GRAS轉(zhuǎn)錄因子AtSCL4負(fù)調(diào)控擬南芥應(yīng)答滲透脅迫

徐紅云 張明意

（貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025）

非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，造成農(nóng)林生產(chǎn)的重大損失［1］。滲透脅迫是限制植物生長、分布，影響作物產(chǎn)量的重要因素之一，會導(dǎo)致細(xì)胞水分缺失而引起損傷［2］。干旱、鹽害、低溫和冰凍災(zāi)害等都會引起滲透脅迫。為了適應(yīng)滲透脅迫，植物在生理生化方面會發(fā)生改變，如關(guān)閉氣孔、增加過氧化物酶活、積累滲透物質(zhì)等，以適應(yīng)逆境脅迫［3-4］。同時，滲透脅迫會誘導(dǎo)大量抗逆基因的表達(dá)，來調(diào)控植物的生理變化。

GRAS家族為植物體內(nèi)一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，GRAS蛋白有1個可變的N末端區(qū)域和1個高度保守的C末端區(qū)域。GRAS蛋白含有5個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：LHR-I、VHIID、LHR-II、PFYRE和SAW［5］。擬南芥GRAS蛋白可分為10個亞家族，即LISCL、AtPAT1、AtSCL3、DELLA、AtSCR、AtSHR、AtLAS、HAM、AtSCL4/7、DLT［6］。截至目前，已從多種植物中鑒定出多個GRAS家族成員，如在楊樹、擬南芥和水稻中分別鑒定出有106、34和60個GRAS家族基因［7］，此外，在煙草［8］、青梅［9］、大白菜［10］、番茄［11］、蓮藕［12］等植物中也分別鑒定出GRAS基因。

GRAS轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物應(yīng)答各種非生物脅迫。例如，水稻OsGRAS23可被干旱、NaCl和茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)，并且OsGRAS23過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株可通過減少H2O2含量和促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植物抗旱性和抗氧化性［13］。山葡萄VaPAT1轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株可通過增加脯氨酸和可溶性糖含量，提升植株的耐寒性、耐旱性和耐鹽性；此外，VaPAT1可誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，如AtSIZ1、AtCBF1、ATATTR1、MYB34、AtMYC2、AtCOR15A、AtRD29A和AtRD29B等［14］。楊樹GRAS蛋白PeSCL7通過增強α-淀粉酶和超氧化物歧化酶活性，提高了植物應(yīng)對干旱和高鹽的耐受性［15］。鹽穗木HcSCL13基因的過表達(dá)提高植株的耐鹽性［16］。盡管從不同的植物中克隆出許多GRAS基因，但GRAS家族基因調(diào)控植物響應(yīng)滲透脅迫的生理和分子機制還有待進(jìn)一步深入研究。

AtSCL4為GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族中非常重要的一個成員，但目前對其功能研究較少。本研究通過比較野生型和AtSCL4突變體擬南芥應(yīng)對滲透脅迫的抗逆能力差異，并分析不同植株間生理及相關(guān)抗逆基因的表達(dá)情況，為GRAS蛋白在非生物脅迫中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，WT）為Columbia（Col）生態(tài)型，由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實驗室提供。AtSCL4（AT5G66770）T-DNA插入突變體植株（SALK_031569）購買自擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 AtSCL4受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析 3周齡的野生型擬南芥用200 mmol/L甘露醇處理3、6、12、24和48 h后分別取樣，以0 h清水處理為對照。根和葉分開取樣后，用液氮速凍后放-80℃保存。提取植株RNA，利用qRT-PCR方法測定AtSCL4在不同處理條件下及不同組織中的表達(dá)量。

1.2.2 非生物脅迫耐受實驗 用10%次氯酸鈉消毒W(wǎng)T和AtSCL4純合突變體的種子，放置在添加200 mmol/L甘露醇的1/2 Murashige Skoog（MS）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后計算幼苗發(fā)芽率。將WT和AtSCL4突變體的種子放置在1/2 MS培養(yǎng)基上生長4 d后，將幼苗轉(zhuǎn)移至含200 mmol/L甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，測定苗根長和鮮重。

