枯草芽孢桿菌K-268的分離鑒定及對水稻稻瘟病的防病效果

祖雪 周瑚 朱華珺 任佐華 劉二明

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128；2. 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128； 3. 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128）

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的災(zāi)難性病害，每年造成全球水稻產(chǎn)量損失可養(yǎng)活6 000萬人［1］。目前，防治稻瘟病的主要策略是利用抗病品種和化學(xué)農(nóng)藥。盡管利用抗瘟品種是防治稻瘟病最安全有效的措施，但選育抗病品種的周期長，加之抗病品種與稻瘟病菌存在特異性互作，一般抗瘟品種大面積種植3-5年會抗性“喪失”［2］?；瘜W(xué)防治主要是通過化學(xué)殺菌劑來防治稻瘟病，在稻瘟病流行年份需要多次施用才能達(dá)到一定的防治效果，由此會帶來潛在的稻米食用安全問題。而生防微生物分布廣泛，對環(huán)境和人類影響較小，因此，稻瘟病生防微生物的研發(fā)成為了研究熱點［3］。

生物防治是微生物農(nóng)藥的發(fā)展趨勢，用于稻瘟病菌生物防治的芽孢桿菌主要包括短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）等［4］。Ghasemi等［5］從伊朗高鹽度生態(tài)中分離的短小芽孢桿菌SG2 產(chǎn)生的兩種幾丁質(zhì)酶（ChiS 和 ChiL），對稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌和立枯絲核菌等多種植物病原菌顯示出抗菌活性，首次報道了短小芽孢桿菌的雙功能幾丁質(zhì)酶/溶菌酶的作用。Tendulkar等［6］從土壤中分離的地衣芽孢桿菌BC98除了對稻瘟病菌（M. oryzae）表現(xiàn)較高的抗菌活性，還對水稻紋枯病、玉米大斑病等有抑制效果。表面活性素是芽孢桿菌產(chǎn)生的一類重要脂肽，在農(nóng)業(yè)制藥領(lǐng)域占有重要地位，Wu等［7］從海洋微生物中分離出了一株對稻瘟病菌有抑制作用的海洋芽孢桿菌CS30，并進(jìn)行了抗真菌活性研究，其代謝物表面活性素明顯降低了稻瘟病菌（M. oryzae）對植物的致病性；Zhang等［8］分離的海洋芽孢桿菌對稻瘟病菌（M. oryzae）的抑菌效果顯著，從中分離出的活性代謝物鑒定為芬霉素家族的環(huán)脂肽（CLPs），命名為芬霉素 BS155，其通過誘導(dǎo)膜損傷和細(xì)胞器功能障礙、破壞 MMP、氧化應(yīng)激和染色質(zhì)凝聚而起作用，從而抑制稻瘟病菌（M. oryzae）菌絲生長。馮蓉等［9］從草莓根際土壤中分離篩選的解淀粉芽孢桿菌 F11，對水稻稻瘟病病菌、獼猴桃軟腐病菌、煙草黑脛病菌和煙草炭疽病菌等多種常見病原菌的抑制效果達(dá)70%以上；由云南省星耀生物制品廠、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)共同研發(fā)的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品“百抗”，是我國第一個在水稻上獲得登記的芽孢桿菌制劑，其有效成分為枯草芽孢桿菌B908，具有防治防范廣效果好等優(yōu)點，對水稻紋枯病和煙草青枯病防治效果最佳均達(dá)70%［10-11］。中國農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.org.cn/）的行業(yè)數(shù)據(jù)顯示：目前我國利用芽孢桿菌研發(fā)并登記投入使用的微生物殺菌劑有152種，其中用于防治稻瘟病的殺菌劑有26種。

為篩選出對稻瘟病菌有高效拮抗效果的生防菌，本實驗指示菌為水稻稻瘟病菌，從感病品種K020268感病稻叢的健康稻株的葉片中分離獲得內(nèi)生菌株263株，經(jīng)平板對峙法從葉片中篩選出1 株對稻瘟病菌具有較好拮抗作用的菌株K-268。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及 16S rRNA和 gyrA序列分析對其進(jìn)行了菌株鑒定，初步測定了其對不同植物病原菌的抑菌譜；并研究了該菌在不同溫度、pH和NaCl濃度培養(yǎng)下的生物學(xué)特性；通過室內(nèi)離體水稻葉片和盆栽活體實驗，評價了該菌株的發(fā)酵液對稻瘟病的防治效果，以期為植物病害生物防治藥劑研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、黃瓜疫霉病菌（Phytophthora melonis）、茭白鐮刀菌（Fusarium graminearum）、香樟炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、茄 子 根 腐 病 菌（Fusarium solani）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、柑橘沙皮病菌（Diaporthe citri）、棉 花 黃 萎 病 菌（Verticillium dahlia）、煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）均保藏于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原微生物及水稻病害實驗室。

