基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益腎消癥方治療多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制

丁昉黃莉婷何佳林寒梅

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530020； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530023）

多囊卵巢綜合征是一種多基因、多因素、全身性、炎癥性的自身免疫性疾病［1-2］，一般由雄激素過多和卵巢功能障礙的體征和癥狀組合定義，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［3］。青春期多囊卵巢綜合征具有高發(fā)性，其臨床癥狀包括閉經(jīng)或少經(jīng)、多毛癥、不育癥、情緒障礙等［4］，此外對非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病、冠狀動(dòng)脈硬化等心血管疾病及子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤的長期風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視［5-9］。本課題組在臨床使用益腎消癥方發(fā)現(xiàn)，其對青春期多囊卵巢綜合征患者的療效優(yōu)于二甲雙胍及達(dá)英-35 對照組，且不良反應(yīng)減少［10］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)及經(jīng)典藥理學(xué)等多學(xué)科理論對藥物干預(yù)疾病的靶點(diǎn)及可能機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)歸納分析的新學(xué)科［11-12］。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”的交互網(wǎng)絡(luò)，聯(lián)合大鼠多囊卵巢綜合征模型，對益腎消癥方治療多囊卵巢綜合征的作用靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行探究。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫 中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http：／ ／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：／ ／www.genecards.org／）；Venny 2.1.0（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）；String 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／string-db.org／）；DAVID數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www .david.niaid.nih.gov）；RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.rcsb.org）；PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）。

1.2 試劑與藥物 益腎消癥方由黨參20 g、仙靈脾12 g、杜仲15 g、菟絲子15 g、女貞子10 g、三棱12 g、莪術(shù)10 g、赤芍9 g、膽南星10 g、半夏15 g、夏枯草12 g、當(dāng)歸15 g、川芎10 g、皂角刺12 g、紫石英15 g 等組成，中藥材均購自廣西省南寧市老百姓大藥房，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)黃莉婷老師鑒定為正品。益腎消癥方由廣西中醫(yī)學(xué)院中藥方劑研究實(shí)驗(yàn)室制備，每1 劑（約192 g）浸泡2 h 后加入2 L 水煎煮2 h，取煎煮液。同法煎煮6次，合并所有煎煮液，于60 ℃水浴濃縮至4 g／mL，消毒滅菌，4 ℃保存，備用。丙酸睪酮注射液（批號(hào)050601）、0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)07011103）均購自廣州白云山明興制藥有限公司；注射用人絨毛膜促性腺激素（HCG，批號(hào)0605021），購自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司；枸櫞酸氯米芬膠囊（CC，批號(hào)060801），購自上海衡山藥業(yè)有限公司。

1.3 儀器 OHAUS 1／1000 型電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；BCD-143KA1 型電冰箱（TCL 科技集團(tuán)股份有限公司）；PM-10AD 型照相顯微鏡（日本Olympus 公司）；Leica MP60 型顯微照相系統(tǒng)、RM2125 型LEICA 切片機(jī)（德國Leica 公司）。

1.4 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性SD 大鼠40只，體質(zhì)量30～35 g，23 日齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（桂）2003-0003。飼養(yǎng)條件為室溫（25±2）℃，相對濕度40%～70%，12 h／12 h 明暗交替，自由飲水進(jìn)食。

2 方法

2.1 益腎消癥方有效成分收集及初篩 利用ETCM 數(shù)據(jù)庫收集益腎消癥方中各藥味的主要化學(xué)成分，并用ETCM 數(shù)據(jù)庫中的MedChem Studio 程序預(yù)測查詢該化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)，保留可靠性分值大于0.8 的靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測及交互靶點(diǎn) 以polycistic ovary syndrome 作為檢索詞納入GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，高級(jí)檢索獲得多囊卵巢綜合征相關(guān)靶點(diǎn)。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)蛋白交集Venny 2.1.0 在線工具取交集獲得“益腎消癥方”和“多囊卵巢綜合征”交集的“中藥-疾病”交互靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

2.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將所得到的交互靶點(diǎn)導(dǎo)入，通過String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為Homo sapiens，設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為“medium confidence”（＞0.4），其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信息。

