基于分子對接的玉屏風(fēng)中端粒酶TERT 激動劑的虛擬篩選

湯建朱銳靈趙康琦夏海平聞崇煒

（1.亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽 亳州236800； 2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 3.江蘇大學(xué)附屬四院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001）

玉屏風(fēng)系中醫(yī)扶正固本的經(jīng)典名方，由黃芪、白術(shù)和防風(fēng)組成，諸藥合參，藥簡效宏［1］，具有抗衰老的可能性［1-2］。玉屏風(fēng)能明顯地延長果蠅的平均壽命，對BJ 細(xì)胞中的端粒酶有較好的激活作用，其抗衰老作用可能與端粒酶激活有關(guān)［3］。玉屏風(fēng)中化學(xué)成分繁雜，關(guān)鍵活性成分和激活端粒酶的機制尚不明確。

端粒酶是端粒復(fù)制所必須的一種特殊的DNA 聚合酶，若激活端粒酶，可增加細(xì)胞分裂次數(shù)，從而延長細(xì)胞壽命［4-5］。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）是端粒酶的限速亞單位，是端粒酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，針對TERT 的活性成分篩選是發(fā)現(xiàn)端粒酶激動劑（抗衰老）或抑制劑（抗癌）的有效方法［6-7］。目前靶向端粒酶或TERT 的研究以篩選端粒酶抑制劑居多［7］，而激動劑的研究較少，環(huán)黃芪醇是目前唯一被公認(rèn)的通過激活端粒酶發(fā)揮抗衰老作用的天然膳食補充劑［5-6］。為發(fā)現(xiàn)更多潛在的抗衰老活性化合物，以端粒酶TERT 基因為靶蛋白，采用分子對接技術(shù)從傳統(tǒng)中藥玉屏風(fēng)中虛擬篩選激動TERT 的活性成分。

分子對接是利用計算機軟件模擬小分子配體與大分子受體之間活性位點的最佳結(jié)合模式的技術(shù)，在中藥活性成分篩選和靶點確證方面有著廣泛的應(yīng)用前景［8-9］，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)用在中藥多組分、多途徑發(fā)揮藥效的解析工作中發(fā)揮了重要作用［10］。本研究采用AutoDock Vina 軟件［11］，將檢索到的玉屏風(fēng)中的小分子化合物與端粒酶TERT 基因進行分子對接，根據(jù)打分虛擬篩選出潛在的端粒酶激活劑，為闡明玉屏風(fēng)的抗衰老活性機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

采用ChemOffice2020 程序（美國PerkinElmer 公司）中的ChemDraw 和Chem 3D模塊、AutoDock Tools1.5.6 和AutoDock Vina（斯克利普斯研究所）、Pymol 1.8（美國DeLano Scientific LLC公司）和Discovery Studio 2017R2 client（美國BIOVIA 公司）。

2 方法

2.1 靶蛋白TERT 結(jié)構(gòu)的獲取和預(yù)處理 通過檢索搜索PDB 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.rcsb.org／pdb／home／home.do），獲取靶點蛋白TERT 復(fù)合物（PDB ID：5CQG），將靶點蛋白依次導(dǎo)入AutoDock Tools1.5.6中，刪除原配體BIBR1532，水分子，加氫，保存為pdbqt 格式，以備分子對接。

2.2 化合物（配體）庫的建立 通過檢索PubChem 等數(shù)據(jù)庫［12］和相關(guān)文獻，從玉屏風(fēng)的水煎劑以及3 種原藥材黃芪、白術(shù)和防風(fēng)中共收集68 個化合物（配體），主要為三萜皂苷、黃酮、白術(shù)內(nèi)酯、色原酮、香豆素等化合物，見表1，ChemDraw 軟件繪制分子結(jié)構(gòu)，并用Chem3D 轉(zhuǎn)化成三維結(jié)構(gòu)，MM2 力場進行最小能量優(yōu)化，結(jié)果保存為mol2格式。AutoDock Tools1.5.6 對小分子進行加氫，計算Gasteiger 電荷，合并非極性氫，最終保存為pdbqt 格式，以備分子對接。

表1 玉屏風(fēng)中68 個小分子化合物

2.3 配體-靶蛋白的分子對接 在對接前，須確定驗證對接過程中參數(shù)設(shè)置的合理性。首先用AutoDock Tools 1.5.6軟件將靶點蛋白晶體復(fù)合物中的原配體取出，利用AutoDock Vina 與受體重新對接，其結(jié)合能打分值為閾值，同時分析對接構(gòu)象和原蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象的重疊度，通常認(rèn)為均方根偏差（RMSD）在2? 范圍內(nèi)。

分子對接的晶格中心設(shè)置為x＝24.667，y＝6.99，z＝-31.485（nm），對接空間（Grid Box）：30 nm×30 nm×30 nm，能量范圍為4。利用Vina 軟件進行半柔性對接（對接過程中受體是剛性，配體是柔性，可在一定范圍內(nèi)變化），得到配體分子與靶點蛋白（PDB ID：5CQG）對接后的能量打分值。

3 結(jié)果

通過分子對接，均選擇序號1 的打分值（dist from rmsd l.b.值和best mode rmsd u.b.值均為0），見表2。發(fā)現(xiàn)68個化合物的對接分值與結(jié)構(gòu)有明顯的相關(guān)性。其中異黃酮類（20～25）以及異黃烷醇類（26～27）等化合物具有最強的結(jié)合力（≥-9.0 kcal／mol）；色原酮類化合物（41～52）具有較強的結(jié)合力（-8.1～-9.1 kcal／mol）；大部分白術(shù)內(nèi)酯類和香豆素類具有中等強度的結(jié)合力，但雙白術(shù)內(nèi)酯（39）和雙表白術(shù)內(nèi)酯（40）與TERT 的結(jié)合力較強，分值為-9.2、-9.9 kcal／mol。紫花前胡苷元（63）和異紫花前胡苷（64）也表現(xiàn)出較高的結(jié)合力，分值分別為-9.0、-9.5 kcal／mol；黃芪皂苷類化合物（1～19）結(jié)合力普遍偏弱，大部分黃芪皂苷物質(zhì)的分值在-7.0～-7.4 kcal／mol。所有化合物與TERT 的對接分值均低于原配體BIBR1532（-10.7 kcal／mol）。

