氧化石墨烯對擬南芥生長的促進作用

高聰 蕭楚健 魯帥 王蘇蓉 袁卉華 曹云英

（南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226019）

納米材料具有優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)特性，在材料學(xué)、微納加工、能源、生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［1］。石墨烯是目前常用的一種碳納米材料。氧化石墨烯（GO）是石墨烯的氧化物，也是一種碳納米材料，因其含氧官能團增多而使其性質(zhì)較石墨烯更加活潑。

碳納米材料已拓展至農(nóng)業(yè)，它能影響植物生長和發(fā)育的過程及其生長的環(huán)境［2-5］。研究表明，它對植物生長有促進作用。如石墨烯碳納米材料能促進植物呼吸和根系生長，減少氨的揮發(fā)，提高產(chǎn)出率、保障安全生產(chǎn)等［6］。在肥料中添加石墨烯碳納米材料能提升肥料利用率、促進種子發(fā)芽和農(nóng)作物生長［7］。但是，也有納米材料抑制植物生長等負面影響的報道。如一定濃度的納米材料可降低發(fā)芽率、抑制植物生長甚至導(dǎo)致植物枯萎死亡；抑制蛋白質(zhì)合成和細胞分裂甚至導(dǎo)致植物基因水平的損傷，對植物造成毒性效應(yīng)［8］。還有研究報道納米材料對植物生長的影響效果和處理濃度之間關(guān)系密切，不同濃度的處理可能產(chǎn)生截然不同的結(jié)果［6-9］。

目前，納米材料對植物生長影響的研究還處在初始階段，許多結(jié)論還不完善和統(tǒng)一，GO在植物方面的報道更少。擬南芥是一種模式植物，其生長周期短。本研究選用GO納米材料，設(shè)置不同GO濃度培養(yǎng)擬南芥，測定其主根長和側(cè)根數(shù)等形態(tài)指標(biāo)，以明確其影響效果與GO處理濃度的關(guān)系，確定促進生長的最適宜濃度。進一步分析擬南芥幼苗中超氧陰離子自由基（O2·-）的產(chǎn)生、超氧化物歧化酶（SOD）活性和根系活力等生理指標(biāo)，再分析其對擬南芥根生長相關(guān)的基因表達情況，進一步明確納米材料GO對植物生長的影響及其內(nèi)在機制，為其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為擬南芥野生型（Col-0），種子用70%乙醇和20%漂白劑進行表面消毒，無菌水清洗后將其點在方形培養(yǎng)皿（10 cm×10 cm）中萌發(fā)（滅菌的1/2 MS固體培養(yǎng)基，含有0.8%瓊脂和1%蔗糖）。將10 g氧化石墨烯（GO）粉末溶解于1 L去離子水中，并滅菌。將超聲處理1 h的GO溶液與滅菌的1/2 MS培養(yǎng)液混合，形成GO濃度分別為0、20、50、100和200 μg/mL的培養(yǎng)基（下文簡稱GO/MS培養(yǎng)基）。在各培養(yǎng)基上分別播種30-40粒種子，重復(fù)3次，4℃放置2 d，然后轉(zhuǎn)至20℃/22℃，16 h（晝）/8 h（夜）的光周期和100 μmol/（m2·s）的光照強度下的人工氣候室（全友，南京）中生長。

1.2 方法

1.2.1 GO的形貌表征 首先在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼好導(dǎo)電膠，然后將干燥好的GO貼在導(dǎo)電膠上，在電流約為4 mA條件下將樣品噴金30-40 s。在15 kV加速電壓下，用掃描電子顯微鏡（SEM，ZEISS Gemini SEM 300）觀察GO的表面形態(tài)，并拍照。

將GO分散到水中，超聲分散30 min，取5 μL滴加到鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干后用透射電子顯微鏡（TEM，Talos F200X）觀察GO納米結(jié)構(gòu)。

通過傅里葉紅外光譜法（FTIR，TENSOR 27紅外光譜儀）對GO進行表征。FTIR測定紅外光譜波數(shù)范圍為500-4 000 cm-1。

1.2.2 主根長和側(cè)根數(shù)的觀察 對生長在不同濃度GO/MS培養(yǎng)基中6 d的擬南芥植株進行拍照，并使用ImageJ 1.53軟件測量主根長。對生長11 d的擬南芥植株進行拍照（為便于保存，拍攝時已通過2.5%戊二醛固定），并人工統(tǒng)計其側(cè)根數(shù)。

