雞源Cathelicidins家族抗菌肽研究進(jìn)展

彭練慈，蘆 懿，田洪亮，陳紅偉，葉 超，方仁東 (西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 北碚 400715)

隨著全球多重耐藥菌株的日益增加，能有效控制感染的抗生素急劇減少。此外，許多慢性炎癥性疾病的常用治療方法(如皮質(zhì)類固醇)會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)及產(chǎn)生具有耐藥性的頑固性病原體[1]。因此，迫切需要開發(fā)既可以殺死病原菌又可以解決有害炎癥的新型抗菌藥物。宿主防御肽(host defense peptides,HDPs)作為宿主自身分泌的小分子多肽，廣泛分布于不同動(dòng)物體內(nèi)，具有廣譜的抗菌活性[2]。

抗菌肽主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜的極化導(dǎo)致菌體破裂而發(fā)揮作用，由于不涉及其他靶標(biāo)，因此不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，在新型抗菌藥物的研發(fā)領(lǐng)域具有很大的優(yōu)勢和潛力。CATHs家族的抗菌肽作為宿主防御肽中的重要抗菌肽家族，除了具有更廣譜高效的抗微生物活性，還具有低細(xì)胞毒性、低溶血、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)等多種重要活性[3-4]，在新型抗感染及免疫調(diào)節(jié)藥物的研發(fā)領(lǐng)域具有巨大的潛力。

在所有CATHs生物活性的研究中，人源CATH (LL-37)的研究最為廣泛。近年來，牛、馬、豬等哺乳動(dòng)物CATHs的生物活性也受到獸醫(yī)領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注[5-8]，但是關(guān)于雞源CATHs的報(bào)道并不多。自2006年和2007年相繼發(fā)現(xiàn)雞體內(nèi)的CATHs后，近十幾年來，雞源CATHs的研究也取得了一定的進(jìn)展，其生物活性也在逐步被挖掘?，F(xiàn)對雞源CATHs結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、分布與表達(dá)、抗微生物活性、免疫調(diào)節(jié)活性等方面進(jìn)行綜述，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行綜合分析。

1 雞源CATHs結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系

迄今為止，雞CATHs包括fowlicidin-1 (cathelicidin-1,CATH-1)、fowlicidin-2 (cathelicidin-2,CATH-2 )、 fowlicidin-3 (cathelicidin-3,CATH-3)和cathelicidin-B1 (CATH-B1)[9-10]。

CATHs 的前體由N-端信號肽區(qū)域(29～30 aa)、中間保守cathelin區(qū)域(94～114 aa)和高度特異的C-末端成熟肽區(qū)域 (12～100 aa)構(gòu)成[3]。編碼C-末端成熟肽區(qū)域的序列具有多樣性，導(dǎo)致形成不同長度、不同電荷密度和結(jié)構(gòu)差異的成熟抗菌肽。所有CATHs都帶正電荷，使CATHs可以和帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，從而發(fā)揮抗菌活性，且不易產(chǎn)生耐藥性。

CATH-1、CATH-2和CATH-3具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，都是由中間的鉸鏈區(qū)域?qū)-末端的α-螺旋結(jié)構(gòu)和N-末端的氨基殘基連結(jié)而成[11-13]。XIAO等[11]研究表明fowlicidin-1的α-螺旋結(jié)構(gòu)包含的8個(gè)氨基殘基與其抗菌、溶血及中和LPS活性緊密相關(guān)。BOMMINENI等[14-15]證實(shí)fowlicidin-1在體內(nèi)外均具有廣譜抗菌活性及免疫調(diào)節(jié)活性。fowlicidin-3的α-螺旋結(jié)構(gòu)功能區(qū)是由第17 位甘氨酸扭結(jié)連結(jié)9～25位的氨基殘基構(gòu)成[12]，具有廣譜抗菌活性，但是QU等[16]研究表明，fowlicidin-3中間鉸鏈區(qū)(-AGIN-)并無抗菌活性，反而能增加溶血活性和細(xì)胞毒性。與fowlicidin-3相反的是，XIAO等[13]和VAN DIJK等[17]研究表明，CATH-2的鉸鏈區(qū)域(氨基殘基13～20)對其抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性具有重要作用。這些研究結(jié)果說明抗菌肽的結(jié)構(gòu)對其功能的發(fā)揮起了關(guān)鍵性的作用，抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究對于優(yōu)化抗菌肽序列、增強(qiáng)生物活性及抗菌肽的應(yīng)用具有指導(dǎo)性的意義。與其他3種抗菌肽研究相比，關(guān)于CATH-B1的結(jié)構(gòu)知之甚少，它的氨基酸序列已被預(yù)測，但分子構(gòu)象尚未確定[10]。PENG等[18-19]最新的研究表明CATH-B1具有良好的抗病毒及免疫活性，但是它的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

