馬尾松MAPK級聯(lián)途徑應(yīng)答信號物質(zhì)基因的表達分析

陳虎 楊章旗 孫爽 李鵬 徐慧蘭

（1. 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)和草原局馬尾松工程技術(shù)研究中心 廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，南寧530002；2. 廣西師范大學(xué)，桂林541001）

植物為抵御自然界的非生物脅迫，進化出響應(yīng)脅迫信號的復(fù)雜調(diào)節(jié)機制。植物從感知到作出響應(yīng)，進化出生理、生化、代謝互相作用的復(fù)雜調(diào)控機制以適應(yīng)和抵御非生物脅迫，蛋白磷酸化和去磷酸化途徑發(fā)揮了關(guān)鍵作用［1］。植物中主要蛋白激酶包括蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），依賴Ca2+不依賴CaM蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDPK），同時依賴Ca2+和CaM蛋白激 酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaMK）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）。其中，MAPK的磷酸化通過絲氨酸/蘇氨酸殘基激活參與了細胞內(nèi)信號傳遞，在生物體內(nèi)普遍存在［1-3］。MAPK級聯(lián)途徑按照順序組成典型的MAPKKK（MAP-3K）-MAPKK（MAP2K）-MAPK 級聯(lián)信號途徑發(fā)揮功能，部分MAPK 級聯(lián)系統(tǒng)上游還存在MAPKKKK （MAP4K）［4］。

MAPKs蛋白是一種酸性蛋白，大量實驗證實ABA（abscisic acid）、SA（salicylic acid）、ET（ethy- lene）、IAA（auxin）等植物激素能夠引起MAPKs 活性提高，MAPKs 通過調(diào)節(jié)蛋白磷酸化產(chǎn)生現(xiàn)有的生理反應(yīng)，不同激素信號在不同的級聯(lián)反應(yīng)中起作用，通過蛋白激酶或蛋白磷酸化調(diào)節(jié)信號分子活性，并級聯(lián)放大后與轉(zhuǎn)錄因子作用響應(yīng)脅迫［4-6］。目前，擬南芥中發(fā)現(xiàn)20 個MAPK 基因、10 個MAP3K 基因、60 個MAP2K 基因，水稻中有13 個MAP2K 基因和17 個MAPK 基因，這些基因在脅迫、JA（jasmonic acid）誘導(dǎo)發(fā)育、防御反應(yīng)中發(fā)揮著不同的功能［7-8］。如MKK3 參與調(diào)控植物MKKs 由細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)運，且依賴JA 信號途徑進行防御響應(yīng)［9］，MPK3/6 和MdRaf5 過量表達可提高擬南芥抗凍和抗旱 能力［6］。

馬尾松（Pinus massoniana）是我國南部重要用材樹種，也是松脂主要來源樹種，是林業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一［10］。極端天氣和病蟲害使馬尾松林受到嚴重影響，雖然目前有關(guān)馬尾松響應(yīng)非生物脅迫生理和分子有一定研究［11］，但MAPK 級聯(lián)途徑基因調(diào)控信號分子響應(yīng)馬尾松非生物脅迫機理還不清楚。本研究以前期大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選相關(guān)MAPK 級聯(lián)途徑基因，并對其進行生物信息學(xué)分析、功能預(yù)測和信號物質(zhì)處理下基因表達模式研究，為解析馬尾松響應(yīng)非生物脅迫調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 選用長勢良好、高度一致、未受蟲害、無機械損傷健康馬尾松半年生全同胞幼苗作為實驗材料。苗木培育及處理在廣西馬尾松良種培育中心（廣西南寧，108°35′E，22°92′N）進行。

1.1.2 材料處理 根據(jù)課題組前期開展外源信號物質(zhì)對馬尾松幼苗松針揮發(fā)物的影響獲得的試驗結(jié)果（試驗結(jié)果另外發(fā)表），采用75 mg/L ABA，75 mg/L ABA +100 mg/L CaCl2、50 mg/L SA、50 mg/L SA+100 mg/L CaCl2、100 mg/L MeJA（methyl jasmonate）、100 mg/L MeJA +100 mg/L CaCl2、150 mg/L GA（gibberellin）、150 mg/L GA+100 mg/L CaCl2、100 mg/L CaCl2溶液，溶于50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 8.0，以蒸餾水處理為對照處理。使用前加入1% tween-20，將溶液均勻噴施在馬尾松幼苗，每天噴施1 次，每處理噴施200 mL，每處理苗木6株，連續(xù)處理5 d，分別在停止噴施第1、3、5天將6株同一部位成熟針葉進行等量混合采集，立即放入液氮保存?zhèn)溆?。ABA、SA、MeJA、GA由Sigma-Aldrich 生產(chǎn)，純度＞95%。