1.2.3 主根根尖各部分大小的分析 對生長在不同濃度GO/MS培養(yǎng)基中4 d的擬南芥主根進行碘化丙啶（propidium iodide，PID）染色，用激光共聚焦顯微鏡（Leica，SP8）拍攝其根部的不同區(qū)域，再用ImageJ 1.53軟件測量分生區(qū)、伸長區(qū)、根尖直徑和根冠大小。

1.2.4 O2·-、SOD活性和根系活力的測定 采用四硝基氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）和氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）染色法分別進行O2·-和根系活力的測定，所有的樣品均處理6 d。O2·-的測定是將擬南芥幼苗放在含1% NBT的20 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液中，抽真空后用蒸餾水洗去染液，用70%乙醇溶液90℃脫色20 min，然后用立體顯微鏡（Leica，S8AP0）觀察并拍攝，擬南芥幼苗著色的深淺來表示O2·-產(chǎn)生的多少。根活力的測定是將根浸在2%TTC染液中，37℃放置5 h，立體顯微鏡觀察并拍攝。根著色深淺表示根活力的高低。采用WST法測定SOD活性，樣品的提取及測定參照試劑盒（建成，南京）的說明書來進行。

1.2.5 根生長相關(guān)基因表達 以生長在1/2 MS（含有GO濃度為0和50 μg/mL）培養(yǎng)基中的擬南芥為基因表達分析材料，分別選取6及11日齡的擬南芥用于分析其主根和側(cè)根生長相關(guān)基因的表達。樣品經(jīng)液氮研磨，用TRIZOL法提取總RNA，利用cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以ACT2（At3g18780）為內(nèi)參基因，參照Cao等［10］方法，通過熒光定量PCR分析其基因表達水平，具體引物序列見表1。

表1 熒光定量表達分析用的引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescence quantitative expression analysis

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS20.0和origin進行統(tǒng)計分析和作圖。采用Ducan檢驗法統(tǒng)計差異。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 GO的表征

從圖1-A可以看出，GO呈膨脹狀態(tài)，由多個片層疊加而成，表面顯示有褶皺，原因主要是多層GO疊加之后及自然狀態(tài)下單層GO為保證狀態(tài)的穩(wěn)定而自動成為褶皺結(jié)構(gòu)。超聲后的GO以單片層或少數(shù)幾層疊加的形式存在（圖1-B），其特征峰出現(xiàn)在波長3 237（O-H的伸縮振動）、1 712（酯C=O的伸縮振動）和1 041 cm-1（C-O的伸縮振動），均為GO的含氧官能團（圖1-C）。

圖1 GO的表征圖Fig.1 Characterization of GO

2.2 不同GO處理濃度對擬南芥生長的影響

不同濃度GO培養(yǎng)擬南芥6 d后，與對照相比，經(jīng)GO處理的擬南芥主根長均明顯增長，分別提高了4.6%、43.0%、31.7%和30.5%（圖2），其 中，經(jīng)50 μg/mL GO濃度處理的擬南芥主根最長，約為26.5 mm（圖2-A）。隨GO處理濃度的增加，根長呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，先升高，于50 μg/mL GO濃度時達到最高，隨后又逐漸降低（圖2-B）。表明GO對擬南芥主根的生長有促進作用，但作用效果與處理濃度有關(guān)，適宜的濃度效果最好，過高或過低都會降低其效果。因此，促進擬南芥主根生長的GO適宜處理濃度約為50 μg/mL。

圖2 不同濃度GO處理對擬南芥主根生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GO on the taproot growth of A. thaliana

不同濃度GO培養(yǎng)擬南芥11 d后，觀測其側(cè)根的生長情況（圖3）。與對照相比，200 μg/mL高濃度處理和20 μg/mL低濃度處理會抑制側(cè)根數(shù)的形成，分別比對照減少了20.2%和24.0%；而50 μg/mL中等濃度處理卻能夠顯著增加側(cè)根數(shù)，約增加了27.1%；另外，100 μg/mL濃度處理則無顯著變化。表明不同濃度的GO對擬南芥生長可能會產(chǎn)生促進、抑制和無效3種情況，在一定程度上解釋了前人不同試驗結(jié)論的原因，不同濃度處理可以產(chǎn)生完全不同的結(jié)果。和主根一樣，促進側(cè)根生長的適宜濃度約為50 μg/mL。