1.1.2 水稻品種 感稻瘟病品種湘晚秈12號來自湖南金色農(nóng)豐種業(yè)有限公司，種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)基地溫室。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 樣本采集于湖南桃江病圃（湖南省益陽市桃江縣高橋鄉(xiāng)羅溪村28°22′29.2584″E，112°2′27.4848″N），從感病水稻品種K020268的病叢中采集健康植株。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的分離與純化 將水稻樣品的根部、莖稈和葉片剪成3-5 cm的小段，表面消毒后置于滅菌的研缽中，加入適量的液氮搗碎研磨，再加入10-20 mL無菌水，靜置30-35 min，10-1-10-7的梯度進(jìn)行稀釋，每個濃度取0.2 mL液體均勻涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（beef extract peptone AGAR medium）平板上，重復(fù)3次，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48 h。待平板內(nèi)長出單菌落后，挑取不同形態(tài)的細(xì)菌單菌落于新的NA平板上劃線純化。

1.2.3 拮抗稻瘟病菌細(xì)菌的篩選 參照平板對峙法［12］對純化的菌株進(jìn)行篩選，即在9 mm的PDA平板中央接種7 mm稻瘟菌菌餅，再將純化的菌株劃線接種于菌餅兩側(cè)3-5 cm處，以不接菌株的平板為對照組，每個處理3次重復(fù)。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-7 d，觀察并測量有明顯抑菌帶的菌落直徑。根據(jù)以下公式計算菌株抑菌率，篩選出對稻瘟病菌菌絲的生長抑制效果較好的菌株。

式中：DCK為對照組菌落生長直徑（cm）；Dd為處理組菌落生長直徑（cm）。

1.2.4 拮抗菌株的抑菌譜測定 采用平板對峙法測定菌株K-268對玉米大斑病菌、水稻紋枯病菌和油菜菌核病菌等14株供試植物病原菌的抑菌效果。

1.2.5 拮抗細(xì)菌的分類鑒定 （1）拮抗細(xì)菌K-268的生物學(xué)鑒定。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［13］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］的方法觀察單個菌落的形態(tài)、大小、顏色、干濕、光滑或粗糙等。對拮抗細(xì)菌K-268進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、硝酸還原、明膠的液化、硫化氫、酶的水解、吲哚實驗、VP實驗、甲基紅實驗、石蕊牛奶實驗、苯丙氨酸脫氫酶等多項生理生化特征分析試驗。每處理重復(fù)3次。

（2）16S rRNA序列分析。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株K-268的 DNA，用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株DNA完整性，16S rRNA測序進(jìn)行菌種鑒定的通用引物為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ 和 1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTA- CGA -3′，gyrA測序進(jìn)行菌種鑒定的通用引物為42F： 5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′和1066R：5′-CAAGGTAATGCTTCCAGGATTGCT-3′，25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系12.5 μL Super Mix，上下游引物各1 μL，1 μL DNA，9.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性98℃ 2 min（變性98℃ 10 s，退火53℃ 10 s，延伸72℃ 20 s）35個循環(huán)，延伸72℃ 2 min，4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至湖南擎科生物有限公司進(jìn)行測序，將所得序列在 NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索比對，并利用 MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 菌株K-268的生物學(xué)特性 （1）生長曲線測定。將菌株K-268進(jìn)行兩次活化，在第二次活化 24 h 時將菌懸液取 1 mL 轉(zhuǎn)接入200 mL NB 培養(yǎng)液的三角瓶（300 mL）中，180 r/min 28℃培養(yǎng) 24 h，測定其OD600的值；用無菌水將菌株的OD600稀釋相等，取1 mL接入200 mL NB 培養(yǎng)液的三角瓶（300 mL），180 r/min 28℃培養(yǎng)，從接種第2小時開始，每隔 2 h 取一次樣，一直測到58 h，每次取樣均用分光光度計測量OD600值，并采用稀釋涂布法測定樣品中的有效活菌數(shù)，測定均重復(fù)3次，計算菌液濃度并繪制生長曲線。

