有

Cf-5

抗性基因的有181份，無法判斷的材料1份。含葉霉病抗性基因

Cf-9

的材料共138份，占總植株的19.8%，其中含純合抗性基因的材料共102份，雜合基因的材料36份;不含有

Cf-9

抗性基因的有555份，無法判斷的材料3份。與其他抗病基因相比，葉霉病抗病基因在檢測的材料中所占比例最高。材料中含頸腐根腐病標記基因

Frl949

的共225份，占總植株的32.3%，其中含純合抗性基因的材料共119份，雜合基因的106份；不含有

Frl949

抗性基因的有466份，無法判斷的材料5份。含頸腐根腐病標記基因

Frl954

的材料共226份，占總植株的32.5%，其中含純合抗性基因的材料共118份，雜合基因的材料108份；不含有

Frl954

抗性基因的有468份，無法判斷的材料2份。含頸腐根腐病標記基因

Frl960

的材料共218份，占總植株的31.3%，其中含純合抗性基因的材料共97份，雜合基因的121份；不含有

Frl960

抗性基因共478份。材料中含枯萎病抗性基因

I-2

共41份，占總植株的5.9%，其中含純合抗性基因的材料共30份，雜合基因的材料11份；不含有

I-2

抗性基因的有606份，無法判斷的材料49份。含枯萎病抗性基因

I-3

的材料共33份，占總植株的3.2%，其中含純合抗性基因的材料共10份，雜合基因的材料13份；不含有

I-3

抗性基因的有654份，無法判斷的材料9份。從檢測結(jié)果上來說，含

I-2

和

I-3

的資源所占比例相差不大。含晚疫病抗性基因

Ph-3

的材料共477份，占總植株的68.5%，其中含純合抗性基因的材料共310份，雜合基因的材料167份；不含有

Ph-3

抗性基因的有211份，無法判斷的材料8份。檢測結(jié)果表明，與其他抗病基因相比，晚疫病抗病基因在檢測的材料中所占比例相對較高。含灰葉斑病抗性基因

Sm

的材料共337份，占總植株的48.4%，其中含純合抗性基因的材料共301份，雜合基因的材料36份；不含有

Sm

抗性基因的354份，無法判斷的材料5份。含斑萎病抗性基因

Sw-5

的材料共15份，均含純合抗性基因，占總植株2.2%，不含有

Sw-5

抗性基因的有681份。從整體來看，材料中含抗病基因占比較大的抗病基因分比為葉霉病抗病基因

Cf-5

(73.8%)、晚疫病抗性基因

Ph-3

(68.5%)、根結(jié)線蟲病抗病基因

Mi-1

(57.9%)和黃化曲葉病毒病抗病基因，占比不超過10%的分別為枯萎病抗病基因

I-2

(5.9%)、

I-3

(3.2%)和斑萎病抗病基因

Sw-5

(2.2%)。這可能與番茄抗葉霉病和晚疫病育種工作開展的較早有關(guān)。

2.2 櫻桃番茄材料抗性基因數(shù)量統(tǒng)計

通過對696份番茄材料的11個抗性基因檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析，篩選出具有代表性的多抗資源材料25個，分別為166-10、172-1、177-9、219-11、192-2、170-2、171-3、217-12、180-4、202-3、179-7、204-9、226-2、176-6、214-4、213-8、191-6、215-11、165-6、189-11、216-5、182-1、205-10、208-2和168-5(表2)。其中含有7個抗性基因的共4份，分別為166-10、172-1、177-9和219-11；含有6個抗性基因的共8份，分別為192-2、170-2、171-3、217-12、180-4、202-3、179-7和204-9；含有5個抗性基因的共5份，分別為226-2、176-6、214-4、213-8和191-6；含有4個抗性基因的共7份，分別為215-11、165-6、189-11、216-5、182-1、205-10和208-2；含有3個抗性基因的共1份，為168-5。

表2 櫻桃番茄種質(zhì)資源抗性基因統(tǒng)計
Table 2 Statistics of resistance genes in cherry tomato germplasm resources

編號NumberTy-1Ty-2Cf-5Cf-9FrlI-2I-3Mi-1PH-3SW-5SM166-10抗抗-抗H--抗抗-抗172-1抗H--H抗-抗抗-抗177-9H-H-H--HH抗H219-11H抗H-抗--H抗-抗192-2-抗抗抗抗---抗-抗170-2-抗抗抗抗---H-抗171-3-H抗抗抗抗----抗217-12--H抗抗--H抗-抗180-4抗-H----抗抗抗抗202-3抗-H抗抗--抗--抗179-7抗-H抗-抗-抗H--204-9H-H-H--抗H-抗226-2-抗抗-抗---抗-抗176-6抗---H--抗抗-抗214-4抗-H----抗抗-抗213-8抗-H----抗抗-抗191-6H-抗--抗--抗-抗215-11抗---抗--抗抗--165-6--抗-抗---抗-抗189-11--抗抗抗---H--216-5--抗-抗---抗-抗182-1抗----抗抗抗--205-10--抗抗抗---抗--208-2抗--抗H--抗---168-5抗------抗--抗

注：抗表示含純合抗性基因，H表示雜合抗性基因，-表示不含抗性基因。
Note: 抗 means homozygous resistance gene. H means heterozygous resistance gene. - means no resistance gene.

