基于有效組分檢測的厚樸生物堿有效部位的制備及抗炎活性研究

★ 褚洪標(biāo) 武繼斌 趙麗娟 李少彤 郭玉潔 梁兆昌（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江西 吉安 343009）

厚樸為木蘭科植物，主要分布在陜西、甘肅、湖北、四川、貴州等地。厚樸的干皮、根皮以及枝皮，溫味苦辛，無毒，入脾、胃、大腸，能溫中下氣，燥濕清痰，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管、抗?jié)兗翱鼓茸饔茫?］。盡管已對厚樸的主要成分厚樸酚、和厚樸酚等酚類物質(zhì)開展了較多研究，但針對厚樸中的生物堿成分研究較少［2-3］。厚樸生物堿含量的測定多采用滴定分析方法［4-5］，其提取及含量測定方法還不夠完善。

中藥有效部位由于能體現(xiàn)中藥多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮藥效的特點, 針對系列天然類似物進行有效部位的制備及活性測試，近年來成為中藥、天然藥物新藥開發(fā)的重要方向之一［6］。鑒于厚樸總生物堿具有強的藥理活性，通過研究其提取工藝，優(yōu)化提取方法以提高提取率，可以為相關(guān)的藥理活性實驗以及結(jié)構(gòu)修飾打下良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。N-降荷葉堿是厚樸生物堿中含量最豐富的成分之一，本實驗旨在建立高效液相色譜測定該成分的分析方法，便于評價及控制厚樸的品質(zhì)。

基于上述分析方法，采用離子交換樹脂分離富集技術(shù)，制備厚樸生物堿的有效部位，并對有效部位進行抗炎活性評價。為了探索N-降荷葉堿的抗炎機制，本實驗采用分子對接技術(shù)，以TNF-α，IL-1β，COX-1，COX-2為作用靶點，研究N-降荷葉堿與4種炎癥受體的結(jié)合方式，為厚樸的綜合利用和深入開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器、材料及動物

1.1 儀器

LC-10AT型島津高效液相色譜儀（日本島津公司，島津SPD-10A紫外檢測器）；FA1004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；SL-250型超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DG-160中藥材粉碎機（浙江瑞安飛達藥材器械廠）；YLQ-Q4 耳腫打孔器 （濟南益延科技發(fā)展有限公司）；沃特浦微量有機除熱原型超純水機（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；Sybyl-X 2.1 藥物設(shè)計與篩選軟件（Tripos公司）。

1.2 試藥

厚樸樣品于2018年8月采集于江西省井岡山，由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室梁兆昌教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd. et Wils.的干燥樹皮。對照品N-降荷葉堿為實驗室自制（高效液相色譜法測定峰面積，純度＞98 %）。001X7強酸性聚苯乙烯陽離子交換樹脂、 D-72強酸性大孔陽離子交換樹脂和D-152大孔弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂（天津興南允能高分子技術(shù)有限公司）。甲醇為色譜純，娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

1.3 實驗動物

清潔級昆明種小鼠，平均體質(zhì)量20 g，雌雄兼有，共312只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為＜湘＞ 2011-0003）。

2 方法

2.1 N-降荷葉堿含量的測定

2.1.1 N-降荷葉堿對照品溶液制備精密稱取自制的N-降荷葉堿對照品1.1 mg，置5 mL容量瓶中，按照流動相比例加甲醇和水至刻度線，搖勻，得到對照品溶液濃度為 0.22 mg/mL。

2.1.2 色譜條件Shimpack ODS色譜柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液（90∶10），檢測波長為285 nm；流速為 1 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量10 μL。在此條件下N-降荷葉堿與相關(guān)峰均能達到基線分離，在本法的色譜條件下，N-降荷葉堿分離度好，出峰完全且峰形較好，無基線漂移。見圖1。

圖1 N-降荷葉堿對照品（A）與厚樸生物堿供試品（B）高效液相色譜圖

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 線性關(guān)系考察取“2.1.1”項下配制的對照品溶液，加適量流動相配成以下6個梯度濃度的對照品溶液：C1溶液13.75 μg/mL、C2溶液27.50 μg/mL、C3溶液55.00 μg/mL、C4溶液110.00 μg/mL、C5溶液146.70 μg/mL、C6溶液220.00 μg/mL。在“2.1.2”條件下，分別測定其峰面積。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=6 902.2X+17 803（r=0.999 5），在13.75～ 220.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.1.3.2 精密度試驗取對照品溶液連續(xù)進樣5 次，每次 10 μL，按“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，計算其RSD為0.72%，說明儀器的精密度較好。

