一種抗仔豬產(chǎn)毒大腸桿菌卵黃抗體的制備及效果評(píng)價(jià)

劉光輝

（濱州職業(yè)學(xué)院，山東 濱州 256603）

1周齡內(nèi)仔豬因其腸道內(nèi)尚未建立穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，自身抵抗力較低，對(duì)外界環(huán)境刺激敏感，易受各種病原微生物的侵襲和各種應(yīng)激因素的影響[1]。引起仔豬腹瀉的傳染性因素主要是指傳染性病原，有病毒性和細(xì)菌性。而細(xì)菌性腹瀉主要是由大腸桿菌引起，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌，主要發(fā)生于 1周齡內(nèi)仔豬，以 1～3日齡最為常見，發(fā)病率和死亡率均很高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大損失[2]。卵黃抗體（lmmunoglobulin of yolk，IgY）是一種從免疫禽類后，從禽蛋中提取的特異性杭體，蛋雞免疫后一個(gè)月內(nèi)可獲得的IgY抗體量是免疫兔子的18倍[2]，因此，制備一種除疫苗之外的生物制品，并且即簡單經(jīng)濟(jì)，又能夠快速獲得足量抗體效價(jià)使機(jī)體免受感染或獲得最大保護(hù)，卵黃抗體無疑是一種良好的選擇[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛋雞 采用仔豬大腸桿菌 K88、K99雙價(jià)基因工程活疫苗免疫SPF蛋雞。

1.1.2 免疫抗原 采用當(dāng)?shù)刈胸i大腸桿菌性腹瀉發(fā)病豬腸道分離物、腸毒素及黏附性菌毛蛋白混合成免疫原對(duì)SPF蛋雞進(jìn)行免疫。

1.1.3 提取復(fù)合含卵黃抗體 在免疫過程中喂食屎腸球菌Anp01（Enterococcus faecium Anp 01）及中藥混合物[5]，提高被免疫雞的免疫力，然后收集其所產(chǎn)雞蛋，從其蛋黃中提取抗仔豬大腸桿菌性腹瀉復(fù)合卵黃抗體。

1.2 方法

1.2.1 免疫原制備 采用本地的患仔豬大腸桿菌性腹瀉或流行性腹瀉比較嚴(yán)重的仔豬進(jìn)行時(shí)捕殺，取出小腸組織剪碎、研磨，用于提取和純化，加 0.01MPBS（pH7.5）稀釋，反復(fù)凍融，離心，取上清液加入6 % PEG-6000和2 % NaCl，放置后再離心，將沉淀重懸于PBS中，離心后取上清液進(jìn)行超速離心。將沉淀重懸于PBS中，即為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、腸毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原。

1.2.2 對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫 用上述制備的免疫原對(duì) SPF產(chǎn)蛋雞進(jìn)行肌肉免疫。程序?yàn)椋喝?18～20周齡的 SPF蛋雞，飼喂一周后，進(jìn)行首次免疫，所述的免疫的方法為：免疫雞分別分點(diǎn)注射仔豬大腸桿菌病 K88、K99雙價(jià)基因工程活疫苗及混合免疫原，在首次免疫后第 14天、第 28天、第56天分別進(jìn)行2次免疫和3、4次免疫，所述的首次免疫、2次免疫和3、4次免疫的處理方法相同，首免和第 2次免疫，分別注射仔豬大腸桿菌病 K88、K99雙價(jià)基因工程活疫苗及混合免疫原1 ml；再隔2周進(jìn)行第3次免疫，注射疫苗及混合免疫原2 ml；再隔4周后進(jìn)行第4次免疫，分別注射疫苗及混合免疫原4 ml。

1.2.3 添加屎腸球菌Anp01及中藥混合物 免疫雞在飼喂過程中添加屎腸球菌 Anp01（添加量0.1 %）及中藥混合物，中藥混合物組成為：生黃芪 15 g、銀花 15 g、柴胡 10 g、黃芩 10 g、板蘭根 15 g、貫仲 15 g、蒼術(shù) 10 g、生苡仁 15 g、防風(fēng) 10 g、生甘草 5 g、藿香 10 g，粉碎飼喂，添加量為10 %，以提高免疫雞群機(jī)體免疫力。