2 雞源CATHs的分布與表達(dá)

CATHs在上皮細(xì)胞、黏膜表面和皮膚少量表達(dá)，主要是由中性粒細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞釋放。首先以失活的前體形式儲(chǔ)存在粒細(xì)胞的分泌顆粒中，當(dāng)機(jī)體受到病原微生物入侵時(shí)，被彈性蛋白酶切割為成熟的抗菌肽釋放到機(jī)體中進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。VAN DIJK等[20]和SEKELOVA等[21]分別通過抗體及液相色譜-質(zhì)譜法檢測到CATH-1、CATH-2和CATH-3蛋白均在異嗜性粒細(xì)胞中表達(dá)，類似于人源CATH (LL-37)在中性粒細(xì)胞中大量表達(dá)[22]，分布于機(jī)體的全身。GOITSUKA等[10]發(fā)現(xiàn)CATH-B1蛋白在法氏囊的上皮細(xì)胞中表達(dá)，值得一提的是，此上皮細(xì)胞是病原入侵粘膜淋巴組織的主要靶標(biāo)，說明CATH-B1在法氏囊抵御病原入侵中起到了重要作用。但是，目前并未檢測其他組織是否有CATH-B1蛋白的表達(dá)，因此它的表達(dá)分布還需進(jìn)一步的研究。

雞CATHs基因在機(jī)體中的表達(dá)更為廣泛，主要是在皮膚、呼吸道、胃腸道和淋巴器官中表達(dá)[23]。與蛋白表達(dá)類似，CATH-1、CATH-2、CATH-3的mRNA在骨髓細(xì)胞中大量表達(dá)，而CATH-B1 mRNA在法氏囊中大量表達(dá)[10]。有趣的是，CATH-2 mRNA也在(禽尾部)油脂腺中表達(dá)，脂腺分泌物中含有抗菌物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)可以轉(zhuǎn)移到皮膚并防止感染[24]。此外，4種CATHs mRNA在胚胎時(shí)期就開始表達(dá)[25-26]，之后在發(fā)育成熟的早期，在肺臟、法氏囊、腸道等不同組織中表達(dá)量逐步上調(diào)[23]，說明抗菌肽在體內(nèi)的廣泛分布對抵抗病原體的入侵起著重要作用。

雞CATHs表達(dá)受體內(nèi)外炎性或微生物刺激等多種因素的影響。VAN DIJK等[20]在感染腸炎沙門菌8 h后肉雞空腸的異嗜性細(xì)胞中觀察到大量的CATH-2。與沙門菌感染相反，空腸彎曲菌感染不會(huì)誘導(dǎo)募集異嗜性細(xì)胞到小腸，并且小腸中的CATH-2 mRNA表達(dá)在感染48 h后下調(diào)[27]?？漳c彎曲菌也會(huì)下調(diào)CATH-1和CATH-3 mRNA表達(dá)，但是并不影響CATH-B1 mRNA表達(dá)[28]。PENG等[18]最新的研究發(fā)現(xiàn)，禽致病性大腸桿菌(APEC)感染巨噬細(xì)胞(HD11和原代單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞)可誘導(dǎo)CATH-B1 mRNA表達(dá)。這些研究結(jié)果表明，不同的病原感染可誘導(dǎo)不同種類抗菌肽的表達(dá)，抗菌肽的表達(dá)有助于宿主抵御病原的感染，但是抑制抗菌肽的表達(dá)可能也是病原逃逸宿主清除的機(jī)制之一。

維生素D和短鏈脂肪酸可誘導(dǎo)不同細(xì)胞表達(dá)LL-37，近期研究結(jié)果表明，它們也可誘導(dǎo)雞CATHs的表達(dá)。RODRIGUEZ等[29]發(fā)現(xiàn)飼喂維生素D可增加雞脾臟CATH-1和CATH-B1的表達(dá)水平。SUNKARA等[30]發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸(丁酸鹽)在巨噬細(xì)胞HD11中誘導(dǎo)CATH-B1的表達(dá)，口服丁酸鹽可誘導(dǎo)雞空腸和盲腸外植體CATH-B1的表達(dá)，而且經(jīng)丁酸鹽處理后的巨噬細(xì)胞具有更好的抗菌能力。人源CATHs被維生素D和短鏈脂肪酸誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，目前誘導(dǎo)其它動(dòng)物源CATHs表達(dá)的機(jī)制并不清楚，這也是雞源CATHs研究的空白之一，但是尋找高效誘導(dǎo)CATHs表達(dá)的化合物是宿主抵御病原侵入的有效途徑之一，也是減少或替代抗生素使用的有效途徑之一。