2.1.3.3 重復(fù)性試驗取厚樸生物堿同一樣品 5 份，按 “2.1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，計算其RSD為1.02%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.3.4 穩(wěn)定性試驗取測得的N-降荷葉堿含量較高的001X7乙醇組的供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h在“2.1.2”項下條件下進樣，測定其峰面積，計算得RSD為1.23%，說明該溶液在10 h內(nèi)呈現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。

2.1.3.5 加樣回收率試驗精密稱取 6 份已測含量的厚樸生物堿樣品適量，精密加入適量的N-降荷葉堿，按“2.1.2.3”項下方法制備所需溶液，按“2.1.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示N-降荷葉堿的平均回收率為95.76%，RSD為1.47%。

2.2 厚樸生物堿有效部位的制備

2.2.1 乙醇回流方法制備有效部位稱取厚樸干皮粉末375 g，將藥材均勻分配到3個1 000 mL圓底燒瓶中, 分別加入600 mL 95%乙醇，加熱回流1.5 h，趁熱抽濾，收集濾液，再分別加入300 mL 95%乙醇，再回流30 min，趁熱抽濾，收集濾液，合并兩次濾液，減壓濃縮，浸膏用2%鹽酸溶液溶解，定容至300 mL。分別將預(yù)處理好的001X7強酸性聚苯乙烯陽離子交換樹脂、 D-72強酸性大孔陽離子交換樹脂和D-152大孔弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂300 mL裝柱（25 mm×600 mm），大約體積為柱子的1/2，先用去離子水不斷地沖洗柱子，使樹脂之間的空隙減小，沖緊后樹脂體積變?yōu)橹拥?/3，然后將乙醇提取樣品加入到柱子中（BV 300 mL，流速1 BV/h）。待藥液上完后，以去離子水3 600 mL洗脫，流速同前，棄去水洗部分，待洗至中性，再以4%的氨水洗脫，流速同上，直至碘化鉍鉀檢識無生物堿沉淀反應(yīng)后，收集洗脫液并減壓濃縮，分別得褐色黏稠浸膏，稱重，制得生物堿有效部位。

2.2.2 鹽酸回流方法制備有效部位稱取厚樸干皮粉末375 g，將藥材均勻分配到 3個1 000 mL圓底燒瓶中，用去離子水將濃鹽酸稀釋成2%的稀鹽酸，在每個圓底燒瓶中分別加入 600 mL 2%鹽酸，加熱回流1.5 h，趁熱抽濾，收集濾液，再分別加入 300 mL鹽酸，再回流30 min，趁熱抽濾，收集濾液，合并兩次濾液，得鹽酸提取液。陽離子交換樹脂處理、上樣及洗脫方法同“2.2.1”方法。制得生物堿有效部位。

2.3 厚樸生物堿抗炎活性評價

2.3.1 小鼠耳腫脹試驗［7］首先，進行N-降荷葉堿的抗炎活性評價。昆明種小鼠60只，雌雄各半，按性別、體質(zhì)量隨機分為5組，每組12只，即蒸餾水組、阿司匹林組（0.5 g/kg）、N-降荷葉堿高劑量組（40 mg/kg）、中劑量組（20 mg/kg）、低劑量組（10 mg/kg）。小鼠均灌胃給藥，給藥容量均為每天1次，10 mL/kg，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后1 h，每只小鼠左耳廓兩面均勻涂抹100% 二甲苯0.05 mL致炎，右耳作對照。30 min后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm打孔器分別在左右耳的同一部位沖下圓形耳片，電子天平稱質(zhì)量，以兩耳片的質(zhì)量差作為耳腫脹度，計算腫脹抑制率。

