祛白片揮發(fā)油的GC-MS 分析及其對黑色素瘤細胞B16 脫黑色素模型的影響

段松冷韋元元顧紅燕劉俊麗田佳懿劉敏孫路路*

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院藥學部，北京100038； 2.臨床合理用藥生物特征譜學評價北京市重點實驗室，北京100038； 3.臨床合理用藥生物特征譜學評價國際合作聯(lián)合實驗室，北京100038）

首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院自制中藥制劑祛白片（原名白癜風片）是由蒺藜（炒）、制何首烏、黑芝麻（炒）、補骨脂、女貞子、北沙參、決明子、香櫞、赤芍、丹參、桃仁（炒）、紅花、獨活、蒼術（炒）、白芷組成的復方制劑，具有滋補肝腎、活血通絡的功效，可用于治療肝郁腎虧、血虛瘀阻、皮失所養(yǎng)之白癜風，其臨床療效穩(wěn)定可靠，受到患者廣泛好評［1-2］。為實現(xiàn)祛白片制劑成果轉化，本研究從其特征圖譜入手建立了祛白片的質量標準，并考察了全方藥效學。顧紅燕等［3-4］研究祛白片對實驗性白癜風模型的作用機制，證實了祛白片的抗白癜風作用，并確定藥效與促進黑色素形成相關。因祛白片制備工藝為水煎煮，提取過程中全方藥材揮發(fā)油幾乎完全流失。因此，為最大限度地保留處方飲片所有可能的有效成分，進一步提高療效，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取祛白片揮發(fā)油，GC-MS 聯(lián)用技術分離鑒定其成分，并用CCK-8 法檢測祛白片揮發(fā)油對小鼠黑色素瘤細胞B16 的細胞生長、促細胞活力、黑色素合成、酪氨酸酶活性的影響［4］，以期為優(yōu)化祛白片工藝規(guī)程，進一步提高療效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Trace 氣相-質譜聯(lián)用儀（美國Thermo Finnigan公司）；MCO-15AC 型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；COIC XDS-1B 型顯微鏡（重慶重光實業(yè)有限公司）；RTTDL-40B 型離心機（上海安亭科學儀器廠）；YT-CJ-1ND 型無菌操作臺（北京亞泰科隆儀器科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蒺藜（炒）、制何首烏、黑芝麻（炒）、補骨脂、女貞子、北沙參、決明子、香櫞、赤芍、丹參、桃仁（炒）、紅花、獨活、蒼術（炒）、白芷飲片均購自北京金崇光藥業(yè)有限公司，經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院孫路路主任藥師鑒定為正品。8-甲氧補骨脂素（8-MOP，批號M3501-1，純度98%）、過氧化氫（H2O2，批號H1009-100 mL）均購自美國Sigma 公司。

1.3 細胞 小鼠黑色素瘤細胞B16（編號3111C0001CCC000324），購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。

2 方法與結果

2.1 GC-MS 分析

2.1.1 揮發(fā)油制備 按1 劑祛白片處方量的10%稱取所需飲片，按2020 年版《中國藥典》 四部2204 揮發(fā)油測定法［5-6］，加熱處方并保持微沸5 h 至揮發(fā)油提取器中油量不再增加，即得（性狀為黃色油狀物）。

2.1.2 分 析條件 B-5MS 色譜柱（0.25 mm× 30 m，0.25 μm）；程序升溫（初始溫度50 ℃，保持3 min；5 ℃／min升至250 ℃，保持10 min）；載氣高純氦氣；體積流量1.0 mL／min ；進樣量0.5 μL；氣化溫度270 ℃；分流進樣，分流比20∶ 1。EI 離子源70 eV；離子源溫度200 ℃；全掃描采集模式，質量范圍m／z35～450。

2.1.3 結果分析 采用NIST 譜庫檢索，結合保留時間確認化學成分，按峰面積歸一化法進行計算［7-8］。如圖1、表1 所示，揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取率為0.169 0%，從祛白片揮發(fā)油中分離出的66 個峰，確定了53 個化合物，占揮發(fā)油的64.30%。

