油用牡丹根際解有機磷細(xì)菌的篩選及解磷功能研究

沈佳佳 侯小改 王二強 王菲 郭麗麗

（1. 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院，洛陽 471023；2. 洛陽農(nóng)林科學(xué)院，洛陽 471022；3. 河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

在植物生長發(fā)育過程中，磷是一種必需的營養(yǎng)元素，它以多種方式參與植物體內(nèi)的生長代謝過程，例如光合作用、糖類代謝、脂類代謝，同時還是DNA、RNA、ATP、磷脂等必需大分子的組成成分［1］。土壤中的磷主要以無機和有機形式存在［2］，但是由于受到土壤性質(zhì)的影響，通常大部分會與Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+、Fe2+等金屬陽離子結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽沉積在土壤中［3-5］，不能被植株吸收利用，使得大多數(shù)農(nóng)業(yè)土壤缺磷，因而需要施用更多的磷肥來維持作物生產(chǎn)。但是過量施用磷肥，不僅造成磷資源浪費，還會引起水體富營養(yǎng)化、土壤結(jié)構(gòu)被破壞等問題［6-7］。

許多研究表明，自然界中存在一些特定的微生物，能夠通過自身代謝等方式將土壤中被固定的難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷，這些微生物被稱為解磷微生物（PSM）［8-9］。這些解磷微生物一方面可以分泌質(zhì)子和有機酸，從而降低土壤介質(zhì)的酸堿度或通過羥基和羧基與鐵、鋁、鎂、鈣等金屬陽離子螯合，使難溶性無機磷酸鹽中的磷得以釋放出來［10］，另一方面也可以通過分泌磷酸酶來礦化有機磷［2］。從有機和無機難溶性磷酸鹽中釋放出的磷又重新參與到土壤-植物體的磷循環(huán)過程中，增加了有效磷含量，從而促進(jìn)植物生長［11］。大量研究也已證實將解磷微生物制成菌劑在農(nóng)田中施用，能在不增加土壤磷庫的情況下為植物提供更多的磷元素［12-13］。因此，利用土壤中的解磷微生物來提高土壤磷的利用率對磷肥減施增效、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展具有重要意義。

牡丹屬于芍藥科芍藥屬牡丹組木本植物，種類眾多，花色變異豐富，在我國已有上千年的栽培歷史，是我國的候選國花，具有較高的觀賞價值。牡丹根皮（丹皮）是傳統(tǒng)的中藥材，藥用價值也非?？捎^。油用牡丹結(jié)實能力強，牡丹種籽可用來生產(chǎn)牡丹籽油，牡丹籽油富含亞麻酸等不飽和脂肪酸，同時含有白藜蘆醇等藥用成分，具有降血脂、改善神經(jīng)功能、抑制癌細(xì)胞等功效［14-17］。油用牡丹是集觀賞、藥用和油用價值于一身的優(yōu)質(zhì)花卉品種。已有田間試驗表明，不施磷肥顯著降低油用牡丹‘鳳丹’的干籽的出仁率、種仁含油率和產(chǎn)油量［18］，進(jìn)而影響其食用品質(zhì)。因此，高效解磷細(xì)菌篩選及應(yīng)用對增加土壤中有效磷含量以及提高油用牡丹的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