圖3 不同濃度GO處理對擬南芥?zhèn)雀L的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GO on the lateral root growth of A. thaliana

2.3 GO對擬南芥根系生長的促進作用

用50 μg/mL GO濃度培養(yǎng)擬南芥，測定其形態(tài)和生理生化等指標(biāo)，進一步探討GO促進根系生長的內(nèi)在機制。

2.3.1 GO對擬南芥根區(qū)不同部位生長的影響 50 μg/mL GO濃度培養(yǎng)擬南芥4 d后，測量其根尖不同區(qū)域的長度，發(fā)現(xiàn)GO處理后的擬南芥主根分生區(qū)和伸長區(qū)的長度顯著增加，但根尖直徑和根冠長度并無顯著變化（圖4）。表明GO主要是通過分生區(qū)和伸長區(qū)而促進根系生長。

圖4 不同濃度GO對擬南芥主根各部位的影響 Fig.4 Effects of different concentrations of GO on the different parts of taproot of A. thaliana

2.3.2 GO對擬南芥超氧陰離子自由基、SOD活性和根系活力的影響 通過TTC和NBT對組織進行染色，進一步分析GO處理對擬南芥幼苗中的超氧陰離子自由基O2·-水平和根系活力造成的影響（圖5）。TTC染色法是常用的鑒定根系活力的方法。在GO/MS培養(yǎng)基中生長6 d擬南芥的主根經(jīng)TTC染色，發(fā)現(xiàn)50 μg/mL GO處理植株的顏色明顯深于對照組，組織著色越深表明根系活力越強；反之，根系活力越弱。表明適宜的GO濃度可以提高擬南芥的根系活力。

經(jīng)50 μg/mL GO處理的擬南芥幼苗顏色較淺（圖5-C和圖5-D），而對照植株的顏色相對較深。表明適宜的GO濃度處理提高了擬南芥幼苗中SOD的酶活性，從而減少了超氧陰離子自由基水平。

此外，通過WST法對SOD活性進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)50 μg/mL GO處理的擬南芥幼苗的SOD活性顯著高于對照，其活性約增加43.6%（圖5-E）。這印證了NBT的染色結(jié)果。

圖5 不同濃度GO處理后擬南芥的組織染色及SOD活性的定量分析Fig.5 Tissue staining and SOD activity quantitative analysis of A. thaliana treated with different concentrations of GO

2.3.3 GO對擬南芥根生長相關(guān)基因表達的影響 對不同濃度GO處理下擬南芥根相關(guān)基因的表達檢測（圖6）。與對照相比，ADC1和DAR2的表達量下調(diào)，而ERFII-1的表達量則變化不大，IQM3的表達量上調(diào)，且達到顯著水平。表明在GO的影響下，可導(dǎo)致ADC1和DAR2下調(diào)和IQM3上調(diào)，進而促進了根長的增加。

圖6 不同濃度GO處理對擬南芥根生長相關(guān)基因的表達Fig.6 Effects of different concentrations of GO on the gene expressions related to root growth in A. thaliana

與對照相比，側(cè)根生長相關(guān)的基因ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表達量在GO處理后都表現(xiàn)為顯著上調(diào)，分別增加了150.0%、51.0%、312.0%和83.0%，CKX1的表達量則沒有明顯改變。表明適宜濃度GO處理可使ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表達量上調(diào)，進而促進了側(cè)根數(shù)量的增加。