其次，厚樸生物堿有效部位樣品實驗設(shè)置八組，即空白組，陽性對照組（阿司匹林組），鹽酸提取得到的D-152樹脂富集的浸膏組，001X7樹脂富集的浸膏組，D-72樹脂富集的浸膏組，乙醇提取得到的001X7樹脂富集的浸膏組，D-152樹脂富集的浸膏組，D-72樹脂富集的浸膏組，每組12只，給藥方式及耳腫脹度的測定與N-荷葉堿的方法相同，樣品組均灌以0.4 mg/（g·mL）。

2.3.2 小鼠足腫脹試驗［7］小鼠分組及給藥同“2.3.1”方法。于末次給藥1 h后，將25 μL 1%（W/V）角叉菜膠分別注射于小鼠右足，左腳不注射作為對照，致炎4 h后，脫頸椎處死，沿著小鼠踝關(guān)節(jié)剪下小鼠的兩足，分別稱重，以左右足的重量之差為腫脹度。

腫脹度=右足重（腫脹足）－左足重（對照足）

腫脹抑制率（%）=（對照組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度）/對照組平均腫脹度×100%。

2.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)均用（±s）表示，組間比較采用方差分析和t檢驗。

2.4 分子對接研究

2.4.1 蛋白質(zhì)及小分子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備以N-降荷葉堿為配體，與四個炎癥受體進行對接，三維結(jié)構(gòu)數(shù)值均來自于國際權(quán)威的PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 （http：//www.rcsb.org/pdb），分別為 TNF-α（PDB代碼：2AZ5），IL-1β（PDB代碼：1RWN），COX-1（PDB代碼：1CQE），COX-2（PDB代碼：1PXX），利用 Sybyl-x 2.1軟件對其進行結(jié)構(gòu)處理。提取復(fù)合物中原配體，確定結(jié)合位點，除去蛋白質(zhì)中的水及其他配體，為蛋白質(zhì)加氫、加電荷，配體模式用于設(shè)定對接口袋，保存為SFXC格式作為對接文件，為后續(xù)分子對接做準(zhǔn)備。N-降荷葉堿的立體結(jié)構(gòu)用 Sybyl-x 2.1軟件中的化學(xué)結(jié)構(gòu)繪制功能進行繪制，并利用軟件對其進行加Gasteiger-huckel電荷、加Tripos力場和能量最小化，進一步用軟件設(shè)定，保存為Sybyl_mol 2格式文件用于對接［8］。

2.4.2 分子對接打開 Surflex-Dock 模塊界面，讀入之前準(zhǔn)備好的結(jié)合口袋SFXC格式文件，設(shè)置配體文件為mol 2后讀入已準(zhǔn)備的N-降荷葉堿配體。對接過程中閾值參數(shù)為 0.5，膨脹系數(shù)為 1，其他參數(shù)為系統(tǒng)缺省值。Surflex-Dock模塊采用經(jīng)驗打分函數(shù)和專利搜索引擎，得到N-降荷葉堿與上述4個炎癥受體的Total score值。Total score 值綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，Total score 值越大，表明配體與受體結(jié)合力越強、結(jié)合活性越高［9］。

3 實驗結(jié)果

3.1 厚樸總生物堿提取率的結(jié)果

分別將乙醇回流和鹽酸回流得到的提取物，利用3種不同型號的離子交換樹脂進行上樣、洗脫及減壓濃縮，其總生物堿的提取率，見表1。實驗結(jié)果表明，對于厚樸總生物堿的提取，無論是提取重量還是提取率，采用乙醇回流提取的效果明顯比鹽酸回流提取的效果好；并且無論是乙醇回流提取法還是鹽酸回流提取法，D-72大孔強酸型離子交換樹脂的提取率和提取重量都最高，001X7聚苯乙烯型離子交換樹脂的提取效果次之，而D-152丙烯酸型離子交換樹脂的提取效果最差。乙醇回流提取的D-72大孔強酸型離子交換樹脂的提取重量和提取率分別達到 10.86 g 和 8.69%。

表1 不同提取方法生物堿提取率的比較

3.2 厚樸生物堿有效部位含量測定結(jié)果

精密稱取以上方法提得的6份生物堿有效部位各0.1 g, 置100 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，即為供試品溶液。在“2.1.2”條件下，分別測定其峰面積，每個樣品平行測定3次，求平均值，根據(jù)線性方程計算各供試品溶液中N-降荷葉堿單體的含量。依據(jù)質(zhì)量濃度，再分別計算各供試品溶液中N-降荷葉堿單體的質(zhì)量占生物堿有效部位的百分比。見表2。