1.2.3 逆境相關(guān)生理指標(biāo)測定 氣孔孔徑測定：將3周齡擬南芥葉片下表皮剝離，浸泡在30 mmol/L KCl和10 mmol/L MES-KOH（pH6.15）的 溶 液 中， 22℃培養(yǎng)2.5 h，誘導(dǎo)氣孔開放，然后添加200 mmol/L甘露醇，再孵育2 h。在光學(xué)顯微鏡下（Olympus BX43，Japan）觀察氣孔孔徑，并使用IMAGEJ 1.36b軟件測量氣孔開放度。

葉片失水率測定：將3周齡擬南芥的葉片剝離植株后立即稱量鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），然后每30 min稱一次分離葉片失水后重量（leaf desiccated weight，LDW）。4 h后，將葉片置于80℃烘箱中過夜后稱量干重（dry weight，DW）。失水率（water loss rates，WLR）計算公式為：WLR（%）=［（FWLDW）/（FW-DW）］×100%。

葉片組織染色：用水和200 mmol/L甘露醇處理3周齡的野生型和突變體植株24 h后取葉片，浸泡在3，30-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB，1.0 mg/mL）和硝基四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazolium，NBT，1 mg/mL）溶液中染色，保持真空15 min后于黑暗處反應(yīng)6 h，然后用95%乙醇于沸水浴脫色。

脯氨酸、甜菜堿和抗氧化酶活測定：用200 mmol/L甘露醇處理3周齡野生型和突變體植株3 d后，采用ELISA試劑盒測定脯氨酸、甜菜堿、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等指標(biāo)。

1.2.4 抗逆基因的qRT-PCR檢測 用TRIzol試劑（Invitrogen）提取植物總RNA，用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix kit（TRANSGEN BIOTECH）試劑盒合成cDNA，并稀釋10倍用于下一步試驗。qRT-PCR反應(yīng)體系包括10 μL TransStart-Top-Green-qPCR-SuperMix（TRANSGEN BIOTECH）、10 μmol/L正 向 和 反 向 引 物 和2 μL cDNA稀釋產(chǎn)物。采用熒光定量PCR儀進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增（qTOWER3，Analytikjena，德國）。qRT-PCR反應(yīng)條件為94℃ 30 s；94℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，79℃ 1 s，read plate，44個反應(yīng)循環(huán)；55-99℃， 每0.5℃維持1 s。選擇Act7（AT5G09810）和Tub2（AT5G62690）為內(nèi)參，對目標(biāo)基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。并用2-ΔΔCT方法計算抗逆基因的相對表達(dá)量，用-ΔΔCT方法計算AtSCL4在突變體中的表達(dá)情況，qRT-PCR的引物見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.5 基因序列號 本文的序列數(shù)據(jù)可以在擬南芥信息資源（http://www.arabidopsis.org/）中找到下列基因序列號：AtSCL4（AT5G66770）、ATMYB61（AT1G09540）、P5CS1（AT2G39880）、BADH（AT3G48170）、SOD1（AT1G08830）、PER4（AT1G14540）。

2 結(jié)果

2.1 AtSCL4受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法分析AtSCL4是否受滲透脅迫所誘導(dǎo)（圖1），與未處理對照相比，甘露醇脅迫下，AtSCL4在根和葉中的表達(dá)量明顯升高，在葉片中的表達(dá)水平隨處理時間變化逐漸升高并在12 h時達(dá)到高峰，在根系當(dāng)中在24 h時達(dá)到高峰。結(jié)果表明，AtSCL4受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)明顯。

圖1 甘露醇處理下AtSCL4基因在不同時間段的表達(dá)分析Fig. 1 Expression profiles of AtSCL4 at different times in response to mannitol stress