表1 揮發(fā)油成分GC-MS 分析結果

圖1 揮發(fā)油GC-MS圖

2.2 藥效學研究

2.2.1 模型建立 參考文獻［9］報道制備B16 細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)，培養(yǎng)液（10%FBS、DMEM、1%P／S）稀釋細胞，24、96 孔板鋪板，每孔均10 000 個細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后更換含0.1 mmol／L H2O2的培養(yǎng)液，與細胞共同孵育4 h 后吸棄培養(yǎng)基，即得脫黑色素細胞，DMEM 清洗1次，更換含不同藥物的培養(yǎng)液。

2.2.2 細胞生長狀態(tài)觀察 將細胞分為模型組、溶劑組、8-MOP 組（10、25、50、100、500 μmol／L）、祛白片揮發(fā)油組（0、1∶30 000、1∶20 000、1∶16 000、1∶10 000、1∶8 000），模型組細胞造模后同步加入相同體積的培養(yǎng)基，后續(xù)與實驗組平行；由于揮發(fā)油及8-MOP 均是以DMSO 配制所得，故設溶劑組，原液稀釋1 000倍，其余操作與實驗組平行；8-MOP 組、祛白片揮發(fā)油組分別加入相應藥物，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，在倒置顯微鏡下觀察脫黑色素細胞形態(tài)學變化，并在光鏡下拍照，結果見圖2。由此可知，與模型組比較，祛白片揮發(fā)油組作用24 h 后細胞數(shù)增加，而48 h 后減少；8-MOP 組作用24、48 h 后細胞數(shù)均增加，并呈時間、劑量依賴性。

圖2 各組脫黑色素細胞生長（×100）

2.2.3 CCK-8 法檢測揮發(fā)油對黑色素細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期B16 細胞，胰酶消化，制成密度為1×104／孔的單細胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按“2.2.1”項下方法建立模型，按“2.2.2”項下分組，另設對照組（不含細胞），每組設5 個復孔，加入相應藥物處理24、48 h，吸去上清，更換為含CCK-8 的溶液（CCK-8∶DMEM ＝1∶10），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，采用酶標儀在450 nm 波長處測定光密度（OD）值，計算細胞增殖率［10］，結果見圖3。由此可知，與模型組比較，祛白片揮發(fā)油組細胞增殖率升高（P＜0.01）；與溶劑組比較，8-MOP 組細胞增殖率升高（P＜0.01），提示脫黑色素細胞增殖率與藥物濃度呈正相關，8-MOP 組細胞增殖率與作用時間呈正相關，祛白片揮發(fā)油組細胞增殖率與作用時間呈負相關。

圖3 揮發(fā)油對脫黑色素細胞增殖的影響（， n＝3）

2.2.4 NaOH 裂解法檢測揮發(fā)油對黑色素形成的影響 按“2.2.3”項下方法分組、培養(yǎng)及給藥，加入相應藥物培養(yǎng)48 h 后棄上清液，PBS（pH 7.4）洗滌2次，加入200 μL含10%DMSO 的1 mol／L NaOH 溶液，80 ℃恒溫水浴保溫2 h，充分裂解細胞和溶解黑素顆粒，采用酶標儀在490 nm波長處測定OD值，計算促黑色素生成率［11］，結果見圖4。由此可知，與模型組比較，作用24 h 后祛白片揮發(fā)油組細胞促黑色素生成率升高（P＜0.01），48 h 后除祛白片揮發(fā)油1∶30 000 組外繼續(xù)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與溶劑組比較，8-MOP 組細胞促黑色素生成率升高（P＜0.01），提示細胞促黑色素生成率與藥物濃度呈正相關，8-MOP 組細胞的促黑色素生成率與作用時間呈正相關，祛白片揮發(fā)油組細胞促黑色素生成率與作用時間呈負相關。