表2 不同提取方法N-降荷葉堿占生物堿的比例 %

實驗結(jié)果表明，對于以上6份生物堿中N-降荷葉堿單體的含量測定，3種離子交換樹脂的乙醇回流提取法有效部位百分比都比鹽酸回流提取法的有效部位百分比高。并且對于3種離子交換樹脂的乙醇回流提取法，001X7聚苯乙烯型離子交換樹脂提取得到的生物堿中N-降荷葉堿所占百分比和原藥材中N-降荷葉堿所占百分比都最高，分別為15.804%和1.168%；D-152丙烯酸型離子交換樹脂提取得到的生物堿中N-降荷葉堿所占百分比次之，為5.146%，但是原藥材中N-降荷葉堿所占百分比最少，僅為0.189%；而D-72大孔強酸型離子交換樹脂提取得到的生物堿中N-降荷葉堿所占百分比最少，為3.683%，但是原藥材中N-降荷葉堿所占百分比卻比D-152丙烯酸型離子交換樹脂提取的原藥材中N-降荷葉堿所占百分比多，為0.320%。

3.3 厚樸生物堿抗炎活性評價

3.3.1 N-降荷葉堿的抗炎活性小鼠耳腫脹試驗：結(jié)果顯示，與蒸餾水相比，高、低劑量組對二甲苯所致的小鼠耳腫脹均有明顯的抑制作用（P＜0.01）。與阿司匹林組相比，高、低劑量組無顯著差異（P＞0.05），高、低劑量組與中劑量組相比有顯著差異（P＜0.01），顯示高、低劑量組的炎癥抑制作用明顯比中劑量組強。見表3。

表3 N-降荷葉堿對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（ ±s， n=12）

表3 N-降荷葉堿對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（ ±s， n=12）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與阿司匹林組比較，##P＜0.01。

組別 劑量/（mg·kg-1）耳腫脹度/mg 腫脹抑制率/% 空白對照組 — 6.48±1.72 — 阿司匹林組 0.50 2.56±2.04** 60.49 N-降荷葉堿高劑量 0.04 2.72±1.68** 58.02 N-降荷葉堿中劑量 0.02 5.62±2.78## 13.27 N-降荷葉堿低劑量 0.01 3.17±1.59** 51.08

小鼠足腫脹試驗：結(jié)果顯示，與蒸餾水相比，高、中、低劑量組對角叉菜膠所致的小鼠足腫脹均有明顯的抑制作用（P＜0.01，P＜0.05)。與阿司匹林組相比，高、低劑量組無顯著差異（P＞0.05），N-降荷葉堿高、低劑量組具有明顯炎癥抑制作用。見表4。

表4 N-降荷葉堿對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響（ ±s, n=12）

表4 N-降荷葉堿對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響（ ±s, n=12）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與阿司匹林組比較，#P＜0.05。

組別 劑量/（mg·kg-1）足腫脹度/mg 腫脹抑制率/% 空白對照組 — 10.14±0.27 — 阿司匹林組 0.5 4.47±0.68** 55.92 N-降荷葉堿高劑量 0.04 4.87±1.06** 51.97 N-降荷葉堿中劑量 0.02 6.45±1.87*# 36.39 N-降荷葉堿低劑量 0.01 5.66±1.43** 44.18

3.3.2 厚樸生物堿有效部位的抗炎活性小鼠耳腫脹試驗：結(jié)果表明與空白組比較，不同方法提取所得的厚樸總生物堿對二甲苯致小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制作用，其中，乙醇D-152丙烯酸組、乙醇001X7聚苯乙烯組和乙醇D-72大孔強酸組小鼠耳腫脹度均明顯降低，具有顯著性差異（P＜0.01），說明用乙醇提取得的抗炎效果更佳。乙醇D-152丙烯酸組、乙醇001X7聚苯乙烯組和乙醇D-72大孔強酸組的腫脹抑制率分別為 61.93%、60.60%和56.38%，即乙醇D-152丙烯酸組抗炎作用最強，其次是乙醇001X7聚苯乙烯組。與空白對照組比較，阿司匹林組具有顯著差異（P＜0.01）。另一方面，與阿司匹林組相比，乙醇D-152丙烯酸組、乙醇001X7聚苯乙烯組和乙醇D-72大孔強酸組無顯著性差異（P＞0.05），而鹽酸D-152丙烯酸組、鹽酸001X7聚苯乙烯組和鹽酸D-72大孔強酸組存在顯著性差異（P＜0.05）。見表5。