1.2 方法

1.2.1 基因序列獲得 本研究篩選確定的7個MAPK級聯(lián)途徑基因cDNA序列來源于課題組前期馬尾松抗蟲［12］、側(cè)枝發(fā)育［13］及逆境脅迫（干旱、低溫、鉛脅迫）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以差異基因中NCBI對基因的表述進行檢索，去除重復(fù)序列和非全長cDNA序列，最終獲得7個MAPK級聯(lián)途徑基因，包括MAPK基因4個，MAP2K、MAP3K、MAP4K基因各1個（表1）。

1.2.2 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄 RNA采用天根公司的多酚多糖植物RNA試劑盒提取，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟按說明書進行，RNA提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄完成后分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外分光光度計檢測濃度，將所有cDNA濃度稀釋至50 μg/μL。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 BioXM2.6預(yù)測基因氨基酸序列；Expasy（https://www.expasy.org/）分析基因亞細胞定位、等電點、蛋白分子量、二級結(jié)構(gòu)等，在NCBI檢 索 同 源 序 列，Geneious（https://www.geneious. com/）軟件進行進化樹聚類，NCBI、Motif Scan 軟件進行功能結(jié)構(gòu)域分析，string（https://stringdb.org/cgi） 和QuickGO（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）進行蛋白互作和基因功能預(yù)測，KEGG（https://www.kegg.jp/）和T-Coffee進行代謝途徑分析和氨基酸序列比對。

1.2.4 基因表達分析 用primer 5軟件設(shè)計熒光定量引物，以PmCYP基因［14］作為內(nèi)參（表1）。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq II（Prefect real-time）試劑盒說明書進行熒光定量PCR體系構(gòu)建和擴增程序（Light Cycle 480II PCR儀），進行3次技術(shù)重復(fù)，根據(jù)2-ΔΔCt法計算相對表達量，用Excel進行作圖，SPSS軟件進行方差分析。

表1 熒光定量所用基因引物Table 1 Primer used in the qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 基因生物信息學(xué)分析

在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，篩選并鑒定出PmMAP4K、PmMAP3K、PmMAP2K基 因 各1個，PmMAPK2、PmMAPK6、PmMAPK9、PmMAPK15等MAPK基因4個。分析表明，7個基因核酸序列開放閱讀框長度在1 014-2 748 bp，氨基酸序列在337-915 aa，分子量在37.62-100.62 kD，等電點在5.12-9.22，PmMAPK9、PmMAPK15、PmMAP2K等電點偏堿性；7個基因均無跨膜結(jié)構(gòu)，亞細胞預(yù)測均在細胞核內(nèi)；都存在Ser、Thr、Tyr磷酸化位點，以PmMAP4K磷酸化位點最多，其次是PmMAP3K，PmMAP2K最少（表2）。

表2 MAPKs蛋白生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of MAPKs protein in P. massoniana

基因結(jié)構(gòu)域分析表明，MAPK的4個基因均含有其特有的MAPK結(jié)構(gòu)域，PmMAP4K、PmMAP3K、PmMAP2K基因則含有其特有的PmMAP4K（299-544 aa）、PmMAP3K（40-303 aa）、PmMAP2K（56-323 aa）結(jié)構(gòu)域，7個基因均含有SPS1和PknB兩個結(jié)構(gòu)域，PmMAPK15和PmMAP2K基因還單獨含有BREX-PgiW結(jié)構(gòu)域（表3）。

表3 MAPKs蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析 Table 3 Analysis functional domain of MAPKs protein in P. massoniana