3 討論

3.1 不同GO濃度處理對植物生長的影響分析

本研究結(jié)果表明，在20-200 μg/mL濃度處理范圍內(nèi)，隨著GO濃度的增加，對擬南芥主根長均表現(xiàn)為促進作用，20 μg/mL處理促進作用不明顯，但隨著濃度增加促進效果增強，到50 μg/mL時促進作用達到最大，然后隨濃度升高促進效果下降，但50-200 μg/mL濃度促進作用均達到顯著水平；GO對側(cè)根生長的影響則是20 μg/mL低濃度處理和200 μg/mL高濃度處理均會抑制側(cè)根數(shù)的形成，而50 μg/mL中等濃度處理卻能夠顯著增加側(cè)根數(shù)。如果將抑制作用理解為促進作用的負增長，則GO影響主根和側(cè)根生長的濃度響應(yīng)趨勢非常類似，先是隨著處理濃度升高而促進作用效果增加，達到一個峰值后濃度增加而其效果則下降。無論是主根還是側(cè)根，50 μg/mL濃度處理促進生長的效果最好。本研究明確了GO處理對擬南芥生長的影響，但作用效果與處理濃度顯著相關(guān)，不同的處理濃度可能會產(chǎn)生促進或抑制完全相反的2種效果。本研究中，GO處理對主根生長沒有產(chǎn)生抑制效果，可能是由于濃度范圍設(shè)置過窄，沒有達到抑制主根生長的處理濃度，根據(jù)處理產(chǎn)生的效果趨勢，如果繼續(xù)增加處理濃度，很可能會出現(xiàn)抑制主根生長的處理效果，有待進一步試驗驗證。

Park等［9］也證實了GO可促進擬南芥的生長，但其試驗濃度和效應(yīng)與本研究結(jié)果不一致。認為GO濃度為0.1 μg/mL時可促進擬南芥葉面積的增加，在0.1-1.0 μg/mL范圍內(nèi)可促進開花的數(shù)量，但對根的長度沒有影響。造成這種差異的原因可能是不同器官對GO處理的響應(yīng)濃度不同，根系需要更高的濃度處理。Park等［9］的GO處理最高濃度僅為1.0 μg/mL，可促進花和葉的生長，卻不能影響根的生長。本研究增加處理濃度，可以明顯看到GO處理對根系生長的影響。所以，同一植物的不同器官對GO處理的響應(yīng)濃度是不一樣的。

GO對植物的影響，還與植物的種類有關(guān)，不同種類的作用效果和響應(yīng)濃度不同。有研究表明，經(jīng)5和50 mg/L的石墨烯處理的水稻根長與對照組并無明顯差異，而在100和200 mg/L的處理中則表現(xiàn)為抑制，沒有顯示石墨烯處理對其生長的促進作用［11］。另有研究表明，10 μg/mL的GO處理促進了西瓜的生長，增加了其周長，并能增強植物的穩(wěn)定性［9］，與本研究結(jié)果相比，促進西瓜生長的GO處理濃度要低。

3.2 GO促進植物生長的內(nèi)在機制

本研究結(jié)果表明，50 μg/mL GO處理促進擬南芥根系生長的效果最好，因而在此濃度下對擬南芥進行處理，測定了形態(tài)和生理生化等指標(biāo)，探討GO促進植物生長的內(nèi)在機制。

3.2.1 GO促進擬南芥根系生長的作用部位 對GO處理的擬南芥的主根根尖的不同區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)根尖分生區(qū)和伸長區(qū)的長度顯著增加，而根尖直徑和根冠長度并無顯著變化。表明GO主要影響了根尖分生區(qū)和伸長區(qū)的長度。但是擬南芥根系表型受多個因素的影響，根尖分生區(qū)和伸長區(qū)長度的增加只是其中一個外在表現(xiàn)，內(nèi)在因素可能涉及根活性、根的抗氧化性或基因表達等，都可能成為影響擬南芥根長和側(cè)根數(shù)變化的因素。

3.2.2 GO促進擬南芥根系生長的生理機制 正常情況下，生物體內(nèi)會生成O2·-，過量的O2·-會造成細胞損傷，SOD酶的作用可以清除O2·-，對維持機體氧化與抗氧化平衡具有重要意義，這也是評價植物體健康程度的重要指標(biāo)。根是植物固定植株和吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，根活力的高低是反映根系生長代謝旺盛的重要指標(biāo)。本研究中經(jīng)50 μg/mL GO處理的擬南芥，NBT染色后植物體的顏色與對照相比較淺，表示植物體產(chǎn)生的超氧陰離子自由基O2·-減少，即SOD的活性被提高，同時也對SOD進行了定量分析，結(jié)果與其一致；TTC染色后顯示的顏色與對照相比較深，表示GO處理提高了其根系活力。這表明50 μg/mL GO處理對擬南芥的SOD酶活性和根系活力均起到提高的作用。有研究報道水稻經(jīng)50-200 μg/mL的石墨烯處理，發(fā)現(xiàn)其SOD的活性逐漸提升，而在100-200 μg/mL的處理中根長則表現(xiàn)為抑制［11］。這與張鵬［12］和Paramo等［13］結(jié)論基本一致，都證明植物在低濃度GO下能增加SOD的活性，而高濃度GO會抑制SOD的活性。Zhang等［14］的研究也發(fā)現(xiàn)30 μg/mL銀納米顆粒會引起擬南芥活性氧的積累和光合作用的破壞。這也從另一方面反映，同一濃度石墨烯處理的同一作物所表現(xiàn)的影響不一致，即同一濃度可能對根長有積極影響，但是在其他的生理生化指標(biāo)上卻表現(xiàn)為消極影響。

