迎春花輪斑病病原物鑒定及其致病力分析

王樂(lè)怡 王子碩 卓濤

關(guān)鍵詞：迎春花;輪斑病;尾孢屬;致病力;發(fā)病率

迎春花（Jasm in u m n u difloru m ） 又名金梅、清明花、黃素馨，系木犀科落葉灌木，與梅花、水仙和山茶花統(tǒng)稱(chēng)為“雪中四友”，是中國(guó)名貴花卉之一，具有極高的觀(guān)賞價(jià)值和藥用價(jià)值，在中國(guó)廣泛種植。福建省地處亞熱帶，是迎春花的主要生長(zhǎng)地之一。目前迎春花常見(jiàn)的病害有斑點(diǎn)病、花葉病、褐斑病、灰霉病等，但關(guān)于這些病害的病原物鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道較少。已有的關(guān)于迎春花病害的分離鑒定大多利用分子生物學(xué)方法分析其rDNA相關(guān)基因序列的方法，如2021 年報(bào)道的一種由Phlebiopsis crassa 引起的迎春花葉枯病，此病原物的鑒定是通過(guò)對(duì)致病菌形態(tài)特征的觀(guān)察和rDNA-ITS、nLSU 基因序列的分析確定得出的[1]。

2022 年3 月2 日，在福建農(nóng)林大學(xué)校園西北區(qū)域以及西區(qū)大田均發(fā)現(xiàn)了不同于常見(jiàn)迎春花病害癥狀的迎春花病株，共64 棵，其癥狀不同于常見(jiàn)的迎春花枯葉癥的病害，初期癥狀類(lèi)似于褐斑病或者斑點(diǎn)病，而后呈現(xiàn)輪斑癥狀。為此，本研究利用柯赫氏法則對(duì)福建農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)的感病迎春花進(jìn)行病原菌鑒定，并對(duì)病原菌致病力進(jìn)行評(píng)估，以期為迎春花病害擴(kuò)充知識(shí)庫(kù)。

一、材料與方法

（一） 材料

病株采集于2022 年3 月2 日福建農(nóng)林大學(xué)校園西北區(qū)域以及西區(qū)大田迎春花病株，利用剪刀剪取病健交界處葉片并浸泡于75%的乙醇溶液中3s，接著用1.3%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行沖洗消毒處理，之后用無(wú)菌水沖洗5 次。以福建農(nóng)林大學(xué)校內(nèi)距離病株以外的健康植株為對(duì)照。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA） 作培養(yǎng)基對(duì)病原物進(jìn)行組織培養(yǎng)。

（二） 試驗(yàn)方法

1、癥狀觀(guān)察。對(duì)發(fā)病的植株進(jìn)行癥狀觀(guān)察并進(jìn)行拍照采集標(biāo)本，選取典型的病葉進(jìn)行徒手切片并制成玻片，觀(guān)察病原物的特征并進(jìn)行鑒定。依據(jù)感病植株感病的嚴(yán)重程度，即葉片表面病斑的大小形態(tài)學(xué)方法對(duì)感病的植株進(jìn)行分級(jí)、分組。

2、病情鑒定。選取典型的病葉進(jìn)行徒手切片并制成玻片，觀(guān)察病原物的特征并進(jìn)行鑒定。利用公式（1） 計(jì)算發(fā)病率[2]，利用公式（2） 計(jì)算發(fā)病指數(shù)[3]。

3、病原體的分離、培養(yǎng)、純化。將處理過(guò)的葉片放入制作好的PDA 培養(yǎng)基中，用保鮮膜封口保存，在室溫下培養(yǎng)3d 后對(duì)分離的病原物進(jìn)行純化。切取菌落邊緣的菌絲約2×2m m 至新的PDA 平板培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，仍用保鮮膜封閉保存以防菌種污染，將其倒放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6d 后對(duì)純化后的病原物進(jìn)行鏡檢觀(guān)察，根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，查找相關(guān)資料，確認(rèn)病原菌。