2.2 聚類分析

將MAPK途徑7個基因與火炬松（Pinus taeˉ da）、北美云杉（Picea sitchensis）等林木和植物進行氨基酸序列對比并構(gòu)建進化樹。結(jié)果（圖1）表明，所有基因未按樹種進行分組，是按基因類型進行分類，馬尾松與火炬松和北美云杉距離最近。MAPKs基因聚在1組，PmMAP2K和PmMAP4K聚在1組，PmMAPK3K基因單獨1組。7個基因典型催化氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，4類基因均含有D（I/L/V）K的活性基序，4個MAPKs基因均含有T（E/D）YVxTRWRAPE（L/V）基 序，PmMAPK2和PmMAPK6含有TEY基序，屬于MAPK家族A類，而PmMAPK9和PmMAPK15含有TDY基序，屬于MAPK家族D類。PmMAP2K含有典型VGTxxYMSPER基序，以及S/T-X5-S/T保守序列。PmMAP3K含 有G（T/S）Px（W/Y/F）MAPEV和GTxx（W/Y）MAPE基序，不含GTPEFMAPE（L/V）和Raf-like結(jié)構(gòu)域，屬于MEKK-like亞類。PmMAP4K含有保守TFVGTPxWMAPEV基序（圖2）。

圖1 馬尾松與其他物種MAPK途徑基因進化樹分析Fig.1 Phylogenetic relationship of P. massoniana and other plants MAPK genes

圖2 馬尾松MAPKs基因氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of MAPKs in P. massoniana

2.3 功能預(yù)測

馬尾松與擬南芥MAPK同源蛋白進行互作網(wǎng)絡(luò)分析，7個基因均成功與擬南芥匹配，PmMAP4K、PmMAP3K、PmMAP2K、PmMAPK2、PmMAPK6、PmMAPK9、PmMAPK15分 別 對 應(yīng) 擬 南 芥SIK1、NP3、MKK9、MPK9、MPK6、MPK4、MPK16。一級 互作網(wǎng)絡(luò)MAPKs和MAP2K基因直接互作（圖3- A），二級互作中MAP3K在MAPK代謝途徑中也直接互作（圖3-B），三級互作中除MAPK代謝途徑內(nèi)部互作外與WRKY家族基因開始互作（圖3-C）。

在 互 作 網(wǎng) 絡(luò) 中，MPK4（PmMAPK2）/ MPK6（PmMAPK6）是調(diào)節(jié)生物和非生物脅迫應(yīng)答基因表達的信號通路，介導(dǎo)ABA 依賴的CAT1表達對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。NP3（PmMAP3K）和MPK4（PmMAPK2）通過調(diào)節(jié)MAP65-1等微管相關(guān)蛋白磷酸化狀態(tài)參與皮質(zhì)微管組織和穩(wěn)定，參與根毛發(fā)育，獲得抵抗SAR和SA負調(diào)節(jié)介導(dǎo)的防御反應(yīng)。MPK6（PmMAPK6）通過磷酸化WKRY，介導(dǎo)乙烯ACS2和ACS6響應(yīng)脅迫。MPK4（PmMAPK2）與PTP1互作，抑制SA生物合成來調(diào)節(jié)生物防御反應(yīng)，MKS1和MPK6（PmMAPK6）與WKRY相互作用。MKK9（PmMAP2K）與MPK6（PmMAPK6）互作調(diào)控乙烯生物合成響應(yīng)鹽脅迫。MPK9（PmMAPK6）參與ABA 信號途徑。SIK1（PmMAPK4K）未與其他基因直接互作，從PmMAP4K單獨互作圖顯示（圖3-D），與5個酪蛋白激酶（casein kinase1-like protein），以酸性蛋白作為底物進行磷酸化，SQN為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶基因與HSPs類蛋白調(diào)控，RAPTOR1調(diào)控滲透脅迫。

圖3 馬尾松與擬南芥相關(guān)MAPKs基因互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 3 Interaction network analysis of MAPKs proteins identified in P. massoniana and Arabidopsis

通過GO和KEGG預(yù)測基因功能，PmMAPK、PmMAP3K、PmMAP4K可以激活絲氨酸和色氨酸，PmMAP2K還可以激活絡(luò)氨酸，第二步活性和磷酸化行使功能，最后行使分子功能。MAPK信號途徑中，整個過程是磷酸化過程，在經(jīng)典MAP激酶途徑鈣離子化到PPP3C，再磷酸化到NFAT-2基因行使功能。

2.4 基因表達分析

通過熒光定量PCR技術(shù)，對馬尾松7個基因在MeJA、GA、SA、ABA以及相應(yīng)加Ca2+處理下的表達模式進行研究。結(jié)果（圖4）表明，MeJA、Ca2+處 理，PmMAP4K對Ca2+處理響應(yīng)最為明顯，處理第1天和第5天表達量最高，MeJA處理對PmMAP4K表達量沒有影響，說明PmMAP4K不受MeJA調(diào)控，而MeJA+Ca2+處理導(dǎo)致PmMAP4K表達量低于對照，說明MeJA+Ca2+負調(diào)控PmMAP4K。MAPK6表現(xiàn)出對Ca2+的響應(yīng)，其它基因在Ca2+處理與對照相比，為下調(diào)表達。在MeJA處理第1天和第3天除PmMAPK9和PmMAP4K表達量下調(diào)，其它基因表達量均高于對照，而在MeJA+Ca2+處理第5 天除PmMAP4K外，均表現(xiàn)顯著上調(diào)表達（P＜0.05）。