目前解磷細(xì)菌的分離篩選研究主要集中在解無機磷細(xì)菌上［3-4］，而土壤中的有機磷占全磷的29%-90%，植酸鹽是土壤有機磷的主要存在形式［19］。土壤有機磷通過解磷細(xì)菌的酶解作用可轉(zhuǎn)化成植物能夠吸收利用的無機磷［20］。本研究將植酸鈣作為唯一磷源，以不同生長年限的油用牡丹‘鳳丹’為研究對象，通過平板稀釋法從根際土壤中分離篩選具有解磷能力的細(xì)菌，以期篩選出具有高效解磷功能的菌株，進(jìn)而利用其改善油用牡丹的磷營養(yǎng)狀況，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，同時也為微生物菌肥的開發(fā)和研制提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土壤的采集與處理 在河南省洛陽市河南科技大學(xué)開元校區(qū)試驗農(nóng)場（112°24′52.05″E，34°35′45.91″N）采集一、三、四年生油用牡丹（‘鳳丹’）根際土壤。去除表層可見的植物殘體，采用五點取樣法，在距離植株10 cm處利用土鉆收集根際土壤，裝入無菌袋中，放于4℃冰盒內(nèi)并帶回實驗室。到達(dá)實驗室后將5個樣點的根際土壤混勻并過篩（2 mm），采用四分法收集約100 g的根際土壤放入樣品袋中，置于4℃冰箱中保存。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 有機磷培養(yǎng)基參考國際植物研究所磷酸鹽生長培養(yǎng)基（NBRIP）［21］，成分稍作調(diào)整（g/L）：葡萄糖 10，氯化鎂 5，植酸鈣 2，硫酸鎂 0.25，氯化鉀 0.2，硫酸銨 0.1，瓊脂粉 15，液體培養(yǎng)基則不加瓊脂粉。LB液體培養(yǎng)基成分和用量如下（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化鈉 10。所有培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，使用前在121℃下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 解磷細(xì)菌的分離和純化 利用平板稀釋法對牡丹根際土壤中的解磷細(xì)菌進(jìn)行分離篩選［22］。具體操作如下：在超凈工作臺中稱取新鮮土壤樣品5 g于無菌離心管中，用無菌水定容至50 mL，振蕩20 min，得到土壤懸液，用移液槍吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋梯度的土壤懸液樣品各0.1 mL，均勻涂布于有機磷固體培養(yǎng)基上，每個梯度重復(fù)3次，最后在28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)并觀察平板中菌落生長狀況及透明圈的產(chǎn)生情況。用接種環(huán)挑取具有溶磷圈且未發(fā)生重疊的菌落，在新的有機磷固體培養(yǎng)基上按照Z字形劃線純化，28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，直至得到純菌株，然后置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取、擴增和純化 采用AxyPrep 細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒（Axygen，USA）提取細(xì)菌的基因組DNA。利用細(xì)菌通用引 物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）對基因組DNA進(jìn)行擴增［23］，PCR擴增反應(yīng)體系（50 μL）如下：10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0，Taq聚合 酶（5 U/μL）1.0，dNTPs（10 μmol/L）1.0，27F引物（10 μmol/L）1.5，1492R引物（10 μmol/L）1.5，基因組DNA（20 ng/μL）1.0，ddH2O 39。PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)：95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s；最后72℃延伸7 min。取3 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并確認(rèn)PCR擴增片段。PCR產(chǎn)物使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.2.2.2 序列測定及分析 純化后的PCR產(chǎn)物送往上海派森諾生物科技股份有限公司，利用測序儀ABI3730-XL進(jìn)行雙向測序。所得序列用ChromasPro軟件截去無用序列后，利用BioEdit軟件對雙端有效序列進(jìn)行拼接，然后將合格序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中利用Blast程序，與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，獲得與待測菌株序列相似性最大的菌株信息，即為鑒定結(jié)果，并將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得序列號。然后利用MEGA7.0軟件［24］對所獲得的菌株序列以及與其相似性較高的16S rRNA基因序列進(jìn)行排列并采用Neighbor-joining方法［25］構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株解磷能力的鑒定

1.2.3.1 溶磷圈的測定 磷酸鹽的溶解一般根據(jù)培養(yǎng)基上的溶磷圈大小進(jìn)行初步的定性分析。將分離純化得到的菌株分別點接于有機磷固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3 d，觀察溶磷圈產(chǎn)生情況，并選取多個互相垂直的方向分別測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），并利用以下公式計算溶磷指數(shù)（P solubilization index，PSI）和溶磷效率（P solubilization efficiency，PSE）［26］：

