絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染患者腸道菌群特征及濯淋顆粒的干預(yù)作用

朱美鳳朱鶯王身菊張玲萬冰瑩陳岱*周春祥

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)常州附屬醫(yī)院，江蘇 常州213003； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院，江蘇 常熟215500； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210046）

復(fù)發(fā)性尿路感染是指半年內(nèi)發(fā)作≥2次，或1 年內(nèi)發(fā)作≥3 次的尿路感染，具有反復(fù)發(fā)作、難以根治的特點(diǎn)。絕經(jīng)期女性隨著年齡的增長，泌尿生殖系統(tǒng)逐漸發(fā)生退行性變和功能減退，發(fā)生復(fù)發(fā)性尿路感染的風(fēng)險(xiǎn)增加［1-2］。抗菌藥物預(yù)防已被證明在降低女性復(fù)發(fā)性尿路感染的風(fēng)險(xiǎn)方面有效，但會(huì)誘導(dǎo)致病微生物和本地菌群產(chǎn)生耐藥性［2］。

研究發(fā)現(xiàn)，腸源性細(xì)菌上行是發(fā)生尿路感染的始動(dòng)因素［3-5］。Ghalavand等［3］從63 名癥狀性尿路感染患者的糞便和尿液樣本中分離出糞腸球菌，RAPD-PCR、PFGE 分析顯示分別有26.9%、15.8%的同一個(gè)體成對糞腸球菌之間的分子指紋圖譜模式相同，證實(shí)了腸道內(nèi)定植細(xì)菌污染引起的內(nèi)源性感染；Magruder等［4］報(bào)道，1%腸道大腸桿菌和腸球菌相對豐度是發(fā)生腸桿菌尿路感染和腸球菌尿路感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提出了“腸道菌群-UTI 軸”的觀念。腸道菌群失衡可能與絕經(jīng)期女性發(fā)生復(fù)發(fā)性尿路感染的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但目前尚無揭示絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染患者的腸道菌群特征的報(bào)道。

濯淋顆粒是南京中醫(yī)藥大學(xué)常州附屬醫(yī)院張志堅(jiān)教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有解郁濯淋的功效，對絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染療效確切，能提高肝郁濕熱證復(fù)發(fā)性尿路感染患者治愈率，改善臨床癥狀，降低復(fù)發(fā)率［6］。為此，本研究在前期報(bào)道基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染患者腸道菌群特征，以及濯淋顆粒的干預(yù)作用，以期從腸道微生態(tài)角度探討濯淋顆粒防治復(fù)發(fā)性尿路感染的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2019 年1 月6 月南京中醫(yī)藥大學(xué)常州附屬醫(yī)院腎病科門診治療的16 例絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染患者，隨機(jī)分為中藥組、西藥組，每組8例，同期本院健康體檢人群8 例為健康對照組。研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批件號(hào)2018-LL-02（L）］。

1.2 診斷、納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《尿路感染診斷與治療中國專家共識(shí)（2015 版）——尿路感染抗菌藥物選擇策略及特殊類型尿路感染的治療建議》［7］制定，即尿路感染（尿頻、急、痛中至少存在2 個(gè)癥狀，中段尿培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)≥1.0×105cfu／mL）6 個(gè)月內(nèi)發(fā)作≥2次，或1 年內(nèi)發(fā)作≥3 次。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡45～80 周歲，女性；②生理性絕經(jīng)1 年以上；③符合“1.2.1”項(xiàng)下診斷標(biāo)準(zhǔn)；④近3 個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、微生態(tài)制劑；⑤自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①復(fù)雜性尿路感染；②由真菌、支原體、衣原體、寄生蟲等引起的尿路感染；③合并嚴(yán)重心、肝、腎、造血系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病，以及惡性腫瘤或影響其生存的嚴(yán)重疾病；④精神不健全；⑤3個(gè)月內(nèi)使用過抗生素、微生態(tài)制劑；⑥對本研究藥物過敏；⑦正在參加其他臨床研究。

1.3 治療方法 中藥組口服濯淋顆粒，由烏藥10 g、青皮10 g、木香10 g、川楝子10 g、柴胡10 g、炒梔子10 g、滑石10 g、車前草15 g、瞿麥10 g、赤芍10 g、川斷10 g、桑寄生10 g、甘草3 g 組成，每天1劑，共400 mL，分早、晚2 次開水沖服；西藥組根據(jù)中段尿培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用敏感抗生素口服，包括左氧氟沙星膠囊（揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990051）、頭孢丙烯（揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20061246）、呋喃妥因腸溶片（常州康普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32021349）、法羅培南（魯南貝特制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20060977），常規(guī)劑量口服2 周后，改為每晚1粒，2 組患者均連續(xù)治療4 周。治療前后，檢測患者血常規(guī)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐，進(jìn)行安全性評價(jià)。