圖4 馬尾松MAPK級聯(lián)途徑基因在MeJA處理下表達模式Fig. 4 Expressions of MAPKs genes in response to MeJA treatments in P. massoniana

在GA和Ca2+處理下，PmMAP4K對處理表達量最高，在處理第5天時GA處理PmMAP4K表達量達到最高值，而GA+Ca2+處理PmMAP4K表達量顯著低于其它處理?？傮w上Ca2+處理沒有引起基因上調(diào)表達，反而表達量下降，GA處理使基因表達量上調(diào)，尤其是在處理第5天，GA+Ca2+處理與GA處理表達量下降，但總體高于對照（圖5）。

圖5 馬尾松MAPK級聯(lián)途徑基因在GA處理下表達模式Fig. 5 Expressions of MAPKs genes in response to GA treatments in P. massoniana

在ABA和Ca2+處理下，Ca2+處理誘導(dǎo)了PmMAP4K和PmMAPK6基因上調(diào)表達，其它基因則下調(diào)表達。ABA處理7個基因均上調(diào)表達，除PmMAPK6基因外，其它基因表達量達到最大值，而Pm-MAPK6基因則是在ABA+Ca2+處理下，表達量最高（圖6）。

圖6 馬尾松MAPK級聯(lián)途徑基因在ABA處理下表達模式Fig. 6 Expressions of MAPK genes in response to ABA treatments in P. massoniana

在SA和Ca2+處理下，Ca2+處理同樣誘導(dǎo)了PmMAP4K和PmMAPK6基因上調(diào)表達，其它基因則下調(diào)表達。在整個處理過程中，SA和SA+Ca2+處理7個基因均表現(xiàn)上調(diào)表達，但SA+Ca2+處理基因表達量總體低于SA處理，而高于對照和Ca2+處理（圖7）。

圖7 馬尾松MAPK級聯(lián)途徑基因在SA處理下表達模式Fig. 7 Expressions of MAPKs genes in response to SA treatments in P. massoniana

3 討論

通過生物信息學(xué)、同源序列、進化聚類分析對7個馬尾松MAPK基因進行分析。進一步確定了7個基因所屬成員，4個MAPK基因均含有MAPK基因特有的TxY基序，該基序是決定MAPK活性的關(guān)鍵［15］，并根據(jù)TEY和TDY分為2類。D（I/L/V）K活性部位基序在4類基因中都有體現(xiàn)，也是MAPK基因所特有的。

典型MAPK級聯(lián)途徑由3個保守結(jié)構(gòu)域組成，但最新研究發(fā)現(xiàn)部分MAP3K被MAP4K磷酸化所激活，MAP4K具有N末端催化結(jié)構(gòu)域，并具有TFVGTPxWMAPEV［16］。目前已在多個植物中發(fā)現(xiàn)MAP2K，在植物激素信號和響應(yīng)脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用［17］。PmMAP4K基因具有MAP4K特有功能結(jié)構(gòu)域，并未與MAP3K基因直接互作，而是與酪蛋白激酶等互作，而酪蛋白激酶以酸性蛋白為底物，PmMAP4K基因為酸性蛋白，還與參與滲透脅迫的基因互作。PmMAP4K基因?qū)a2+處理響應(yīng)明顯，MeJA、GA、SA、ABA 以及與Ca2+共同作用都誘導(dǎo)了PmMAP4K基因的快速表達，推測PmMAP4K是通過激素信號和Ca2+調(diào)控響應(yīng)馬尾松非生物脅迫。