2.4 GO 和KEGG 富集分析 將交集靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行基因功能富集分析，分別從細(xì)胞組成、分子功能、生物過程方面提供基因功能的詳細(xì)注釋。設(shè)定閾值P＜0.05 進(jìn)行篩選，對相互作用的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，按照P值升序選取前10 位KEGG 通路，繪制“靶點(diǎn)-通路”弦圖。并用R 軟件對上述結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2.5 分子對接 從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫下載靶標(biāo)蛋白，并使用PyMol 軟件刪除水分子和原配體；有效化合物從PubChem 下載2D 結(jié)構(gòu)，用ChemBio3D 能量最小化轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，保存為mol2 格式。以蛋白作為受體，以小分子作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)確定分子對接的活性位點(diǎn)，采用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對接，參數(shù)exhaustiveness 設(shè)置為24，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。最后選取打分值最高的構(gòu)象用Discovery Studio 進(jìn)行結(jié)果分析，用PyMol 進(jìn)行相關(guān)作圖。

2.6 多囊卵巢綜合征大鼠造模及給藥 參照文獻(xiàn)［13］報(bào)道，雌性SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、枸櫞酸氯米芬組、益腎消癥方組，每組10只，除正常組外，其余各組建立多囊卵巢綜合征大鼠模型，造模方法為頸背部皮下注射丙酸睪酮1.25 mg／只，隔天1次，同時(shí)給予HCG 1.5 U／只，每天2 次皮下注射，連續(xù)20 d。正常組皮下注射生理鹽水0.15 mL／只，每天2次，共20 d。造模成功后，各組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)藥物（益腎消癥方組2 g／100 g，枸櫞酸氯米組0.5 mg／100 g），共4 周；正常組和模型組大鼠灌胃給予蒸餾水0.5 mL／100 g。

2.7 檢測指標(biāo)

2.7.1 陰道細(xì)胞學(xué)檢查觀察動(dòng)情周期 無菌棉簽于生理鹽水中浸濕后放入大鼠陰道側(cè)壁上1／3，順時(shí)針涂抹后沿同一方向涂抹于載玻片上，95%乙醇中固定15 min，自然風(fēng)干后采用HE 染色。大鼠動(dòng)情周期以陰道內(nèi)細(xì)胞變化來鑒別，動(dòng)情前期以小、圓、有核鱗狀上皮細(xì)胞存在為特征，持續(xù)時(shí)間12 h；動(dòng)情期以角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞為特征，持續(xù)時(shí)間9～15 h；動(dòng)情后期，以白細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞為特征，持續(xù)時(shí)間14～18 h；動(dòng)情間期，白細(xì)胞和圓上皮細(xì)胞出現(xiàn)為特征，持續(xù)時(shí)間60～70 h。

2.7.2 雙側(cè)卵巢檢測 大鼠腹腔麻醉后摘取雙側(cè)卵巢稱取濕質(zhì)量，觀察各組大鼠卵巢外觀、色澤、包膜及包膜下是否有囊狀擴(kuò)張的卵泡等情況，檢測雙側(cè)卵巢的體積和質(zhì)量，用10%甲醛固定液固定后行HE 染色。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS11.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益腎消癥方有效化學(xué)成分篩選 通過ETCM 數(shù)據(jù)庫檢索得到益腎消癥方中包含559 個(gè)化合物，這些化合物中可靠性大于0.8 的靶點(diǎn)共計(jì)797 個(gè)。各藥味的化合物和靶點(diǎn)個(gè)數(shù)見表1。

表1 益腎消癥方包含的化合物和對應(yīng)的潛在靶標(biāo)個(gè)數(shù)

2.2 多囊卵巢綜合征靶點(diǎn)預(yù)測及“益腎消癥方-多囊卵巢綜合征”交互靶點(diǎn)篩選 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，以polycistic ovary syndrome 作為檢索詞收集得到“多囊卵巢綜合征”靶點(diǎn)共計(jì)2 575 個(gè)。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)蛋白交集Venny 2.1.0 在線工具獲得“益腎消癥方”和“多囊卵巢綜合征”交集的“中藥-疾病”交互靶點(diǎn)共252個(gè)，韋恩圖見圖1。

圖1 益腎消癥方與多囊卵巢綜合征交互靶點(diǎn)韋恩圖

3.3 “益腎消癥方-多囊卵巢綜合征”交互靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING 數(shù)據(jù)庫對交互靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），圖中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)為251個(gè)，相互作用連線有3 054條，平均度值為24.3。節(jié)點(diǎn)表示作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間的連線則表示靶點(diǎn)間具有相互作用，互相關(guān)聯(lián)。