2.3 多抗櫻桃番茄材料品質(zhì)及外觀鑒定

根據(jù)PARMS SNP檢測篩選結(jié)果，對25個多抗櫻桃番茄資源材料進行品質(zhì)和外觀調(diào)查及統(tǒng)計，包括果實顏色、果實縱經(jīng)、果實橫徑及比值、湯汁含量、胎座顏色、果皮厚度、心室數(shù)量、單果重、口感、可溶性固形物含量、總酸含量和

L

、

a

和

b

值，并計算番茄紅素的含量(表3和4)。

TSS質(zhì)量分數(shù)>6.70%的資源有14個，215-11和168-5質(zhì)量分數(shù)最高，均達到了7.50%，其中168-5口感較甜；總酸質(zhì)量分數(shù)>0.83%的資源有17個，215-11、219-11和172-1號分別達1.21%、1.19% 和1.19%，口感較酸。TSS質(zhì)量分數(shù)>6.70%，總酸質(zhì)量分數(shù)>0.86%，固酸比在7.50～8.61的資源有176-6、168-5、179-7、165-6、180-4和205-10，固酸比分別為8.61、8.43、8.07、7.79、7.60和7.50。綜合抗病性、TSS含量、總酸含量、固酸比和外觀品質(zhì)，篩選出多抗優(yōu)質(zhì)的資源6份，其中含有6個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為180-4和179-7，含有5個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為176-6，含有4個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為165-6和205-10，含有3個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為168-5。

L

值反應(yīng)果實的亮度，其中172-1號最高，為50.20，215-11和189-11均在40.00以上，而192-2和205-10的

L

值略低，在33.00左右。根據(jù)測得的

a

和

b

值，計算獲得番茄紅素質(zhì)量分數(shù)>0.60 mg/g的資源有6個，分別為192-2、177-9、219-11、202-3、214-4和216-5，192-2號番茄紅素質(zhì)量分數(shù)最高，為0.69 mg/g，果實為深紅或深粉色，即顏色越深，番茄紅素的含量越高；189-11、215-11和172-1號果實顏色為淺黃及深黃，番茄紅素質(zhì)量分數(shù)較低，僅為0、0.01和0.02 mg/g，即果實顏色越淺，番茄紅素含量越低。綜合抗病性、番茄紅素含量及外觀品質(zhì)，篩選出多抗且番茄紅素含量高的資源6份，其中含有7個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為177-9和219-11，含有6個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為192-2和202-3，含有5個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為214-4，含有4個抗性基因的優(yōu)質(zhì)資源為216-5。

3 結(jié)論與討論

陳寶玲等利用分子標記技術(shù)最終篩選出同時含有7個抗性基因的材料1份，含有6個抗性基因的材料5份，含有5個抗性基因的材料2份，8份多抗材料中，僅1份材料為櫻桃番茄(含5個抗性基因)，其余為大果型或中果型材料。陳莉菁等利用功能標記對234份番茄材料進行5個抗病基因的檢測，得到最多含4個抗性基因的材料6份，其中，3份材料為大果番茄，3份材料為櫻桃番茄。本研究通過分子標記技術(shù)對696份番茄材料進行11個抗性基因檢測，篩選出25個代表性多抗(三抗及以上)櫻桃番茄資源，占比42.4%，7個抗性基因以上的有4份，占比6.8%，含有6個抗性基因的共8份，占比13.6%。本研究篩選出多抗材料較多的原因可能是因為上述研究取樣不分大小果，檢測的抗病基因數(shù)量少，而本研究檢測了11個抗性基因，較7個抗性基因篩選目標性較多，且番茄材料份數(shù)較多。

鄧紅山等通過對41份番茄材料生物學性狀及抗病性分析，篩選出3種及以上抗性的材料7份，果實硬度好的材料2份，占比4.9%。本研究綜合抗病性、TSS含量、總酸含量、固酸比及外觀品質(zhì)，篩選出多抗優(yōu)質(zhì)番茄資源6份，占比10.2%，可能是因為櫻桃番茄本身優(yōu)質(zhì)多抗資源占比較大。

本研究發(fā)現(xiàn)，25個代表性多抗櫻桃番茄種質(zhì)資源TSS含量、總酸含量和固酸比差異較大，TSS含量最高的為215-11及168-5號，168-5號口感較甜，215-11號口感較酸，但其風味足，217-12號含糖量較低，但其固酸比較大，口感甜。因此在評價果實口感品質(zhì)時需結(jié)合含糖量及糖酸比進行綜合評價，本研究認為TSS質(zhì)量分數(shù)>6.70%，總酸質(zhì)量分數(shù)>0.86%，固酸比在7.50～8.61的櫻桃番茄資源風味佳且品質(zhì)好，可做為優(yōu)質(zhì)番茄的評價依據(jù)，這與李麗梅等結(jié)論基本一致。另外口感與風味物質(zhì)相關(guān)性較大，口感也因人而異，優(yōu)質(zhì)櫻桃番茄資源的評價標準和方法有待于進一步研究。

綜合抗病性與品質(zhì)來看，166-10含多個抗病基因，但TSS和番茄紅素含量較低，風味欠佳；168-5含抗病基因較少，TSS和番茄紅素含量較高，且糖酸比較高，風味較好。因此，在篩選優(yōu)質(zhì)多抗櫻桃番茄種質(zhì)資源時需注意考慮抗病性與品質(zhì)，同時綜合產(chǎn)量等其它農(nóng)藝性狀，才能同時滿足種植戶和消費者的需求。