表2 化合物與受體蛋白TERT 的結(jié)合能（kcal／mol）

玉屏風(fēng)68 個化合物中，打分值最高的是毛蕊異黃酮苷（20）和芒柄花苷（22）。3D 圖顯示毛蕊異黃酮苷的分子卡在蛋白5CQG 的凹槽內(nèi)（圖1A）。2D 圖中可見化合物與殘基GLY553、PHE478 和TRP498 形成范德華力；糖片段的3-OH 與殘基ARG557、GLY495 形成氫鍵；黃酮苷元的A、C 環(huán)與殘基MET482 之間，B 環(huán)與殘基MET483 之間形成π-硫鍵；A、C 環(huán)與殘基TYR551 之間，A、B、C 環(huán)與殘基PHE494 之間形成π-π 鍵；分子還與殘基LEU554、ILE497和ILE550 形成π-烷基鍵（圖1B）。圖1C 顯示，芒柄花苷的分子與蛋白5CQG 有著類似的結(jié)合方式，芒柄花苷與殘基PHE478、GLY495、ARG557 和GLY553 形成范德華力；糖片段的3-OH 與殘基TRP498 形成氫鍵；黃酮苷元的A、C 環(huán)與殘基MET482 之間，B 環(huán)與殘基MET483 之間形成π-硫鍵；A、C 環(huán)與殘基TYR551 之間，A、B、C 環(huán)與殘基PHE494 之間形成π-π 鍵；分子還與殘基ILE497、LEU554和ILE550 形成π-烷基鍵（圖1D）。毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷與蛋白的結(jié)合緊密，存在著作用明顯的作用力，這也很好地解釋了這兩個化合物與TERT 的結(jié)合力最強的原因。

圖1 毛蕊異黃酮苷（A、B）和芒柄花苷（C、D）與TERT（5CQG）的對接示意圖

4 討論

玉屏風(fēng)為扶正固本經(jīng)典名方，對機體的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，在抗疲勞、抗衰老等方面均具有良好的應(yīng)用前景。原藥材黃芪的主要活性成分為皂苷、黃酮和多糖；白術(shù)的化學(xué)成分主要是揮發(fā)油、內(nèi)酯類化合物、苷類化合物以及多糖；防風(fēng)的化學(xué)成分主要為色原酮類化合物、香豆素、揮發(fā)油、聚炔和多糖等。雖然通過色譜手段分離鑒定了大量的天然小分子化合物，其中白術(shù)中分離得到的倍半萜類化合物就有100 多種，但玉屏風(fēng)的水煎劑中通過LCMS 等手段，僅僅發(fā)現(xiàn)了10 余種成分，其中白術(shù)藥材中只有3 種成分進入水煎劑。以玉屏風(fēng)水煎劑中的15 個化合物為主要成分，經(jīng)適當(dāng)擴充，選擇了68 種小分子化合物進行研究，其中30 種源于黃芪，10 種源于白術(shù)，28 種源于防風(fēng)。雖然多糖成分具有良好的免疫增強等活性，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不能確定，不適合進行分子對接［9］。目前PDB 數(shù)據(jù)庫中還未收錄人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，因此以高度近似的昆蟲赤擬谷盜（Tribolium castaneum）TERT 基因為模板進行分子對接［7］。又因目前尚無TERT 基因與其激活劑的結(jié)晶復(fù)合物，故本文中使用赤擬谷盜TERT基因與抑制劑BIBR1532 結(jié)晶復(fù)合物（PDB ID：5CQG）作為對接蛋白［7，13］。

68 個化合物中，有些化合物與TERT 對接打分值和實驗藥理活性的差距較大。環(huán)黃芪醇能夠明顯地增加TERT表達而激活端粒酶［5-6］。前期篩選端粒酶激活劑研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有溫和的激活端粒酶的活性，能促進BJ 細(xì)胞生長，只是弱于其苷元環(huán)黃芪醇。但本文中環(huán)黃芪醇與TERT 對接的分值為-7.7 kcal／mol，其糖苷化合物（黃芪甲苷）的對接分值僅為-7.1 kcal／mol，屬中等強度。人參炔醇和法卡林二醇在細(xì)胞模型中均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒活性［14-15］，推測其與TERT 可能有較高的結(jié)合力，但分子對接結(jié)合力較弱，分值僅為-6.8、-5.9 kcal／mol。

對接的分值較高，說明化合物與TERT 的結(jié)合力較強，但不能確定是激活劑還是抑制劑。如毛蕊異黃酮的結(jié)合力為-10.2 kcal／mol，但實驗證明，該物質(zhì)既有良好的抗腫瘤活性，又有顯著的抗衰老活性［16］。藥效的表達不是簡單的抑制或激活，而是一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程。

綜上所述，玉屏風(fēng)具有良好的激活端粒酶能力，在抗衰老等方面具有良好的應(yīng)用潛力，其活性物質(zhì)可能通過TERT 激活端粒酶。分子對接只能預(yù)測化合物與靶酶TERT的結(jié)合力，但這些化合物是激動劑還是抑制劑還需要細(xì)胞或動物實驗確證。