4、病原菌接種。將培養(yǎng)出的病原菌接種于健康迎春花植株上，用涂抹法、針刺法進(jìn)行病原菌的接種[4]。取迎春花健康植株枝條，插在錐形瓶?jī)?nèi)水中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為兩組同時(shí)進(jìn)行：一組為新葉接種，另一組為老葉接種，比較病原菌對(duì)新葉或老葉的致病力。每一組實(shí)驗(yàn)處理方式為：a.以迎春花枝條為對(duì)稱(chēng)中心，取右邊的葉片用菌餅貼附法，即挑取一小塊菌絲直接貼附于葉片表面，用錫紙包扎;b.左邊的葉片用針刺法（即用挑針輕輕扎傷），再挑取一小塊菌絲貼在傷口處，用錫紙包扎。在未染病植株所有健康葉片上重復(fù)以上操作。然后用保鮮膜套住錐形瓶，并用橡皮筋扎好，濕度達(dá)到95%以上。24h后把錫紙取掉，觀(guān)察植株的發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行觀(guān)察、記錄、拍照。

（三） 病情分級(jí)

根據(jù)植物葉片的病斑面積占葉片總面積的百分比將植物葉片從健康葉到嚴(yán)重染病分為5 個(gè)等級(jí)，以此來(lái)區(qū)分植物葉片的染病程度，其分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

二、結(jié)果與分析

（一） 癥狀觀(guān)察

葉片受害后初期為褐色圓形小病斑，擴(kuò)大后呈輪紋狀病斑;病菌若從葉尖或葉緣侵入，呈現(xiàn)輪紋狀，病斑多時(shí)連成大斑塊（圖1d 和e）;病斑無(wú)明顯邊界或具有淡紫色暈圈，稍?xún)?nèi)層是褐色圓圈，中央變灰白（圖1e）;氣候溫暖不過(guò)分炎熱且潮濕時(shí)，有小黑點(diǎn)產(chǎn)生。

（二） 發(fā)病率與致病力測(cè)定

共調(diào)查了200 片葉子，其中有170 片葉子表現(xiàn)出癥狀，根據(jù)公式1 得到以下計(jì)算結(jié)果：

R （%） = （170×100） /200=85%即在被調(diào)查的迎春花植株中，感染目的病原物的概率為85%。

病情指數(shù)作為評(píng)測(cè)病原物致病力的另一個(gè)重要指標(biāo)，本試驗(yàn)不同染病等級(jí)各級(jí)（0≦L≦4） 的葉片數(shù)量見(jiàn)表2。根據(jù)公式2 計(jì)算病情指數(shù)，結(jié)果如下。

I=（0×30+1×36+2×51+3×49+4×34）×100（/ 200×4）=52.625表明該病原體在迎春花中的平均致病率約為52.625%。

（三） 病原物鑒定

通過(guò)切片觀(guān)察，迎春花葉片病部的小黑點(diǎn)是分生孢子座，部分為埋生，其余部分為表生;分生孢子梗褐色至橄欖褐色，全壁芽生合軸式產(chǎn)孢，呈屈膝狀，孢痕明顯;分生孢子為多細(xì)胞，線(xiàn)形、針形、倒棒形、鞭形或蠕蟲(chóng)形，無(wú)色或淡灰色，基部臍點(diǎn)黑色，加厚明顯。經(jīng)文獻(xiàn)查詢(xún)[5]，該病原菌的形態(tài)特征與尾孢屬的特征一致。此外，根據(jù)柯赫氏法則（Koch’s Rule），實(shí)驗(yàn)在L=0 的葉片中無(wú)法分離出病原物，在L>0 （L=1，2，3，4） 的葉片中均可以分離出相同的病原物，且此種病原物被從寄主體內(nèi)分離純化培養(yǎng)后可以復(fù)染L=0 的葉片使其葉片的等級(jí)變?yōu)長(zhǎng)>0 （即染病葉片）。在復(fù)染葉片中分離純化到該病原菌。因此，經(jīng)切片觀(guān)察及柯赫氏法則驗(yàn)證，迎春花輪斑病病原物屬于尾孢屬（Cercospora）的真菌。