1.2.3.2 解磷能力的定量分析 將篩選得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)中，于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，測量菌液的OD值，使其OD值為0.6，然后在5 000 r/min下離心3 min，棄上清液后，用0.85%的NaCl溶液清洗菌體3次，再用0.85%的NaCl溶液定容至15 mL，充分搖勻后吸取1 mL加到有機磷液體培養(yǎng)基中，每個菌株重復(fù)3次，于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，隨后搖勻并吸取1.5 mL菌液于1.5 mL無菌離心管中，12 000×g離心2 min，吸取1 mL上清液作為待測液，采用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中速效磷的含量［27］。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，通過新復(fù)極差法（Duncan）來比較差異的顯著性（P ＜ 0.05），最后用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 解磷細(xì)菌的分子鑒定結(jié)果

利用平板稀釋法從3個不同生長年限的油用牡丹根際土壤中共篩選獲得66株解磷細(xì)菌，通過分子鑒定后將其序列與GenBank（核酸序列數(shù)據(jù)庫）中的已有序列進(jìn)行比對，共得到14株不同的菌株（表1）。其中從1年生油用牡丹根際篩選出2株解磷菌株（編號為FD1-3、FD1-15），3年生油用牡丹根際篩選出7株解磷菌株（編號為FD3-1、FD3-5、FD3-6、FD3-7、FD3-13、FD3-23、FD3-24），4年生油用牡丹根際篩選出5株解磷菌株（編號為FD4-4、FD4-8、FD4-13、FD4-17、FD4-19），將這些菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank中獲得的序列號為MW085004-MW085017。在這14株解磷菌株中，隸屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的各有5株，各占總菌株數(shù)的35.72%；隸屬于節(jié)桿菌屬的有3株，占21.42%；還有1株隸屬于新鞘氨醇桿菌屬， 占7.14%。

表1 不同生長年限油用牡丹根際解有機磷菌株的基本信息Table 1 Basic information of organic phosphate-solubilizing bacteria isolated from the rhizosphere of P. ostii growing for different years

不同年限油用牡丹根際篩選出的解磷菌株也不盡相同，其中不同生長年限共有的菌株是Bacillus aryabhattai，1年生和3年生油用牡丹根際共有的菌株是Bacillus megaterium，3年生和4年生油用牡丹根際共有的菌株是Pseudomonas mandelii和Pseudomonas frederiksbergensis。

將篩選獲得的14株解磷菌株的16S rDNA序列與GenBank中的序列比對同源性高的模式菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），發(fā)現(xiàn)14個菌株可以歸為4個主要的菌屬（Pseudomonas、Novosphingobium、Bacillus和Arthrobacter）。其中菌株FD3-5、FD3-24、FD4-4、FD4-8和FD4-13與多個Pseudomonas sp.菌株聚為一支，表明這5個菌株與假單胞菌屬的親緣關(guān)系更近；菌株FD4-17與新鞘氨醇桿菌屬的Novosphingobium gossypii聚為一支，表明二者之間有較近的親緣關(guān)系；菌株FD1-3、FD1-15、FD3-1、FD3-13和FD4-19與2個Bacillus sp.菌株聚為一支，表明這5個菌株與芽孢桿菌屬有較近的親緣關(guān)系；菌株FD3-6、FD3-7和FD3-23分別與Arthrobacter屬的其中一種聚為一小支，表明這3個菌株與節(jié)桿菌屬的關(guān)系更近。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的解有機磷菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of organic phosphate-solubilizing bacteria based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株解磷能力的定性分析