1.2.4 卵黃抗體分離提純 首免 6周后收集所產(chǎn)雞蛋，經(jīng) 75 % 酒精消毒后，用卵黃分離器分離出卵黃，與等量 PBS混合后勻漿，聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法提純卵黃抗體；所述用聚乙二醇（PEG-6 000）沉淀法提純的程序?yàn)椋阂来畏謩e用3.5 % PEG-6000、8.5 % PEG-6000、12 %PEG-6000對(duì)卵黃抗體沉淀 3次，最后用預(yù)冷的50 % 乙醇進(jìn)一步沉淀，收集上液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，所得為純化后的仔豬大腸桿菌性腹瀉抗體IgY。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵黃抗體的制備結(jié)果

實(shí)驗(yàn)制備抗仔豬產(chǎn)毒大腸桿菌卵黃抗體要求純度≥95 %，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定卵黃抗體效價(jià)≥1:64。

2.2 卵黃抗體對(duì)仔豬死亡率的影響

取 1日齡未吃初乳仔豬 12頭，隨機(jī)分成 4個(gè)小組，分別為攻毒治療組（4頭），攻毒不治療組（4頭），不攻毒治療組（2頭），不攻毒不治療組（2頭）。攻毒所用菌株為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）10倍稀釋，給攻毒組 0.2 ml/頭直接口服，治療所用卵黃抗體為提純樣品，同樣口服飼喂 2 ml/d，對(duì)照組飼喂頻次數(shù)量相等的生理鹽水，根據(jù)各組臨床癥狀及死亡率及糞便情況來判斷TGEV卵黃抗體的治療效果。

攻毒治療組、不攻毒治療組合和對(duì)照組仔豬生長正常，飼喂卵黃抗體與否對(duì)其生長沒有影響，沒有出現(xiàn)死亡，攻毒不治療組 4 d內(nèi)全部死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 4組實(shí)驗(yàn)仔豬攻毒后死亡對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.3 卵黃抗體對(duì)仔豬攻糞便的影響

攻毒治療組在攻毒后 1～3 d出現(xiàn)輕度腹瀉，第 4天以后恢復(fù)正常，攻毒不治療組仔豬均出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉癥狀，表現(xiàn)為黃色水瀉，仔豬迅速消瘦脫水，而卵黃抗體治療組第 2天仔豬腹瀉癥狀則明顯減輕，排泄出的糞便自黃色稀便轉(zhuǎn)變?yōu)轲こ碥洷悖?周后逐漸恢復(fù)，未出現(xiàn)死亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 4組實(shí)驗(yàn)仔豬攻毒后糞便對(duì)比實(shí)驗(yàn)

3 討論

仔豬細(xì)菌性腹瀉具有較強(qiáng)的傳染性，并且仔豬感染后死亡率比較高，是養(yǎng)豬業(yè)比較棘手的問題。當(dāng)仔豬感染產(chǎn)腸毒素大腸桿菌后，仔豬的小腸黏膜受損嚴(yán)重，直接影響機(jī)體對(duì)營養(yǎng)的消化吸收，如果不能第一時(shí)間得到治療，常因劇烈水樣腹瀉和代謝性酸中毒而死亡。此類疾病必須盡早治療，以確保達(dá)到預(yù)期效果[6]。

卵黃抗體制劑為雞的免疫球蛋自，能夠特異性的中和 ETEC致病菌[7]。同時(shí)，添加的屎腸球菌和中藥混合物對(duì)仔豬消化系統(tǒng)有營養(yǎng)和修復(fù)作用。可用于治療臨床上由 ETEC感染導(dǎo)致的仔豬腹瀉，對(duì)于末感染的仔豬可以起到積極的預(yù)防和保護(hù)作用，有助于第一時(shí)間改善仔豬發(fā)病狀況。

4 結(jié)論

制備的仔豬產(chǎn)毒大腸桿菌卵黃抗體可有效預(yù)防和治療仔豬產(chǎn)毒大腸桿菌感染，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。