1.4 標(biāo)本采集 復(fù)發(fā)性尿路感染組［治療前0～2 d、治療（28±2）d］、健康對照組（入組后）采集糞便標(biāo)本?；颊吲趴招”愫?，準(zhǔn)備好便盆和糞便采集管，洗手，帶上手套收集新鮮的糞便標(biāo)本200～500 mg，放入無菌EP管，做好標(biāo)記，標(biāo)本采集后置于4 ℃冰盒中，30 min 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中凍存待用。采集、運(yùn)送樣本過程嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行。

1.5 糞便DNA 提取、擴(kuò)增及測序 采用E.Z.N.A.糞便DNA 試劑盒（美國Omega Biotek 公司）對樣本基因組DNA 進(jìn)行提取。選擇16 S rDNA 的V3～V4 高變區(qū)作擴(kuò)增和測序目的片段，引物序列為 341F（正 向）CCTACGGGNGGCWGCAG，806R（反 向）GGACTACHVGG GTATCTAAT。PCR 反應(yīng)體系為50 μL 混合物，包括100 ng模板DNA、1 μL KOD 聚合酶、5 μL 10×OD緩沖液、5 μL 2.5 mmol／L dNTPs、1.5 μL 引物（每種5 μL）；PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃10 s，62 ℃30 s，68 ℃30 s，27個(gè)循環(huán)，68 ℃ 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluor TM 熒光劑進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機(jī)測序，純化和定量后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，對照Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋和分類。文庫構(gòu)建與測序工作由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用KW 秩和檢驗(yàn)，R 語言繪制物種累積曲線。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 復(fù)發(fā)性尿路感染組、健康對照組年齡、BMI、絕經(jīng)年限，以及中藥組、西藥組年齡、BMI、絕經(jīng)年限、既往尿路感染發(fā)作次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。治療4 周后，中藥組5 例、西藥組4 例完成糞便采集。見表1～2。

表1 復(fù)發(fā)性尿路感染組、健康對照組一般資料比較（）

表1 復(fù)發(fā)性尿路感染組、健康對照組一般資料比較（）

表2 中藥組、西藥組一般資料比較（， n＝8）

表2 中藥組、西藥組一般資料比較（， n＝8）

2.2 物種累積曲線分析 經(jīng)OTUs 聚類后，從糞便樣品中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)構(gòu)建物種累積曲線以評估抽樣是否充分和糞便樣品的豐富度。結(jié)果顯示，33 個(gè)糞便樣本的曲線急劇上升后趨于平緩，表明抽樣充分，擴(kuò)大樣本量不會(huì)增加新物種，見圖1。

圖1 糞便樣本物種累積曲線

2.3 OTU 分析 復(fù)發(fā)性尿路感染組、健康對照組共有OTUs 為499個(gè)，前者OTU 數(shù)目少于后者（672個(gè)vs858個(gè)），見圖2。OTU 主成分分析顯示，PC1 值為29.00%，PC2 值為11.92%，健康對照組糞便樣品在PCA 圖中的分布相對集中，而復(fù)發(fā)性尿路感染組相對分散，前者相似度高于后者，見圖3。

圖2 腸道菌群Venn圖

圖3 腸道菌群PCA圖

2.4 腸道菌群多樣性分析 復(fù)發(fā)性尿路感染組腸道菌群的sobs 指數(shù)低于健康對照組（702.187 5vs823.875 0）（P＜0.05），提示復(fù)發(fā)性尿路感染患者腸道菌群α 多樣性降低，見圖4。同時(shí)，PCo1、PCo2 分別為31.98%、14.19%，復(fù)發(fā)性尿路感染組、健康對照組在PCoA 圖上各自聚類，又有部分重疊，2 類人群腸道菌群β 多樣性存在顯著差異（P＜0.01），見圖5。

圖4 腸道菌群sobs 指數(shù)

圖5 腸道菌群PCoA圖

2.5 腸道菌群結(jié)構(gòu)變化 見圖6～8、表3。在門分類水平上，①健康對照組主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門＞擬桿菌門＞疣微菌門＞變形菌門，而復(fù)發(fā)性尿路感染組主要優(yōu)勢菌門為擬桿菌門＞厚壁菌門＞變形菌門＞放線菌門，后者擬桿菌門豐度高于前者（P＜0.05），厚壁菌門豐度、厚壁菌門與擬桿菌門比值（F／B）、疣微菌門豐度更低（P＜0.05）；②治療后，中藥組擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門豐度及F／B 升高，而西藥組擬桿菌門、疣微菌門豐度上升，厚壁菌門、變形菌門豐度及F／B 下降；③治療后，2 組腸道菌群相對豐度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 中藥組、西藥組、健康對照組腸道菌群相對豐度比較（%）