2.2 AtSCL4負(fù)向調(diào)控植物應(yīng)對滲透脅迫的耐受性分析

運用qRT-PCR的方法驗證篩選出的AtSCL4擬南芥純和突變體（圖2），KO1-KO8株系的表達(dá)量均低于野生型對照，說明T-DNA的插入阻礙了AtSCL4的表達(dá)，并且KO1、KO6和KO8株系中AtSCL4的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），被用作后續(xù)試驗。

圖2 AtSCL4在突變體中的表達(dá)量分析Fig. 2 Expression analysis of AtSCL4 in mutants

比較野生型擬南芥（WT）和AtSCL4突變體株系（KO1、KO6、KO8）在滲透脅迫下種子的萌發(fā)和生長情況（圖3）。在正常條件下，WT和AtSCL4突變體株系的幼苗萌發(fā)、生長表型、根長和鮮重沒有差異，但在甘露醇脅迫下，KO植株幼苗發(fā)芽率、根長和鮮重顯著高于WT（圖3）。結(jié)果顯示，敲除AtSCL4提高擬南芥應(yīng)對滲透脅迫的耐受性。

圖3 滲透脅迫下AtSCL4調(diào)控苗的萌發(fā)和生長分析Fig. 3 Analysis of seedling germination and growth regulated by AtSCL4 under osmotic stress

2.3 滲透脅迫下AtSCL4負(fù)向調(diào)控氣孔開度

為了研究AtSCL4是否影響擬南芥的蒸騰作用，測定不同株系葉片的失水率。滲透條件下WT的失水率顯著高于KO植株（圖4-A），KO植株表現(xiàn)出更強的保水能力。由于水分損失與氣孔開度關(guān)系密切，因此對葉片氣孔開度進(jìn)行了測定。在正常條件下，WT和KO植株的氣孔開度沒有明顯差異。但在甘露醇脅迫下，與野生型相比，KO不同植株的氣孔孔徑顯著減?。▓D4-B、C）。結(jié)果表明，AtSCL4可能通過負(fù)向調(diào)控氣孔開度和葉片水分蒸騰來提高植物的抗?jié)B透脅迫能力。進(jìn)一步測定與調(diào)節(jié)氣孔孔徑有關(guān)的AtMYB61的表達(dá)情況。正常情況下，不同株系間AtMYB612的表達(dá)無顯著差異（圖4-D）。當(dāng)植物暴露于甘露醇脅迫時，與WT相比，KO株系中AtMYB61的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)（圖4-D），表明在滲透脅迫下AtSCL4可能負(fù)向調(diào)控AtMYB61的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)氣孔開放度。

圖4 滲透脅迫下AtSCL4調(diào)控苗的氣孔開放度分析Fig. 4 Stomatal aperture assay of seedlings regulated by AtSCL4 under osmotic stress

2.4 滲透脅迫下AtSCL4負(fù)向調(diào)控滲透物質(zhì)的積累

為了確定AtSCL4是否能調(diào)節(jié)植物滲透物質(zhì)的合成而應(yīng)對逆境脅迫，測定脯氨酸和甜菜堿的含量。與野生型相比，KO株系在甘露醇脅迫下顯著提高了脯氨酸和甜菜堿的含量（圖5-A、B）。隨后，測定了一個脯氨酸生物合成基因（P5SC1）和一個甜菜堿生物合成基因（BADH）在不同株系的表達(dá)量，甘露醇脅迫下，P5SC1和BADH在KO植株中顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，AtSCL4可能負(fù)向調(diào)節(jié)脯氨酸和甜菜堿代謝基因，促進(jìn)滲透物質(zhì)積累，從而提高AtSCL4突變體對滲透脅迫的耐受性。

圖5 滲透脅迫下AtSCL4調(diào)控苗滲透物質(zhì)合成分析Fig. 5 Synthesis analysis of osmolyte in seedlings mediated by AtSCL4 under osmotic stress

