山奈酚對急性酒精性肝損傷小鼠的肝保護作用研究

徐亞鵬，寇文龍，張鈺婷，邢圓圓，盧 燕，張文奎

（河南理工大學醫(yī)學院，河南 焦作 454002）

急性酒精性肝損傷發(fā)病機制復(fù)雜，乙醇及其毒性代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)過氧化、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等均參與其中[1]。在我國，酒精性肝病僅次于病毒性肝炎，已成為引起肝功能損害的第二大病因[2]。酒精性肝損傷目前沒有較好的臨床治療策略，因此尋找此類疾病的藥物顯得尤為迫切。山奈酚（Kaempferol,Kae）是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的黃酮類化合物，可通過提高人體對抗自由基能力起到抗氧化作用[3]。但是山奈酚是否對急性酒精性肝損傷具有保護作用尚不明確。ALT和AST時肝損傷疾病的敏感指標，主要存在于細胞漿內(nèi)，AST還存在于線粒體中，當肝細胞嚴重受損時，因肝細胞通透性增加。胞漿內(nèi)的ALT及線粒體內(nèi)的AST則釋放入血，導(dǎo)致血液中的ALT及AST的表達水平大幅升高[4]，因此可以采用這兩個指標評價小鼠肝臟的損害程度。

本研究擬通過一次性酒精灌胃建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，通過檢測血清中ALT、AST含量、觀察肝臟切片形態(tài)評價山奈酚對小鼠肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康C57BL/6J小鼠30只，雄性，八周，體重25g～30g，由河南斯克貝斯生物科技股份有限責任公司提供，許可證號：SCXK（豫）2020-0005，合格證號：410000000000001195。

1.2 主要試劑及儀器

山奈酚（諾斯夫生物技術(shù)有限公司提供），無水乙醇，羧甲基纖維素鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供）水合氯醛，福爾馬林溶液，精密分析天平（Mettler Toledo）、低溫離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）、自動生化分析儀

1.3 動物分組、給藥與造模

實驗小鼠飼養(yǎng)環(huán)境 23℃～ 25℃，30只健康雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。按體重隨機分為對照組、酒精組及給藥組（山奈酚低、中、高三個劑量組）共五組，每組6只。

將山奈酚溶于羧甲基纖維素鈉，超聲震蕩使其溶解，每天中午預(yù)防性給藥三天，對照組、酒精組分別按與給藥組等體積灌服生理鹽水，其余各組分別灌服相應(yīng)劑量山奈酚，其中低劑量組40mg/kg，中劑量組50mg/kg，高劑量組60mg/kg)，每只小鼠灌胃體積為0.5ml，第4天除對照組外其余各組均按12 ml/kg劑量一次性灌胃60%酒精（用無水乙醇稀釋，下同）造模[5]建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，灌胃60%酒精后小鼠禁食不禁水，灌胃后觀察小鼠精神狀態(tài)并記錄醒酒時間。

6h后每只小鼠給予5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，眼眶靜脈叢取血，采集血液，置于EP管內(nèi)，室溫靜置1h后，5000r/min離心15min，取上清液，分裝于EP管內(nèi)，于-80℃冰箱中保存。取血結(jié)束后，快速摘取肝臟組織，并固定于10%福爾馬林溶液中。

1.4 指標檢測及方法

1.4.1 狀態(tài)觀察

觀察各組動物的一般情況，包括醒酒時間、精神、活動狀況、飲食、排便、翻正反射等，有任何異常情況及時記錄。

1.4.2 血清生化指標測定

第4天灌胃酒精造模成功6h后，眼球靜脈取血，血液靜置1 h，4℃低溫下進行離心，5000 r/min離心15min后取上清液，測試ALT、AST濃度。

1.4.3 肝臟組織病理學觀察

取相同的小鼠肝臟部位，經(jīng)酒精梯度脫水，石蠟包埋，預(yù)冷切片，蘇木精-伊紅染色處理后，在400倍顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPadPrism6.01統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析，計量資料以（Mean&SEM）表示，各組間比較采用（oneway ANOVA）檢驗。檢驗水準：a=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 狀態(tài)觀察