圖6 腸道菌群在門水平上分布

圖7 腸道菌群在屬水平上分布

圖8 各組腸道樣品OTU 分布的Venn圖

在屬分類水平上，①健康對照組主要優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬＞Akkermansia＞Phascolarctobacterium＞Dialister，而復(fù)發(fā)性尿路感染組主要優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬＞罕見小球菌屬（Subdoligranulum）＞大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）＞Phascolarctobacterium，后者擬桿菌屬豐度高于前者（P＜0.05），Akkermansia、另枝菌屬（Alistipes）、Dialister、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬豐度更低（P＜0.05）；②治療后，中藥組擬桿菌屬、罕見小球菌屬豐度下降，乳桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌屬豐度上升，而西藥組罕見小球菌屬、乳桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌屬豐度下降；③治療后，2 組腸道菌群相對豐度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

復(fù)發(fā)性尿路感染屬于中醫(yī)“淋證”范疇，臨床證候與肝經(jīng)密切相關(guān)?！鹅`樞·經(jīng)脈》云“是主肝所生病者……遺溺閉癃”。絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染，或因郁致病，或因病致郁，兩者互為因果［8］。情志失和，肝失其用，疏泄失職，氣滯濕阻，溲溺約利失節(jié)；濕熱之邪循經(jīng)下注，濕熱、郁熱膠著，淋證纏綿難愈。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道，糞便移植可以降低復(fù)發(fā)性尿路感染的復(fù)發(fā)率。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群可能是中醫(yī)藥防治絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染的新策略［9-12］。

濯淋顆粒功能解郁、濯淋，在臨床治療絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染取得了良好療效［6］。方中烏藥入厥陰肝經(jīng)，行氣止痛、溫腎散寒，木香性溫、味辛苦，功可行氣止痛，又可理氣健脾；《婦人良方》 云“若肝經(jīng)氣滯，用四君、青皮柴胡”，青皮味苦辛，色清氣烈，主氣滯、破積結(jié)，入肝散結(jié)，柴胡味苦辛，歸肝經(jīng)，疏肝理氣，以柴胡、青皮疏化而利。川楝子苦寒清熱，長于疏肝止痛，梔子性寒、味苦，瀉火除煩、清熱利尿，滑石味甘淡、性平，利尿通淋，車前草、瞿麥具有清熱解毒、利尿；赤芍味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有活血行氣、化瘀通絡(luò)；絕經(jīng)期女性，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，腎精虧虛，加入川斷、桑寄生以補(bǔ)腎，扶正以祛邪。甘草味甘性平，能調(diào)和諸藥。諸藥合用扶正祛邪兼施?，F(xiàn)代藥理已經(jīng)證明，梔子對腸桿菌、腸球菌有較強(qiáng)的抑制作用［13］；車前草種子多糖可以提升小鼠結(jié)腸菌群多樣性，擬桿菌屬、真桿菌屬、Butyrivibrio sp.、雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌屬、羅伊氏乳桿菌屬豐度［14］；甘草總皂苷可以提高肝損傷大鼠腸道菌群乳桿菌屬的相對豐度［15］。

本研究通過對16 例絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染患者和8 例健康對照者進(jìn)行腸道細(xì)菌16 S rDNA 的V3～V4 可變區(qū)擴(kuò)增、測序。結(jié)果表明，復(fù)發(fā)性尿路感染組腸道菌群的多樣性低于健康對照組，乳桿菌屬豐度低于健康對照組，兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異。濯淋顆?？梢哉{(diào)節(jié)厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門的相對豐度，提高F／B 比值，表明濯淋顆?？梢灾亟c道菌群平衡。濯淋顆粒治療后乳桿菌屬相對豐度增加，表明濯淋顆粒干預(yù)可能增加乳桿菌屬的豐度，對腸道菌群產(chǎn)生了積極效應(yīng)。就條件致病菌而言，濯淋顆粒治療4 周后，變形桿菌、大腸桿菌-志賀菌屬較治療前增加但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明濯淋顆粒對條件致病菌影響較小。而抗生素組治療后乳桿菌屬豐度下降。

抗生素治療尿路感染強(qiáng)調(diào)殺滅病原菌，會(huì)引起腸道菌群紊亂，反而導(dǎo)致感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。濯淋顆?？梢栽黾幽c道有益菌，重新建立腸道微生態(tài)平衡，體現(xiàn)了中醫(yī)“陰平陽秘”的核心思想。本研究中藥組、西藥組在治療后腸道菌群差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與觀察周期短有關(guān)。

本研究初步研究了絕經(jīng)期復(fù)發(fā)性尿路感染女性患者的腸道菌群特征，并初步探討了濯淋顆粒對腸道菌群的影響，推測濯淋顆?？梢灾亟c道菌群平衡。但因條件限制，本研究是一項(xiàng)基于少數(shù)樣本的研究，且設(shè)計(jì)粗淺，有待進(jìn)一步深入研究與驗(yàn)證。