（2）生長溫度范圍測定。取 1 mL 接種于NB 培養(yǎng)液中，設(shè)置平行實驗，分別置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃和60℃環(huán)境下黑暗培養(yǎng)7 d，每組3次重復(fù)。在培養(yǎng)第24小時時取樣，測定其 OD600值和有效活菌數(shù)。

（3）生長pH范圍測定。配制pH分別為 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 的NB培養(yǎng)基，將1 mL 種子液接種于不同 pH 的培養(yǎng)液中，180 r/min、28℃ 培養(yǎng)24 h后取樣，測定樣本的OD600值，每組3次重復(fù)。

（4）氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對細(xì)菌生長的影響。配置NaCl 濃度分別為 0.5%、1%、2%、5%、7%、10%和15%（W/V）的NB培養(yǎng)基，再將1 mL 種子液接于其中，180 r/min、28℃ 培養(yǎng) 24 h 后取樣，測定樣本的OD600值，每組3次重復(fù)。

1.2.7 菌株K-268對水稻葉瘟的防治效果評價 離體接種：以易感稻瘟病的湘晚秈12號為實驗材料，待水稻長至5葉1心時，采用針刺離體接種法［12］。即剪下約6-7 cm的新鮮水稻葉片，用接種針對離體葉片正面輕刺造成 3個微刺傷口，在傷口上接種稻瘟病菌5 μL孢子懸浮液，葉片保存在含有0.1% 6-芐基氨基嘌呤的無菌水培養(yǎng)皿中。采用濃度為6×109CFU/mL、6×108CFU/mL和6×107CFU/mL的K-268發(fā)酵液，設(shè)置兩個處理組，預(yù)防組（-24 h）：分別用NB培養(yǎng)液、清水、75%三環(huán)唑（WP）750倍稀釋液及不同濃度發(fā)酵液浸泡葉片5 min分鐘左右并晾干，24 h后接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液。治療組（+24 h）：先接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液，24 h后分別用NB培養(yǎng)液、清水、75%三環(huán)唑（WP）750倍稀釋液及不同濃度發(fā)酵液浸泡葉片5 min分鐘左右并晾干。接種后的培養(yǎng)皿置于 28℃、相對濕度 100%環(huán)境下，黑暗處理 24 h后，再按光照和黑暗交替培養(yǎng)，直至水稻葉片發(fā)稻瘟病，根據(jù)整體發(fā)病情況計算發(fā)病率［14］。

活體盆栽接種：以易感稻瘟病的湘晚秈12號為試材，待水稻長至3葉1心時采用噴霧接種法進(jìn)行實驗。設(shè)計3個處理：（1）對照組，僅噴施稻瘟病菌孢子懸浮液；（2）預(yù)防組（-24 h），將15 mL濃度為6×109CFU/mL、6×108CFU/mL和6×107CFU/mL的K-268菌株發(fā)酵液均勻地噴施在植株葉片上，24 h后再噴施稻瘟病菌孢子懸浮液。（3）治療組（+24 h），先將稻瘟病菌孢子懸浮液噴灑在水稻葉片表面，保濕24 h再均勻噴灑10 mL濃度為6×109CFU/mL、6×108CFU/mL和6×107CFU/mL的K-268菌株發(fā)酵液。以清水、NB培養(yǎng)液、75%三環(huán)唑可濕性粉劑（WP）750倍稀釋液和40%稻瘟靈（EC）可濕性粉劑500倍稀釋液為對照，每處理重復(fù)3次，置于25-32℃溫室條件下生長，光周期為12 h，溫相對濕度范圍為85%-100%。葉瘟的分級標(biāo)準(zhǔn)參照 GB/T 15790-2009《稻瘟病測報調(diào)查規(guī)范》［15］。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2010、SPSS 17、Origin2018和MEGA5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選

采用稀釋涂布平板法從感稻瘟病品種K020268健康植株的葉片、莖桿和根部共分離純化出菌株263株，其中從葉片中分離獲得的菌株K-268對稻瘟病菌的抑制效果最好，對稻瘟病菌菌絲生長的抑制率達(dá)86.3%±0.70%（圖1）。

圖1 菌株 K-268對稻瘟病產(chǎn)生的拮抗作用Fig. 1 Antagonistic effect of strain K-268 on M. oryzae