3.2.3 GO促進擬南芥根系生長的分子機制 外部環(huán)境因素改變后，植物除了生理機制受到影響，基因表達也會發(fā)生改變。根據(jù)前人研究，本實驗選擇了與根系發(fā)育相關(guān)的基因進行了表達分析，主要有影響根長的基因ADC1［15］和DAR2［16］，影響側(cè)根的基因ARF7［17］、ARF19［17］和CKX1［18］及同時影響根長和側(cè)根的基因ERFII-1［19］和IQM3［20］。在擬南芥中，ADC1可以影響多胺的合成，而多胺具有調(diào)節(jié)根長的作用［15］；DAR2可以與多種激素聯(lián)合，進而影響根系分生組織的發(fā)育［16］；ERFII-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，也受到激素的調(diào)節(jié)，從而影響根的發(fā)育［19］；IQM家族屬于具有IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族，IQM3參與植物根系發(fā)育的調(diào)控［20］；ARF7/ARF19在生長蛋白介導(dǎo)的植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用［17］；CKX1的過表達會引起芽生長發(fā)育不良、頂端優(yōu)勢下降和根生長增強［18］。

研究表明碳納米材料是可以影響植物基因表達的，如GO通常通過氫鍵的形成和π-π堆積相互作用與細胞內(nèi)的小分子結(jié)合，并以此影響基因的表達或其他生理生化效應(yīng)［21-22］。根據(jù)基因表達情況，結(jié)合植物表型特征，有利于解釋在碳納米材料影響下植物體的調(diào)控方式。本研究結(jié)果表明，50 μg/mL GO處理后基因ADC1和DAR2表達下調(diào)以及IQM3的表達上調(diào)，從而促進了根長的增加；ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表達顯著上調(diào)，從而促進了側(cè)根數(shù)量的增加。值得注意的是，IQM3在根長和側(cè)根的調(diào)控過程中均顯著上調(diào)，而ERFII-1在側(cè)根數(shù)的形成中作用比較大，表明IQM3和ERFII-1在對根系發(fā)育的調(diào)控中可能起著重要的作用。

GO對植物的影響是多方面的，且同一碳納米材料處理在物種間的差異較大。雖然GO能促進植物生長，其對細胞的毒性仍然需要考證，包括GO對生物生命周期的影響、納米材料轉(zhuǎn)移對生態(tài)環(huán)境的影響等。想要應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中仍需大量試驗證明碳納米材料安全性、可靠性和可行性，并探明GO對植物的作用機制。在本研究中，展示了GO對擬南芥生長的綜合提升，適宜 GO 處理使主根根尖的分生區(qū)和伸長區(qū)長度增加，根系活力提高， SOD 活性增加使O2·-的產(chǎn)生減少，與激素、多胺相關(guān)影響根系生長的基因表達發(fā)生變化，從而促進根系的生長（圖 7）。本研究確定了促進擬南芥生長的GO濃 度，展現(xiàn)了GO應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的巨大潛力。

圖7 GO對擬南芥根系生長的可能的作用機理Fig.7 Possible mechanism of GO on the growth of A. thaliana

4 結(jié)論

GO是一種重要的碳納米材料，能促進擬南芥根系生長，但作用效果和處理濃度顯著相關(guān)。在本試驗條件下，50-200 μg/mL處理顯著促進擬南芥主根的伸長；50 μg/mL濃度處理顯著促進擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)的形成，但20 μg/mL低濃度處理和200 μg/mL高濃度處理會抑制側(cè)根數(shù)的形成。