3 雞源CATHs的抗微生物活性

抗菌活性是抗菌肽最經(jīng)典的功能之一(圖1)，CATH-1、CATH-2、CATH-3均具有廣譜的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌、肺炎球菌、綠膿桿菌以及一些耐藥菌株等均具有良好的抗菌作用，其最小抑菌濃度(MIC)可低至0.4 μmol/L[9,12]。CATH-B1與其他3種抗菌肽相比，其抗菌譜較窄，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有效，當(dāng)被測試的菌液濃度低至2×103CFU時(shí)，其MIC的范圍是0.63～2.5 μmol/L[10]，但是當(dāng)菌液濃度提高至5×105CFU時(shí)，CATH-B1的MIC增加至12.5 μmol/L[31]。值得一提的是，大多數(shù)抗菌肽在生理環(huán)境中的抗菌活性降低，已成為抗菌肽應(yīng)用的一大難題。VELDHUIZEN等[32]研究表明血清對CATH-1、CATH-2、CATH-3的抗菌活性并無太大影響，并且不會(huì)引起多重耐藥菌的耐藥性。除了在體外具有抗菌作用，抗菌肽在體內(nèi)也具有抗感染活性。CUPERUS等[33]發(fā)現(xiàn)CATH-2對感染APEC的小雞具有明顯的保護(hù)作用，通過減少肺組織中的細(xì)菌感染量，最終降低了動(dòng)物的死亡率。這些研究結(jié)果表明，雞源CATHs具有被研制成為新型抗菌藥物的潛力。

圖1 雞源CATHs的生物活性總結(jié)圖

雞源CATHs除了具有抗浮游菌活性外，MOLHOEK等[34]和CHEN等[35]研究表明CATH-2也可以抑制細(xì)菌生物被膜的形成。ORDONEZ等[36]報(bào)道CATH-2具有抗真菌活性，并且能在5 min內(nèi)快速滲透進(jìn)真菌細(xì)胞膜內(nèi)。它們的抗菌機(jī)理主要是作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，通過細(xì)菌細(xì)胞膜滲透進(jìn)菌體內(nèi)從而殺死細(xì)菌。有趣的是，SCHNEIDER等[37]發(fā)現(xiàn)CATH-2在低于MIC濃度下依然能滲透進(jìn)菌體內(nèi)阻礙細(xì)菌DNA和核糖體的合成，此外還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌外膜囊泡的釋放，這些由抗菌肽誘導(dǎo)形成的外膜囊泡為疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

除了具有抗菌活性，雞源CATHs在近期首次被報(bào)道具有抗病毒活性。PENG等[19]發(fā)現(xiàn)4種CATHs在體外均具有一定的抗流感病毒(IAV)活性，其中CATH-B1具有最好的抗病毒活性，主要通過干擾病毒表面蛋白血凝素活性從而抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合，最終阻止病毒的入侵。由于CATH-B1蛋白在機(jī)體分布位置的特殊性，推測CATH-B1在法氏囊內(nèi)具有特殊的抗病毒功能，例如抑制傳染性法氏囊病毒(IBDV)的復(fù)制，但是此活性還需進(jìn)一步的研究。

4 雞源CATHs的免疫調(diào)節(jié)活性

人源CATH(LL-37)的免疫調(diào)節(jié)功能已經(jīng)被廣泛研究。LL-37可以抑制LPS誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移分化和調(diào)控Toll樣受體(TLRs)的激活。LL-37可以直接作用于類甲酰肽受體(FPRL1)誘導(dǎo)細(xì)胞的趨化，也可以作用于P2X7受體誘導(dǎo)炎癥小體的激活。近期文獻(xiàn)報(bào)道，LL-37通過誘導(dǎo)溶酶體釋放組織蛋白酶B(cathepsin B)從而激活NLRP3炎癥小體，最終導(dǎo)致IL-1β和IL-18的釋放[38]。