2.2 拮抗菌株K-268對不同植物病原菌的抑菌作用

菌株 K-268對14株供試的病原真菌及卵菌均有抑制效果（表1），其中對水稻紋枯病菌的抑制效果最為顯著，抑制率達(dá)79.5% ± 0.67%；對辣椒枯萎病菌和水稻惡苗病菌的抑制率達(dá)到 60% 以上；對禾谷鐮刀菌、油菜菌核病菌、黃瓜疫霉病菌3 種病原菌的抑制率均達(dá)50%以上；對柑橘沙皮病菌、玉米大斑菌、香樟炭疽病菌、煙草赤星病菌等病原菌也有不同程度的抑制作用。

表1 菌株 K-268對不同植物病原菌的抑菌作用Table 1 Bacteriostatic effects of strain K-268 on different plant pathogens

2.3 拮抗菌株的形態(tài)及生理生化特征

在28℃、黑暗的條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)K-268菌落乳白色，形態(tài)不規(guī)則，邊緣隆起，粗糙不透明，表面干燥，有皺襞（圖2-A）；通過掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，菌體呈桿狀，革蘭氏呈陽性（圖2-B）無莢膜，有鞭毛，大小為（0.6-0.8）μm ×（2.0-3.0）μm，芽孢（0.6-0.9）μm ×（1.0-1.5）μm，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大芽孢成橢圓形（圖2-C）。菌株K-268的生理生化特征表明（表2），接觸酶、吲哚試驗陽性，可還原硝酸鹽，使明膠液化和石蕊牛奶胨化；硫化氫試驗、V. P和甲基紅試驗呈陰性，以上特征符合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中關(guān)于枯草芽孢桿菌的描述。

表2 菌株K-268的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain K-268

圖2 K-268菌株菌落形態(tài)Fig. 2 Colony morphology of K-268 strain

2.4 拮抗菌株的16S rRNA和gyrA序列分析

對菌株K-268的 16S rRNA和gyrA序列進(jìn)行測序，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得部分有效序列長度分別為1 422 bp和947 bp。將序列分別提交上傳至 GenBank 中，進(jìn)行 BLAST 同源序列檢索比對，使用 MEGA5.0軟件中的的 Neighbor-Joining Tree 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析。結(jié)果顯示菌株K-268的16S rRNA序列與枯草芽孢桿菌 B.subtilis IAM12118的序列相似性達(dá)89%（圖3），菌株K-268的gyrA序列同樣與枯草芽孢桿菌 B.subtilis SRCM102754的同源性為100%（圖4），結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及16S rRNA和gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將K-268菌株鑒定為枯草芽桿菌。

圖3 K-268菌株16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 16SrRNA phylogenetic tree of K-268 strain

圖4 K-268菌株gyrA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 gyrA phylogenetic tree of K-268 strain

2.5 K-268菌株的生物學(xué)特性

由菌株K-268生長曲線（圖5-A）可知，菌株 K-268在14 h內(nèi)微生物數(shù)量變化最小，在12 h-18 h時OD值逐漸升高；12-32 h為對數(shù)期生長階段細(xì)菌數(shù)呈幾何級數(shù)比數(shù)增長是選育菌種的最佳時期；時長為32 h時活菌數(shù)量最多達(dá)到K值，說明菌液中的次生代謝物持續(xù)積累，并產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物；32 h之后隨著時間的延長繁殖率小于死亡率，活菌數(shù)急劇下降，釋放代謝產(chǎn)物；而18-48 h OD值與濃度呈正比關(guān)系。48 h時OD達(dá)到最大濃度最高，48 h后處于動態(tài)平衡。

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》可知枯草芽孢桿菌的最適溫度為30℃、pH5.7-7.8、最適鹽濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%-7%之間，由圖5-B可見，菌株K-268的最適溫度在10℃-37℃之間無顯著差異性，隨著溫度的上升OD值呈下降趨勢，但在≥50℃高溫條件下仍能生長且保持代謝活躍；隨著pH增加菌液的OD值逐步升高pH6時到達(dá)峰值，當(dāng)pH＞6 時OD值呈下降趨勢（圖5-C），即菌株K-268的最適生長pH 6，適合生長pH為6.0-7.0；最適NaCl濃度為0-3%（圖5-D）