Ca2+作為植物重要的胞內(nèi)第二信使，是植物對多種逆境響應(yīng)抗性信號傳遞途徑信號調(diào)控的主要因子，參與植物體內(nèi)多種刺激-反應(yīng)的生理過程，Ca2+通過與CDPKs等鈣蛋白結(jié)合形成鈣信號系統(tǒng)參與植物抗逆過程，并且與植物激素信號密切相關(guān)［18］。升高的CDPK信號影響應(yīng)激誘導(dǎo)的MAPK激活，說明CDPK和MAPK通路不能獨立發(fā)揮作用，這兩種通路協(xié)同激活控制著對生物和非生物脅迫反應(yīng)特異性［5］。除PmMAP4K對Ca2+正響應(yīng)，其它基因在Ca2+單獨處理下未見上升表達，而與激素共同處理表達量均得到提高，可能同時受Ca2+和CaM的CDPK和MAPK調(diào)控激素完成響應(yīng)，并且乙烯依賴的非生物脅迫過程CDPK和MAPK存在相互作用［5］，MAP2K作為成員數(shù)最少的 MAPK 級聯(lián)家族，能激活多個MAPK，且各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間交聯(lián)可能集中在MKK水平上［1］，與本研究基因互作預(yù)測結(jié)果相一致。

大部分激素可通過與胞內(nèi)其他信號分子互作調(diào)節(jié)下游防御基因表達，進而引發(fā)傷害部位的防御反應(yīng)［18］，或運送到“全身”引發(fā)系統(tǒng)抗性［19］。MAPK級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過參與植物激素信號合成等途徑響應(yīng)多種非生物脅迫［6］。MAPKs啟動子含有ABA、SA、MeJA等響應(yīng)元件，MAPK級聯(lián)途徑基因與激素信號元件共同調(diào)控表達，在抗逆中發(fā)揮作用［20］。MAPK基因與高鹽及冷脅迫有關(guān)，并通過調(diào)節(jié)SA和JA提高植株抗逆性［21］。MAPK基因是茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正調(diào)控因子［22］。馬尾松MAPK基因在多種激素處理后上調(diào)表達，而有些植物表達下降［23］，說明不同植物在同一信號途徑中存在不同作用或調(diào)控模式。

目前，研究表明MKK6-MPK6在細胞核相互作用，與防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，PmMAPK6與MPK6同源，并與PmMAP2K互作，說明PmMAP2K在上游調(diào)控PmMAPK6的活性參與脅迫反應(yīng)［24］。ABA處理激活OsMAPK5正向調(diào)控干旱、鹽脅迫提高抗性［4，25］。擬南芥AtMPK4、AtMPK6被低溫、鹽等多種脅迫誘導(dǎo)激活［2］。MAPK3/6/10、MAPK3/6在多種植物中被證實與環(huán)境和激素應(yīng)答相關(guān)，如響應(yīng)鹽脅迫、損傷、JA、SA等［24，26］。MAPK4作用于磷酸化MSK1底物，使底物與特定的WRKY轉(zhuǎn)錄因子偶聯(lián)參與SA、ABA、JA等途徑［26-27］，擬南芥WRKY33與MAPK互作參與抗逆脅迫。

MAPK1被報道參與生長素誘導(dǎo)［28］、響應(yīng)JA［29］、ABA、SA［30］、鹽脅迫等［31］，說明MAPKs作為 MAPKs級聯(lián)最下游組分，在植物生物及非生物脅迫中具有重要意義［32］。GA調(diào)控MAP激酶，ABA和GA參與MAP激酶的轉(zhuǎn)錄過程相反［33］，SA誘導(dǎo)的蛋白激酶SIPK屬MAPK家族，并誘導(dǎo)了ET合成［16］，已有研究證實MEKK-like（PmMAP3K）負調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)，MKK3（PmMAP2K）參與植物MKKs由細胞質(zhì)到細胞核轉(zhuǎn)運過程，MKK3被報道受病原體誘導(dǎo)，并且依賴于JA信號途徑進行防御響應(yīng)［9］，馬尾松PmMAP3K在所有處理下表達量均低于對照，PmMAP2K響應(yīng)了所有信號分子誘導(dǎo)，與現(xiàn)有研究一致。

4 結(jié)論

本研究成功獲得馬尾松MAPK 級聯(lián)途徑7個基因，不同類型基因均具有該家族典型的結(jié)構(gòu)域，7個基因均響應(yīng)MeJA、GA、SA、ABA、Ca2+處理表達。PmMAP4K基因?qū)a2+處理響應(yīng)明顯，其次是PmMAP2K基因，MeJA+Ca2+處理MAPK基因表達量高于單獨MeJA處理，而GA、SA、ABA處理基因表達與之相反。馬尾松MAPK基因以不同調(diào)控方式與信號物質(zhì)途徑互作應(yīng)答非生物脅迫。