表5 厚樸生物堿對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（ ±s，n=12）

表5 厚樸生物堿對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（ ±s，n=12）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與阿司匹林組比較，#P＜0.05。

組別 劑量/（mg·kg-1）耳腫脹度/mg腫脹抑制率/%空白對照組 — 9.01±1.75 —阿司匹林組 0.50 3.70±0.93** 58.93乙醇D-152丙烯酸組 0.04 3.43±0.31** 61.93乙醇001X7聚苯乙烯組 0.04 3.55±0.61** 60.60乙醇D-72大孔強酸組 0.04 3.93±0.31** 56.38鹽酸D-152丙烯酸組 0.04 5.37±2.04**# 40.40鹽酸001X7聚苯乙烯組 0.04 5.83±1.09*# 35.29鹽酸D-72大孔強酸組 0.04 5.53±1.56**# 38.62

小鼠足腫脹試驗：結(jié)果表明，與空白對照組比較，不同方法提取所得的厚樸總生物堿對角叉菜膠致小鼠足趾腫脹均有一定的抑制作用，且均具有極顯著性差異（P＜0.01），說明不同提取工藝所得的厚樸總生物堿都可以降低角叉菜膠致小鼠足趾的腫脹，且乙醇D-152丙烯酸組作用最強，其次是乙醇001X7聚苯乙烯組，第三是乙醇D-72大孔強酸組，鹽酸組也顯示一定的抑制作用，但總體來說都小于乙醇提取組，說明用乙醇提取得到的總生物堿抗炎效果更佳。與阿司匹林組比較，鹽酸D-72大孔強酸組、乙醇回流D-152丙烯酸組，不存在顯著性差異（P＞0.05）；而乙醇D-152丙烯酸組、鹽酸D-72大孔強酸組，鹽酸001X7聚苯乙烯組，鹽酸D-152丙烯酸組相比，均存在顯著性差異（P＜0.05）。見表6。

表6 厚樸生物堿角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響（ ±s，n=12）

表6 厚樸生物堿角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響（ ±s，n=12）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與阿司匹林組比較，#P＜0.05。

組別 劑量/ （mg·kg-1）足腫脹度/mg腫脹抑制率/%空白對照組 — 11.70±0.31 —阿司匹林組 0.50 4.20±1.62**# 64.10乙醇D-152丙烯酸組 0.04 3.62±1.26** 69.06乙醇001X7聚苯乙烯組 0.04 3.90±0.06** 66.67乙醇D-72大孔強酸組 0.04 4.19±0.10** 64.19鹽酸D-152丙烯酸組 0.04 5.92±0.33**# 49.96鹽酸001X7聚苯乙烯組 0.04 5.83±0.75**# 50.17鹽酸D-72大孔強酸組 0.04 6.28±0.27*# 46.32

3.4 分子對接結(jié)果

N-降荷葉堿與TNF-α、IL-1β、COX-1、COX-2等4種炎癥受體分子對接的結(jié)果見表7，結(jié)合模式見圖2。結(jié)果顯示，N-降荷葉堿與TNF-α殘基TYR151形成1個氫鍵，分值為4.808 6，與IL-1β殘基GLU355和ARG383形成3個氫鍵，分值為4.494 6，與COX-1殘基TYR358和HIS386形成2個氫鍵，分值為5.485 9，與COX-2殘基GLN203形成1個氫鍵，分值為4.823 3。以上結(jié)果說明N-降荷葉堿可與四種炎癥受體較好的結(jié)合，與其小鼠炎癥實驗結(jié)果相吻合。