圖5 菌株K-268的生物學(xué)特性Fig. 5 Biological characteristics of strain K-268

2.6 菌株K-268對稻瘟病的防治效果

室內(nèi)離體實驗表明，不同濃度的K-268發(fā)酵液對離體接種水稻葉片都有抑制作用（圖6，表3），經(jīng)清水或NB培養(yǎng)液對照處理的葉片，發(fā)病率達(dá)95%-98.77%；經(jīng)100倍稀釋液（6×107CFU/mL）、10倍稀釋液（6×108CFU/mL）、原液（6×109CFU/mL）K-268發(fā)酵液處理的水稻葉片，預(yù)防組和治療組的發(fā)病率明顯低于與對照組；從表3可以看出：經(jīng)稀釋750倍75%三環(huán)唑（WP）處理的水稻葉片發(fā)病率為12.34%-17.28%，菌株 K-268濃度為6×107CFU/mL時，拮抗效果相對最好，發(fā)病率為14.81%-23.46%，與750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）的效果基本相當(dāng)。此外，在預(yù)防組中750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）與濃度6×107CFU/mL相比，后者因濃度過低接近于清水導(dǎo)致發(fā)病率與處理組相比無顯著差異；但在治療組中濃度6×109CFU/mL、6×108CFU/mL和750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）無顯著差異。

表3 不同濃度的K-268發(fā)酵液對水稻稻瘟病的離體拮抗效果Table 3 In vitro antagonistic effects of different concentrations of K-268 fermentation broth on rice blast

圖6 菌株K-268對葉瘟的防治效果（離體接種）Fig. 6 Control effect of strain K-268 on leaf blast（indoor detached-leaf inoculation）

活體噴霧接種實驗（圖7，表4）表明，在預(yù)防組中菌株K-268 對水稻瘟病有較好的防治效果，原液（6×109CFU/mL）因滲透壓的影響會導(dǎo)致植株生長萎蔫，而稀釋100倍（6×107CFU/mL）濃度過低防治效果不佳，因此稀釋10倍（6×108CFU/mL）時對抑制稻瘟病菌的生長效果最佳，其相對防效為59.00%，與750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）和500倍稀釋液的40%稻瘟靈（EC）的防治效果基本一致；治療組中750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）和500倍稀釋液40%稻瘟靈（EC）的相對防效分別為67.20%和51.00%，經(jīng)不同濃度對稻瘟病的相對防效分別為45.50%、60.23%、38.9%與750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）和500倍稀釋液的40%稻瘟靈（EC）相比存在差異性。結(jié)合兩組的結(jié)果相比較，先噴施菌株K-268發(fā)酵液24 h后再接種稻瘟病菌孢子懸浮液的防治效果好。

表4 菌株K-268對水稻稻葉瘟的盆栽防治效果Table 4 Control effect of strain K-268 on rice leaf blast in pot

圖7 菌株K-268對葉瘟的防效局部圖（活體接種）Fig.7 Partial view of the control effect of strain K-268 against leaf blast（indoor live inoculation）

3 討論

目前，用于防治植物病害的細(xì)菌微生物主要是假單孢菌屬（Pseudomonas spp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus spp.），其中芽孢桿菌因其具有高度抗逆能力，能產(chǎn)生多種抗菌肽和脂類，在保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面有良好的環(huán)境兼容性、不易產(chǎn)生抗藥性、具有抑菌廣譜性和極強(qiáng)的抗逆性等優(yōu)點，成為了當(dāng)下植物病害生物防治領(lǐng)域的主要研究熱點［16］。日本學(xué)者分離得到的枯草芽孢桿菌RB14和NB22對茄子根腐病和辣椒枯萎病有很強(qiáng)的抑制作用［17］。Cavaglieri等［18］分離出的貝萊斯芽孢桿菌 RC8、RC9 和 RC11對玉米輪枝鐮孢菌有較好的拮抗效果。周瑚等［10］等分離鑒定的特基拉芽孢桿菌JN-369對其進(jìn)行室內(nèi)離體接種實驗，結(jié)果表明，預(yù)防組和治療組的發(fā)病率僅為11.04%-21.85%；李瑾等［19］進(jìn)行了解淀粉芽胞桿菌HR-2對水稻盆栽實驗，結(jié)果顯示，該菌發(fā)酵液稀釋10倍和 100倍對水稻稻瘟病的防治效果分別為 63.81% 和 40.77%。Sha等［1］從水稻非根際土壤中分離的解淀粉芽孢桿菌S170和短小芽孢桿菌S9對稻瘟病菌的抑制效果顯著，并對11種植物病原菌真菌引起的植物病害有抑制作用，其對水稻離體和室內(nèi)活體葉片的防效分別為75.5%和74.6%；Chen等［3］研究發(fā)現(xiàn)的貝萊斯芽孢桿菌菌株ZW-10培養(yǎng)液對水稻離體葉片的抑制效果預(yù)防組和治療組與清水對照組相比分別減少了58.2%和53.3%；因此可看出，拮抗菌株的篩選和生防制劑的研發(fā)成為防治植物病害的一種安全、有效的途徑。