圖2 交互靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 GO 富集分析 從DAVID 生物信息在線數(shù)據(jù)庫中確定GO 條目867條，其中，生物學(xué)過程（biological process，BP）612條，主要涉及對藥物、乙醇、缺氧、尼古丁等反應(yīng)性，氧化還原過程，對RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的起始及正調(diào)控，類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路及代謝過程，突觸傳遞及膽堿能等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）84條，涉及乙酰膽堿門控通道復(fù)合物、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞器膜、質(zhì)膜、細(xì)胞外泌體、膜筏、突觸后膜和核苷酸激活的蛋白激酶復(fù)合物等；分子功能（molecular function，MF）171條，與藥物、酶、乙酰膽堿、血紅素、鐵離子、氧等結(jié)合，類固醇激素受體，乙酰膽堿激活的陽離子選擇性通道，配體門控離子通道，乙酰膽堿受體等活性密切相關(guān)。以上分析均取排名前10 條目作圖，見圖3。

3.5 KEGG 富集分析 將疾病和藥物交集的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫，共富集到211 條通路。根據(jù)P＜0.05 選取排名前10 的通路作圖，見圖4。分析富集結(jié)果可知，益腎消癥方-多囊卵巢綜合征交互靶點(diǎn)涉及雌激素信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、類固醇激素的合成、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、胰島素抵抗及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。

圖4 KEGG 富集分析結(jié)果（前10）

3.6 分子對接結(jié)果 將交互靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件中分析節(jié)點(diǎn)信息，篩選出前6 個(gè)核心調(diào)控基因靶點(diǎn)，結(jié)果見表2。以潛在靶標(biāo)數(shù)＞40 以及ETCM 上類藥性（DL）評(píng)分＞0.5 作為篩選條件得到主要潛在活性成分，與核心調(diào)控基因靶點(diǎn)進(jìn)行對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分成分均具有較好對接活性。選取類藥性評(píng)分最高（0.823），潛在靶標(biāo)數(shù)為44 的喬松素作為代表性成分，與INS（圖5A）、ALB（圖5B）、Akt1（圖5C）進(jìn)行分子對接進(jìn)行分析驗(yàn)證。其中，喬松素小分子與INS 蛋白氨基酸Gly20 和Phe24 形成3 個(gè)氫鍵，與氨基酸Phe24 形成2 個(gè)ππ 作用；與ALB 蛋白氨基酸Arg117 和Arg186 形成2 個(gè)氫鍵，與氨基酸Tyr138 和Tyr161 形成2 個(gè)π-π 作用；與Akt1蛋白的氨基酸Asn279 和Asp292 形成2 個(gè)氫鍵，這些相互作用使得化合物喬松素能與INS、ALB、Akt1 等蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，與蛋白的活性口袋有較好匹配。

圖5 喬松素與INS、ALB、Akt1 分子對接圖

表2 益腎消癥方治療多囊卵巢綜關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)分析

3.7 益腎消癥方對大鼠動(dòng)情周期的影響 正常組大鼠均表現(xiàn)為規(guī)律動(dòng)情周期；模型組中11 只大鼠無交替變化的規(guī)律動(dòng)情周期，提示排卵障礙；益腎消癥方組有4 只大鼠表現(xiàn)規(guī)律動(dòng)情周期變化，6 只則呈不規(guī)律動(dòng)情周期變化；枸櫞酸氯米芬組中有3 只大鼠呈規(guī)律動(dòng)情周期變化，7 只呈不規(guī)律動(dòng)情周期變化，見表3。

表3 益腎消癥方對大鼠動(dòng)情周期的影響

3.8 益腎消癥方對大鼠卵巢的影響 正常組大鼠卵巢表面飽滿光滑，色澤較紅，體積較?。荒Ｐ徒M大鼠卵巢表面較蒼白，體積增大，包膜增厚，可見包膜下較多囊狀擴(kuò)張的卵泡；益腎消癥方組大鼠卵巢與模型組比較則有明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠雙側(cè)卵巢質(zhì)量增加（P＜0.01）；與模型組比較，益腎消癥方組大鼠卵巢質(zhì)量降低（P＜0.01），枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢質(zhì)量降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。正常組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)正常，可見多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段卵泡，顆粒細(xì)胞呈多層，排列整齊；模型組大鼠卵巢可見大量原始卵泡，存在多個(gè)囊性竇卵泡，竇腔擴(kuò)大，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少排列稀疏，黃體組織減少；益腎消癥方組大鼠囊性卵泡壁顆粒細(xì)胞層次增加，排列整齊，優(yōu)勢卵泡內(nèi)見有卵細(xì)胞，且黃體數(shù)量較模型組的增多，黃體體積增大，見圖6。