根據(jù)解磷細(xì)菌在有機磷培養(yǎng)基形成的溶磷圈大小，可直觀判斷菌株解磷能力（圖2）。另外，由解磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上形成的溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）計算得到的溶磷指數(shù)（PSI）和溶磷效率（PSE）可以作為初步定性評判菌株解磷能力的指標(biāo)。結(jié)果（表2）顯示，從1年生油用牡丹根際土壤周圍篩選到的菌株FD1-15的溶磷指數(shù)和溶磷效率均最高，表明該菌株的解磷能力可能最強。菌株FD1-3、FD3-13和FD4-8的溶磷指數(shù)和溶磷效率相等并僅次于菌株FD1-15，表明這3個菌株可能具有較高的解磷能力；菌株FD3-6的溶磷指數(shù)和溶磷效率均最低，表明該菌株的解磷能力可能最低。

表2 溶磷圈法分析菌株解磷能力Table 2 Phosphate-solubilizing capacityies of strains analyzed by phosphate-solubilizing circle method

圖2 解有機磷細(xì)菌在有機磷培養(yǎng)基上形成的溶磷圈Fig.2 Phosphate-solubilizing circles formed by organic phosphate-solubilizing bacteria growing on organophosphate culture media

2.3 菌株解磷能力的定量分析

基于培養(yǎng)液中可溶性磷含量可以判斷菌株的解磷能力。本研究從不同生長年限油用牡丹根際土壤中篩選出的14株解磷菌株對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量在2.88-5.30 mg/L之間（圖3），其中從3年生油用牡丹根際土壤中分離篩選的菌株FD3-13對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量最高，為5.30 mg/L，與菌株FD3-23以及4年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD4-8對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量無顯著性差異，而與其他菌株之間呈現(xiàn)顯著性差異；從4年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD4-13對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量最低，只有2.88 mg/L，與菌株FD4-19、1年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD1-3、3年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD3-1、FD3-7和FD3-24對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量不存在顯著差異，而與其他菌株之間的差異均達(dá)到顯著水平。

圖3 不同生長年限油用牡丹根際解有機磷菌株的解磷能力比較Fig.3 Comparison of phosphate-solubilizing capacities of phosphate-solubilizing strains in the rhizosphere of P. ostii growing for different years

2.4 解磷菌株對植酸鈣的活化

根據(jù)菌株對植酸鈣活化率的高低可以判斷菌株解磷能力的強弱。本實驗從不同生長年限油用牡丹根際土壤中篩選出的14株解磷菌株對植酸鈣的活化率在26.44%-62.13%之間（圖4），其中從3年生油用牡丹根際土壤中分離篩選出的菌株FD3-13對植酸鈣的活化率最高，為62.13%，與菌株FD3-1、FD3-7、FD3-24，1年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD1-3以及4年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD4-13和FD4-19對植酸鈣的活化率存在顯著差異，而與其余各菌株之間并未呈現(xiàn)出顯著的差異性；從4年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD4-13對植酸鈣的活化率最低，只有26.44%，與1年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD1-3以及3年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD3-1對植酸鈣的活化率不存在顯著性差異，但與其余各菌株之間的差異已達(dá)到顯著水平。

圖4 不同生長年限油用牡丹根際解有機磷菌株活化植酸鈣能力的分析Fig.4 Analysis of the capacities to mineralize phytin by phosphate-solubilizing strains in the rhizosphere of P. ostii with different years’ seedlings

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)會受到植物年齡的影響［28］。牡丹品種和種植年限均能夠影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，并且種植年限對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于品種對其的影響。牡丹種植年限越長，其根際土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性水平就越低［29-31］。但是，微生物種群和生物量在最開始種植的幾年里是隨著種植年限的增加而增加的，在種植若干年后其微生物種群和生物量才開始減少。本研究從一、三、四年生油用牡丹根際土壤中共分離到14株解有機磷菌株，其中從3年生油用牡丹根際土壤中分離出的解磷菌株最多，為7株，占總菌株的50%；4年生油用牡丹根際土壤中分離出5株解磷菌株，占35.72%；1年生油用牡丹根際土壤中分離出的解磷菌株最少，只有2株，占14.28%。此外，菌株FD1-3、FD1-15、FD3-1、FD3-13和FD4-19同屬于芽孢桿菌屬，菌株FD3-5、FD3-24、FD4-4、FD4-8和FD4-13同屬于假單胞菌屬。Bacillus aryabhattai是從3個不同生長年限油用牡丹根際都能篩選出的解磷菌株，Bacillus megaterium是從1年生和3年生油用牡丹根際都能篩選出的解磷菌株，Pseudomonas mandelii和Pseudomonas frederiksbergensis是從3年生和4年生油用牡丹根際篩選出的解磷菌株，表明芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌是優(yōu)勢菌群，且適應(yīng)不同生長環(huán)境的能力較強。