造模前小鼠生活狀態(tài)正常，進食進水正常，毛色光澤，黑褐色顆粒樣大便。給予酒精造模后，除空白組外，其余各組小鼠先表現(xiàn)為行動緩慢，翻正反射消失，進入嗜睡醉酒狀態(tài)，進食少，毛散亂。灌胃4h后給藥高劑量組小鼠逐漸蘇醒，其他各給藥組小鼠也逐漸蘇醒，模型組小鼠仍處于嗜睡醉酒狀態(tài)。

2.2 小鼠血清ALT、AST數(shù)值統(tǒng)計（x±SD）

從表1中觀察可以得出各給藥組降低ALT、AST水平隨著劑量增大而增強。

表1 小鼠血清ALT、AST數(shù)值統(tǒng)計表

2.3 山奈酚對酒精性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響

如圖1所示，與對照組（control）相比，模型組（alcohol）小鼠血清中的AST、ALT水平顯著升高（P＜0.05），說明本研究成功建立了急性酒精性肝損傷的模型。與模型組相比各給藥組均可以抑制AST、ALT水平，在降低AST水平上高劑量組具有明顯優(yōu)勢。

圖1 山奈酚對酒精性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響

2.4 山奈酚對酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響

由圖2可以看出，空白對照組小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)明顯病變壞死和炎癥，肝細胞排列整齊，紅細胞未見滲出。模型組細胞出現(xiàn)大量壞死，細胞破裂，細胞核滲出，炎癥浸潤嚴重。給藥組可明顯改善酒精性肝損傷，肝索排列整齊，細胞形態(tài)趨于正常、紅細胞未滲出，無明顯炎癥浸潤。

圖2 酒精性肝損傷小鼠的肝臟組織形態(tài)學觀察（蘇木精-伊紅染色，×400）A：空白組；B：模型組；C：山奈酚低劑量組；D：山奈酚中劑量組；E：山奈酚高劑量組.標尺=25um

3 討論

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease,ALD）是指長期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，包括酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver,AFL）、酒精性肝炎（alcoholic hep-atitis,AH）、酒精性肝纖維化（alcoholic hepatic fibro-sis,AHF）、酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis,AC）和肝細胞癌（hepato cellular carcinoma,HCC）。酒精性肝病是世界范圍內(nèi)慢性肝病的最重要病因之一。約占全球死亡率的3.8%，在發(fā)達國家十分常見[6]。2007年美國國家防止酒精濫用及酒精中毒研究所的報告顯示肝硬化死亡率位于死亡原因的第12位，其中超過48%的比例與酒精有關(guān)。在我國，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高以及受“中國酒文化”的影響，酒精消費量逐年上升，酒精性肝病發(fā)病率也呈逐漸上升的趨勢。

肝臟是人體酒精代謝的重要器官，大約80%的酒精在肝臟中進行代謝。酒精攝入過多會導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)一系列損害性病變。如何安全有效地預(yù)防和治療酒精性肝病已受到全社會的關(guān)注[8]。山奈酚（Kaempferol）是常見的黃酮類化合物之一，也稱為山奈黃素、黃芪甙元、山柰酚-3等，分子結(jié)構(gòu)式為C15H10O6，分子量為286.23，在山奈等姜科植物根莖中的含量最為豐富，也存在于生活中常見的果蔬及草本植物中[9]。

既往研究已證實了山奈酚具有多種重要的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡、促進免疫調(diào)節(jié)等，在腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病腎病、急性肝損傷、骨關(guān)節(jié)炎等疾病中具有潛在的治療價值[10，12]。山奈酚具有十分明顯的抗炎作用，其作用機制主要包括調(diào)節(jié)促炎酶的活性和炎癥相關(guān)基因表達，抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等[13]。這為酒精性肝損傷的治療提供了新思路。

本研究明確了山奈酚對急性酒精性肝損傷小鼠的保肝作用，在模型組中小鼠的ALT、AST明顯高于空白組，提示急性肝損傷模型復(fù)制成功，而各給藥組ALT、AST較模型組明顯下降，且隨著劑量因素比重的增大，抑制作用更明顯。表明山奈酚預(yù)處理能穩(wěn)定肝細胞膜，抑制因肝細胞破裂、壞死而引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，保護肝細胞免于大量酒精攝入引起的損傷。本實驗結(jié)果為該產(chǎn)品的進一步開發(fā)與使用提供了實驗依據(jù)，為臨床酒精性肝病的治療提供了新思路。