表4 益腎消癥方對大鼠卵巢的影響（， n＝10）

表4 益腎消癥方對大鼠卵巢的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖6 各組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)圖（×100）

4 討論

多囊卵巢綜合征多起病于青春期，以月經(jīng)失調(diào)、高雄激素血癥、胰島素抵抗為基本特征［5，14］。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將多囊卵巢綜合征歸屬于“月經(jīng)后期、閉經(jīng)、月經(jīng)過少、崩漏、不孕、癥瘕”等范疇［15-17］?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)多認(rèn)為該病以臟腑功能失調(diào)為本，痰瘀阻滯為標(biāo)，臨床表現(xiàn)多為虛實(shí)夾雜，本虛標(biāo)實(shí)之證［18］。

基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，林寒梅教授自擬益腎消癥方，方中紫石英、淫羊藿、杜仲補(bǔ)腎壯陽，溫暖胞宮為君；菟絲子補(bǔ)陽益陰，女貞子養(yǎng)陰補(bǔ)血，黨參益氣養(yǎng)血，當(dāng)歸、川芎養(yǎng)血活血，共為臣藥，共奏補(bǔ)腎活血之效；三棱、莪術(shù)、皂角刺活血化瘀軟堅(jiān)散結(jié)；膽南星、半夏、夏枯草化痰散結(jié)；赤芍活血散瘀；以上諸藥為佐藥，配合君、臣藥以加強(qiáng)益腎活血、化痰消癥之功［10］。該方已應(yīng)用于多囊卵巢綜合征的臨床治療，取得了良好療效，為了更好發(fā)揮益腎消癥方的治療作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對全方作用機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果顯示，益腎消癥方可能通過調(diào)控雌激素信號(hào)通路、類固醇激素合成、胰島素抵抗等通路來發(fā)揮對多囊卵巢綜合征的治療作用，這與降低體內(nèi)雄激素的生成、改善胰島素抵抗和降低胰島素水平［13］等多囊卵巢綜合征治療的要點(diǎn)相吻合。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益腎消癥方可抑制大鼠卵巢異常增大，增加卵巢黃體組織數(shù)量，改善卵巢竇狀卵泡卵母細(xì)胞多囊樣改變，恢復(fù)多囊卵巢綜合征大鼠動(dòng)情周期，改善多囊卵巢大鼠的排卵障礙。該治療機(jī)制可能是通過對顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的作用，降低多囊卵巢大鼠雄激素水平，促進(jìn)卵母細(xì)胞生長擴(kuò)大，與其他因素（如雄激素、胰島素等）協(xié)同或拮抗作用，反饋調(diào)節(jié)促性腺激素的產(chǎn)生，使卵泡正常成熟發(fā)育，恢復(fù)排卵。分子對接結(jié)果顯示，益腎消癥方中主要潛在活性成分喬松素與核心調(diào)控基因靶點(diǎn)INS、ALB、Akt1 等結(jié)合性較好，其中喬松素可降低NAFLD 大鼠INS 水平，且發(fā)揮一定的肝臟保護(hù)作用［19］；ALB 是一種主要在肝臟部位合成的結(jié)構(gòu)蛋白，可作為肝臟纖維化程度及肝臟代償功能的評(píng)估指標(biāo)［20］；Akt1 在胰島β 細(xì)胞增殖中的重要作用已被廣泛研究，且Akt1 在卵母細(xì)胞、原始卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞中均有表達(dá)［21］。喬松素可能作為益腎消癥方中主要活性物質(zhì)，通過調(diào)控胰島素抵抗途徑、調(diào)節(jié)卵巢生長及成熟來發(fā)揮治療多囊卵巢綜合征的作用。

綜上所述，益腎消癥方可能以“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的方式通過調(diào)控激素合成及胰島素抵抗來治療多囊卵巢綜合征，后續(xù)本課題組將對其活性成分及具體機(jī)制進(jìn)行深入探討，以期為益腎消癥方在臨床治療中的辨證用藥提供科學(xué)依據(jù)。