許多研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和節(jié)桿菌屬中一些菌株的溶磷能力較強［32-34］。根據(jù)固體培養(yǎng)基上溶磷圈的大小和培養(yǎng)液中速效磷含量的多少以及植酸鈣活化率的高低，可以判斷菌株的解磷能力。在本研究中，根據(jù)溶磷指數(shù)（PSI）和溶磷效率（PSE）的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)1年生油用牡丹根際篩選到的菌株FD1-15的溶磷指數(shù)和溶磷效率均最高，菌株FD1-3、FD3-13和FD4-8的溶磷指數(shù)和溶磷效率相等并僅次于菌株FD1-15，表明這4個菌株的解磷能力較強，而菌株FD3-6的溶磷指數(shù)和溶磷效率均最低，表明該菌株的解磷能力最低。但是根據(jù)培養(yǎng)液中速效磷的含量可以看出解磷能力最強的是從3年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD3-13（巨大芽孢桿菌），屬于芽孢桿菌屬；解磷能力最弱的為4年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD4-13，屬于假單胞菌屬。綜合上述指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，同一菌株在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的解磷能力并未達(dá)到統(tǒng)一，即在固體培養(yǎng)基上溶磷指數(shù)和溶磷效率較小或較大的菌株，在液體培養(yǎng)基中卻有較強或較弱的解磷能力，這可能是由兩種培養(yǎng)方式不同所造成的，有的解磷細(xì)菌可能更適合在液體培養(yǎng)方式下生長繁殖，而在固體培養(yǎng)方式下生長速度較慢，因此菌株在液體培養(yǎng)方式下的解磷能力比在固體培養(yǎng)方式下強［35］，同時也支持了菌株溶磷能力與平板上的溶磷圈大小呈弱相關(guān)關(guān)系［36］的結(jié)論。

有些解磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上溶磷圈不明顯，但經(jīng)過液體培養(yǎng)，也能表現(xiàn)出一定的解磷能力。從1年生油用牡丹根際土壤中篩選出的菌株FD1-3和FD1-15雖同為芽孢桿菌屬，但在溶解植酸鈣的能力上也存在顯著差異，這可能與菌株本身的性質(zhì)有關(guān)，同一屬的菌株其溶磷能力也可能存在較大差異［37］。若能將篩選到的高效解磷菌株進(jìn)行規(guī)?；瘮U繁和馴化，并開發(fā)和研制成微生物菌肥應(yīng)用到油用牡丹的栽培中，不僅對提高油用牡丹的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義，同時對產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也起到一定的推動作用。

4 結(jié)論

從一、三、四年生油用牡丹根際土壤中共篩選出14株解有機磷菌株。其中隸屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的各5株，隸屬于節(jié)桿菌屬的3株，隸屬于新鞘氨醇桿菌屬1株；解有機磷菌株溶磷指數(shù)和溶磷效率分別在1.6-9.0和60%-800%之間，其中1年生油用牡丹根際篩選到的菌株FD1-15的溶磷指數(shù)和溶磷效率均最高；培養(yǎng)液中速效磷含量為2.88-5.30 mg/L，活化率在26.44%-62.13%之間，解磷能力和活化能力最強的是從3年生油用牡丹根際篩選獲得的菌株FD3-13，隸屬于芽孢桿菌屬。