雞源CATHs與LL-37具有一些相似的功能活性(圖1)。4種雞源CATHs 都可以與LPS/LTA結(jié)合，抑制TNF-α、IL-1β、IL-8 和IL-6等炎性因子的產(chǎn)生[12,15,17-18,31]。BOMMINENI等[15]研究表明CATH-1在體外能直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，增強(qiáng)細(xì)胞因子、細(xì)胞標(biāo)志物CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)。KRAAIJ等[39-40]研究發(fā)現(xiàn)，CATH-2也可以增加巨噬細(xì)胞表面的CD86、MHC-Ⅱ、MRC1、CD40等抗原遞逞受體的表達(dá)，也可以影響T和B細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)。CATH-2也可以直接刺激細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，CATH-B1可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬能力[18]。這些研究表明抗菌肽對先天和后天免疫均具有重要作用，而且可能通過作用于細(xì)胞內(nèi)的受體從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

在4種雞源CATHs免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制的研究中，CATH-2的研究最為廣泛。COORENS等[41-42]研究表明，CATH-2可以通過與病原的相互作用抑制TLR2和TLR4的活化，還可以與DNA結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞對DNA的吞噬，從而增強(qiáng)DNA介導(dǎo)的TLR9的激活，但是目前尚不清楚與CATH-2直接作用的胞內(nèi)具體受體分子。以后的研究可以通過單細(xì)胞測序的技術(shù)篩選出CATH-2在胞內(nèi)的靶向受體分子，為抗菌肽作為免疫調(diào)節(jié)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

5 雞源CATHs應(yīng)用前景分析

由于CATHs家族抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，最初的研究都專注于開發(fā)抗菌肽成為新型抗菌藥物，但是近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽對于機(jī)體的免疫起著至關(guān)重要的作用。目前，雞源CATHs被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、增強(qiáng)抗原呈遞及吞噬活性、正向調(diào)控獲得性免疫等功能(圖1)。因此，在針對各種臨床感染疾病的藥物研發(fā)背景下，開發(fā)抗菌肽作為抗感染及免疫調(diào)節(jié)藥物緩解慢性疾病誘導(dǎo)的炎癥等具有良好的前景。最近，CATHs的外源性給藥已被用于多種動(dòng)物感染模型，例如，LL-37能保護(hù)小鼠免受銅綠假單胞菌、流感病毒的感染[43]，卵內(nèi)注射 CATH-2 可保護(hù)雞呼吸道抵御大腸桿菌感染[33]。除此之外，PENG等[44]最新的研究表明，豬源抗菌肽與IL-4/6聯(lián)合形成的殼聚糖納米顆粒增強(qiáng)了小鼠的免疫保護(hù)作用。這些研究都說明抗菌肽具有開發(fā)成為抗感染藥物的巨大潛力，為獸醫(yī)臨床實(shí)現(xiàn)“減抗、替抗、協(xié)抗”提供科學(xué)的理論依據(jù)。值得注意的是，目前已有少數(shù)的抗菌肽處于臨床測試中，例如LL-37用于臨床治療下肢靜脈潰瘍[43]，這些測試為抗菌肽應(yīng)用于獸醫(yī)臨床提供了參考依據(jù)。

不可避免地，CATHs抗菌肽的臨床應(yīng)用依然面臨在體內(nèi)易降解、制劑難成形、合成成本高等挑戰(zhàn)。但是隨著抗菌肽的廣泛研究，可以通過合成D型氨基酸肽、乙酰化或酰胺化修飾肽鏈、有針對性的替代非必須氨基酸等方法增加抗菌肽的穩(wěn)定性[45]。CUPERUS等[33]通過合成D型CATH-2提高了抗菌肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而使其高效地發(fā)揮抗菌活性。也可以利用材料工程技術(shù)和體內(nèi)追蹤技術(shù)，建立把抗菌肽包裹在可降解高分子材料中心的制備方法，通過調(diào)節(jié)載體材料的親水疏水性及分子量，調(diào)控抗菌肽的釋放時(shí)間，有效的解決抗菌肽在體內(nèi)易降解及作用時(shí)間短的難題，提高抗菌肽在體內(nèi)的利用效率。PENG等[46]通過使用納米粒子材料靶向運(yùn)輸抗菌肽或減緩抗菌肽在體內(nèi)的釋放，從而提高抗菌肽抗菌能力。還可以通過篩選出促進(jìn)抗菌肽表達(dá)的化合物，基于這些化合物的飼料添加劑可以有效地刺激抗菌肽表達(dá)從而提高動(dòng)物的免疫保護(hù)作用，最終相對降低抗菌肽的合成成本[29]。雖然雞源CATHs的應(yīng)用還處于初級階段，但是其功能研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，雞源CATHs廣譜高效的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性已經(jīng)在獸醫(yī)領(lǐng)域展示了一定的應(yīng)用前景。此外，近年來材料學(xué)科的迅速發(fā)展，不同學(xué)科之間的交叉融合，也將為抗菌肽的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。