2.5 滲透脅迫下AtSCL4負(fù)向調(diào)控ROS清除能力

通過NBT和DAB染色法測定葉片中O2-·和H2O2的含量。發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，野生型和突變體植株葉片經(jīng)NBT和DAB染色后沒有差異（圖6-A、B）。然而，甘露醇脅迫下，野生型葉片的顏色明顯比突變體深，表明AtSCL4突變體株系的O2-·和H2O2含量顯著降低。此外，為測定不同植株對活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除能力，分別測定植株P(guān)OD和SOD活性。在甘露醇脅迫下，KO植株的SOD和POD活性顯著高于WT植株（圖6-C、D）。同時，進(jìn)一步測定SOD基因（AtSOD1）和POD基因（PER4）在不同植株中表達(dá)情況。在甘露醇脅迫下，AtSOD1和PER4在KO植株中顯著上調(diào)（圖6-E、F）。以上結(jié)果表明，滲透脅迫下AtSCL4對SOD和POD基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

圖6 滲透脅迫下AtSCL4調(diào)控苗活性氧清除能力分析Fig. 6 ROS scavenging capacity assay of seedlings regulated by AtSCL4 under osmotic stress

3 討論

植物遭受逆境脅迫的時候，易引起氣孔的關(guān)閉而減少因蒸騰作用造成葉片水分缺失的情況。Zhang等［17］研究發(fā)現(xiàn)毛果楊PtrWRKY75過表達(dá)可減小氣孔開放度而提高植株抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，應(yīng)對滲透脅迫，AtSCL4突變植株減小氣孔孔徑以防止葉片水分損失。前期報道發(fā)現(xiàn)擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB61能夠調(diào)控氣孔開度［18］，本研究發(fā)現(xiàn)滲透脅迫下，AtMYB61在AtSCL4突變植株中顯著上調(diào)表達(dá)，所以推測AtSCL4可能負(fù)調(diào)控AtMYB61的表達(dá)，控制氣孔關(guān)閉，減少水分流失，但后期還需要結(jié)合更多的方法驗證這一結(jié)論。

植物受到滲透脅迫，一些調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿）就會被誘導(dǎo)合成以適應(yīng)脫水脅迫［19］。脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿可以保護(hù)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)免受非生物脅迫的傷害［20］。Yuan等［14］發(fā)現(xiàn)山葡萄轉(zhuǎn)錄因子VaPAT1正調(diào)控脯氨酸和可溶性糖積累，增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性、耐旱性和耐鹽性。P5CS和BADH分別編碼脯氨酸和甜菜堿生物合成的關(guān)鍵酶［21-22］，本研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸和甜菜堿在AtSCL4突變植株中顯著富集，且P5SC1和BADH在KO植株中上調(diào)表達(dá)明顯。結(jié)果表明，AtSCL4可能通過負(fù)調(diào)控脯氨酸和甜菜堿代謝基因的表達(dá)，進(jìn)而影響脯氨酸和甜菜堿生物合成，而調(diào)控植物的抗?jié)B透脅迫能力。

ROS清除對植物耐受非生物脅迫具有重要意義。非生物脅迫下，植物易積累大量的活性氧而引起植物損傷和突變、阻礙代謝功能和造成細(xì)胞死亡［23］。本研究發(fā)現(xiàn)AtSCL4可能負(fù)調(diào)控AtSOD1和PER4的表達(dá)，提高SOD和POD活性，增強植物對活性氧的清除能力，從而提高其抗?jié)B透脅迫能力，該研究結(jié)果與Wang等［24］研究類似。

4 結(jié)論

滲透脅迫下，AtSCL4可能負(fù)向調(diào)控AtMYB61、P5SC1、BADH、AtSOD1和PER4等基因的表達(dá)，而減小氣孔開度、增加滲透物質(zhì)（脯氨酸、甜菜堿）合成和提高抗氧化酶（SOD和POD）活性，提高植物抗?jié)B透能力。