表7 N-降荷葉堿與4種炎癥相關(guān)受體的分子對接結(jié)果

圖2 N-降荷葉堿與TNF-α（A），IL-1β（B），COX-1（C），COX-2（D）炎癥受體分子對接模式

4 討論

生物堿是中藥厚樸具有代表性的活性成分類型之一，已從中分離到多種生物堿成分［10］，而N-降荷葉堿在厚樸中含量較高，是厚樸表現(xiàn)各種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其本身也表現(xiàn)出多種生物活性［11-12］，本實驗選擇N-降荷葉堿作為分析對象，分別選用了2%鹽酸、95%乙醇加熱回流進行厚樸生物堿的提取，并利用三種陽離子交換樹脂法純化生物堿類成分，得到生物堿有效部位［10-11］。綜合分析實驗結(jié)果，無論是提取重量還是提取率，采用乙醇回流提取的效果明顯比鹽酸回流提取的效果好，D-72大孔強酸型離子交換樹脂的提取率和提取重量都最好，001X7聚苯乙烯型離子交換樹脂的提取效果次之，而D-152丙烯酸型離子交換樹脂的提取效果最差。乙醇回流提取的D-72大孔強酸型離子交換樹脂的提取重量和提取率分別為10.86 g 和 8.69%，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是厚樸中的生物堿堿性較弱，在酸水中溶解度小，而用乙醇提取效率更高。本實驗采用高效液相色譜法，也能很好地反映厚樸生物堿提取率及N-降荷葉堿的含量。

本實驗以N-降荷葉堿為測定對象，通過鹽酸和乙醇作為提取溶劑，結(jié)合三種離子交換樹脂，得到生物堿有效部位，利用二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致小鼠足腫脹模型，對N-降荷葉堿單體及生物堿有效部位進行了抗炎活性評價。本研究的實驗結(jié)果也證實了在兩種炎癥模型上陽性對照組明顯高于空白組，N-降荷葉堿單體及有效部位都表現(xiàn)出了明顯的抗炎活性，尤其是乙醇作為溶劑得到的生物堿具有更好的抗炎活性，可能與用乙醇作為溶劑提取效率較高有關(guān)。

炎癥是一種臨床中最常見的病癥，是動物機體對致炎因子的損傷所發(fā)生的一種以防御為主、損傷和抗損傷同時存在的病理過程［13］。據(jù)流行病學(xué)和臨床資料顯示，多數(shù)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都伴隨著炎癥反應(yīng)，炎癥還能加速疾病的發(fā)展。巨噬細胞被各種致炎因子激活后可以產(chǎn)生一氧化氮（NO）和1L-1β、1L-6、TNF-α等炎癥因子，在炎癥發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用［14］。

分子對接方法在藥物研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，為先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化提供了有效的工具［15］。為了進一步探究生物堿發(fā)揮活性的藥效機制，探究生物堿與靶標(biāo)的結(jié)合情況及作用機制，基于Sybyl分子對接軟件，采用特征性的經(jīng)驗打分函數(shù)和搜索引擎（基于分子相似性），將配體分子N-降荷葉堿對接到TNF-α、IL-1β、COX-1、COX-2等4種炎癥受體分子蛋白的結(jié)合位點，Total score大于4以上，說明N-降荷葉堿可與四種炎癥受體能較好的結(jié)合，從而抑制其作用，產(chǎn)生藥效。分子對接結(jié)果進一步證實厚樸生物堿抗炎機制與不同程度地抑制炎性介質(zhì) TNF-α、IL-1β、COX-1、COX-2產(chǎn)生和釋放有關(guān)，也與生物堿對小鼠炎癥實驗結(jié)果相吻合。

本研究以高效液相色譜法測定厚樸中N-降荷葉堿的含量，建立了含量測定方法，分析方法準(zhǔn)確、簡便、重復(fù)性好，可作為厚樸生物堿成分的檢測方法。N-降荷葉堿單體及其生物堿有效部位都可在一定程度上抑制小鼠的炎癥，表明厚樸生物堿類成分有一定的抗炎作用，并且采用乙醇加熱回流提取效果更好；N-降荷葉堿分子對接結(jié)果與小鼠抗炎實驗結(jié)果相吻合。目前的研究成果為中藥厚樸生物堿的綜合利用和深入開發(fā)提供了參考依據(jù)。