（四） 侵入途徑鑒定

為確定尾孢屬侵入迎春花的方式，PDA 培養(yǎng)基處理作為對(duì)照，以排除培養(yǎng)基對(duì)迎春花葉片的影響。結(jié)果表明，在接種菌餅3d 后用針刺的葉片都出現(xiàn)了一個(gè)小病斑，相比較于新葉（圖2a），老葉的病斑會(huì)比較明顯（圖2b），而直接接菌餅的葉片上無(wú)病狀;PDA 培養(yǎng)基的對(duì)照組也無(wú)任何現(xiàn)象，因此排除PDA 培養(yǎng)基藥害的影響。當(dāng)迎春花枝條繼續(xù)培養(yǎng)下去時(shí)，針刺葉片的病斑越來(lái)越明顯并且呈現(xiàn)輪紋狀的病斑（圖2c 和d），與在校園里發(fā)現(xiàn)的染病迎春花植株癥狀一致，而直接接菌餅的葉片仍未觀(guān)察到任何異常。

綜上可得，該尾孢屬真菌主要從傷口侵入，而且對(duì)新葉和老葉均能侵染;從病害癥狀發(fā)展來(lái)看，對(duì)老葉的致病力更強(qiáng)。

三、討論

在本研究中，用PDA 培養(yǎng)基對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及純化，僅得到白色的菌絲體，且將純化出的菌絲在PDA 上放置于26℃～28℃培養(yǎng)箱中，12h光照12h黑暗交替培養(yǎng)，均觀(guān)察到產(chǎn)包孢。但是用純化培養(yǎng)的病原物接種健康的迎春花葉片，可以觀(guān)察到與校園中染病迎春花一樣的癥狀;且在此人工接種并發(fā)病的迎春花葉片病部能觀(guān)察到埋生或表生的小黑點(diǎn)。顯微觀(guān)察病原物切片照片，其病原物形態(tài)特征與尾孢屬或假尾孢屬真菌相似。由于其分生孢子座基部疤痕明顯而非錐形平截，通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)尾孢屬和假尾孢屬真菌的特征描述比較，確定該迎春花輪斑病病原物屬于尾孢屬（Cercospora）真菌，而非假尾孢屬。目前，這是有關(guān)尾孢屬病原真菌對(duì)迎春花致病的首次報(bào)道。但是，對(duì)于該真菌屬于尾孢屬以下的分類(lèi)地位還未明確，因此，在之后的研究工作中，可以提取分離培養(yǎng)的病原菌的基因組，擴(kuò)增rDNA-ITS序列，測(cè)序并在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，從而確定其精確的分類(lèi)地位。

尾孢屬真菌以菌絲體和分生孢子在病殘?bào)w中越冬，成為翌年初侵染源;大量的分生孢子經(jīng)風(fēng)雨傳播，從傷口間接侵入，為害寄主[6];尾孢屬感染寄主后有一定的潛育期，經(jīng)分生孢子多次再侵染，病原菌大量積累，遇有適宜條件即流行[7]。福建福州地處我國(guó)東南沿海，屬亞熱帶地區(qū)屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，春夏兩季環(huán)境條件適合尾孢屬真菌生長(zhǎng)繁殖，因此在這兩季，校園內(nèi)該迎春花病害多發(fā)。

迎春花病害的藥劑防治。發(fā)病初期，可噴灑0.5%波爾多液，或65%代森鋅600 倍液，每隔7～10d1 次，連續(xù)3～4次，可以控制病情[8]。此外，有文獻(xiàn)表明，噴施納米TiO2 光半導(dǎo)體溶膠材料可以緩解植物病害[9];利用短波UV 對(duì)植物進(jìn)行照射可以降低病情指數(shù)[10]。

結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)福建農(nóng)林大學(xué)內(nèi)迎春花病株的采樣、標(biāo)記、統(tǒng)計(jì)分析、培養(yǎng)鑒定，可知其發(fā)病率85%，病情指數(shù)52.625，表明校園內(nèi)迎春花發(fā)病率高，但是大部分植株的病情不太嚴(yán)重，病害極度嚴(yán)重的較少。引起該病害的病原物屬于尾孢屬（Cercospora） 真菌，這是首例報(bào)道尾孢屬感染迎春花致其產(chǎn)生輪斑癥狀的病例，為迎春花的保護(hù)提供依據(jù)。