圖4 揮發(fā)油對黑色素形成的影響（， n＝3）

2.2.5 酶標法檢測揮發(fā)油對酪氨酸酶活性的影響 脫黑色素細胞接種于96 孔板，按“2.2.2”項下分組，加入相應藥物處理24、48 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2次，每孔加入1%TritonX-100 溶液90 μL，迅速放入-80 ℃冰箱中孵育30 min，隨后室溫融化使細胞完全破裂，在37 ℃下預溫后加入10 g／L L-DOPA 溶液（100 μL／孔），在37 ℃下孵育30 min，采用酶標儀在490 nm 波長檢測OD值［12］，計算酪氨酸酶活性促進率，結果見圖5。由此可知，與模型組比較，祛白片揮發(fā)油組脫黑色素細胞中酪氨酸酶活性升高（P＜0.01）；與溶劑組比較，8-MOP 組脫黑色素細胞中酪氨酸酶活性升高（P＜0.01），提示脫黑色素細胞中酪氨酸酶活性與藥物濃度呈正相關，8-MOP 組脫黑色素細胞中酪氨酸酶活性與作用時間呈正相關，而祛白片揮發(fā)油組脫黑色素細胞中酪氨酸酶活性與作用時間呈負相關。

圖5 揮發(fā)油對酪氨酸酶活性的影響（， n＝3）

3 討論

3.1 祛白片揮發(fā)油成分分析 由提取中藥揮發(fā)油制成的中成藥在現(xiàn)代疾病治療、預防保健中已被廣泛應用［13］。本研究采用GC-MS 技術［14］對祛白片揮發(fā)油的化學成分及含量進行考察，結果顯示，揮發(fā)油成分中1-甲基-2，4-二（prop-1-en-2-基）-1-乙烯基環(huán)己烷最高，（2E，4E）-癸二烯醛（8.03%）次之，4a-甲基-1-亞甲基-7-（prop-1-en-2-基）十氫萘含量排名第3。分析結果表明，祛白片揮發(fā)油成分中含量最高的為脂肪烴類，其次為環(huán)烴。將祛白片揮發(fā)油成分，與方中君藥蒺藜的揮發(fā)油［15］比較可知，蒺藜中含量最高的（2E，4E）-癸二烯醛（9.16%）在祛白片揮發(fā)油中次高，祛白片揮發(fā)油中含量最高的1-甲基-2，4-二（prop-1-en-2-基）-1-乙烯基環(huán)己烷在蒺藜的揮發(fā)油中沒有檢測到，方中臣藥補骨脂揮發(fā)油中含量最多的石竹烯（36.24%）［16］在祛白片中也沒有的檢測到，可能是在提取祛白片揮發(fā)油的過程中，發(fā)生了多種復雜的化學變化，使得揮發(fā)油在成分和含量上都與單味藥成分存在較大差異。

3.2 陽性藥物的選擇 8-MOP 加長波紫外線或日光照射是治療白癜風應用最多的一種方法，其臨床上應用的口服片劑、膠囊、針劑、酊劑等對白癜風均有一定的治療作用［17］。由于8-MOP 結構簡單、易與DNA 發(fā)生作用，生物活性較易發(fā)揮作用，故選擇其為陽性對照藥物，考察祛白片揮發(fā)油的抗白癜風作用。

3.3 祛白片揮發(fā)油對小鼠黑色素瘤細胞B16 脫黑色素模型的影響 與模型組比較，祛白片揮發(fā)油作用24 h 后各劑量揮發(fā)油均可使細胞數(shù)增加，但作用48 h 后細胞數(shù)較之前有所減少。8-MOP 組給藥24、48 h 后對脫黑色素細胞的增殖作用呈時間和劑量依賴性。祛白片揮發(fā)油對脫黑色素細胞增殖活性及黑色素水平的研究結果與以上情況類似。祛白片揮發(fā)油給藥48 h 后結果不佳，可能是因為揮發(fā)油理化性質較為特殊［18］，在室溫下極易揮發(fā)，48 h后，揮發(fā)油含量已下降，藥效也隨之降低。祛白片揮發(fā)油對B16 細胞脫黑色素模型具有一定的促進生長繁殖和升高黑色素水平的作用。本研究可作為祛白片制備工藝改進的依據(jù)，建議在祛白片飲片水提之前進行揮發(fā)油的收集以及環(huán)糊精包合［19-21］，以提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性，增強祛白片的療效，更好的滿足患者的臨床需求。