菌株K-268采集于湖南省益陽市桃江縣高橋鄉(xiāng)羅溪村，試驗土壤pH值為6.3，該菌株可在 pH 13.0 和鹽濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 15%的 NB培養(yǎng)基中亦能生長。由《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》可知，枯草芽孢桿菌的最適生長溫度為30℃，最適pH為7，最適鹽濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在2%-7%之間，張國慶等［20］分離出的拮抗芽孢桿菌 P-25 菌株在鹽度范圍為 2%-10%、pH為 5.0-8.0；趙慶新等［21］研究報道的枯草芽孢桿菌ZQX8 的鹽濃度范圍為5%-10%、pH 7.0-9.0，常見作物的最適生長溫度為20℃-30℃、pH為5-8［22］。本研究中的K-268菌株在60℃高溫條件下仍能存活，pH為2-13亦能生長，且耐鹽范圍廣，即該菌株具有耐高溫和耐鹽性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，因此該拮抗菌株能夠廣泛用于一般作物的自然生長環(huán)境條件，同時也有利于生物制劑的制備、改良土壤、降低鹽堿度以及在輕度鹽漬化環(huán)境中的施用。此外，K-268菌株除了對水稻稻瘟病、紋枯病、惡苗病3個重要病害有較強(qiáng)的抑制作用之外，還對辣椒枯萎病、黃瓜疫霉病、油菜菌核病等12種植物病原菌有不同程度的抑制作用，與楊杰等［23］、Zhang 等［24］、余閑美等［25］、Wijtzes等［26］報道的枯草芽孢桿菌相比抑菌譜更廣，對稻瘟病的防治效果更佳；與孔建等［27］分離獲得的枯草芽孢桿菌B-903對棉苗病害、菠菜枯萎病、蘋果病害的盆栽實驗的抑菌廣譜性相似，可能是菌株K-268分泌某些抗菌物質(zhì)對植物病原菌起到抑菌作用，具體分泌那些抗拒物質(zhì)尚未明確，還需進(jìn)一步研究。劉連盟［28］的枯草芽孢桿菌H158對水稻稻瘟病的防治效果在38.4%-50.1%之間，與化學(xué)殺菌劑混用性能良好。朱華珺等［29］室內(nèi)活體實驗表明枯草芽孢桿菌JN005的胞外抗菌物質(zhì)100倍稀釋液對稻瘟病的防治效果與40%的稻瘟靈（EC）相似但是不如75%（WP）的三環(huán)唑。而經(jīng)K-268菌株發(fā)酵液 10倍稀釋液處理的水稻葉片不管是離體還是活體發(fā)病率明顯降低，且活體接種預(yù)防組中的防治效果與500倍稀釋液40%稻瘟靈（EC）和750倍稀釋液75%三環(huán)唑（WP）的防治效果基本相近，且對水稻葉片有一定的保護(hù)作用。因此，鑒于菌株K-268的實用性可進(jìn)行大量生產(chǎn)和田間應(yīng)用，但推廣還需明確該菌的拮抗物質(zhì)、作用機(jī)理和田間穩(wěn)定性實驗等研究。

4 結(jié)論

從患病稻叢的健康水稻植株葉片中分離獲得的內(nèi)生菌株K-268，對水稻稻瘟病菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時對15株供試植物病原菌均有明顯抑制作用，對水稻紋枯病菌（R. solani）、水稻惡苗病菌（F. moniliforme）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum）和茄子根腐病菌（F. solani）的抑菌效果均達(dá)到60%以上，表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性。結(jié)合菌株形態(tài)特征、生理生化特征及16S rRNA和gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將菌株K-268鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili）。其對稻瘟病的盆栽防治效果為59.00%-60.23%，與40%稻瘟靈和75%三環(huán)唑的防效基本相當(dāng)。