青藤堿對膽管癌細胞的抑制作用

呂彥霖鄧亞竹朱昌毫崔勝男喻超孫誠誼

（貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽550004）

膽管癌是屬于原發(fā)性肝癌的一種常見惡性腫瘤，我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直穩(wěn)中有升［1］，其患病初期難以診斷，大多數(shù)患者確診時已為晚期［2-3］。盡管膽管癌的臨床診療方法日新月異，但對晚期患者尚無有效控制病情發(fā)生發(fā)展的手段，導致總體預后較差，5 年生存率僅20%～30%［4］。因此，尋找一種新型、高效、低毒的藥物以改善現(xiàn)有膽管癌臨床診療方案變得極為迫切。

有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt 通路在膽管癌組織中的表達較癌旁組織及正常膽管組織更高，提示該通路可能參與病情發(fā)生發(fā)展，并可作為其生物學行為的評估指標［5-6］。PI3K 是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，國內(nèi)外研究認為PI3K／Akt 是一種與細胞增殖、凋亡密切相關的信號通路，在膽管癌治療中發(fā)揮重要作用［7］。

許多中藥提取物在多種癌癥治療中均表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤作用［8-10］，而且有著價格低廉、儲量豐富等優(yōu)點。青藤堿是從青藤中提取的一種活性物質，研究人員發(fā)現(xiàn)該成分可直接或間接地在視網(wǎng)膜母細胞瘤［11］、乳腺癌［12］、胃癌［13］、腎細胞癌［14］等多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，而且與PI3K／Akt 信號通路及相關蛋白表達密切相關。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可在體外有效抑制膽管癌細胞增殖，促進膽管癌細胞凋亡［15］。因此，本實驗從PI3K／Akt 通路著手，考察該成分對膽管癌的抑制作用。

1 材料

1.1 細胞 HuCCT-1、TFK-1 膽管癌細胞株，由武漢同濟醫(yī)院肝膽胰外科肝膽胰外科實驗室提供。

1.2 動物 6 周齡SPF 級雌性免疫缺陷BALB／c nude mice 裸鼠18只，體質量約為20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0008，按照SPF 級標準飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學臨床研究中心動物房，溫度（25±2）℃，相對濕度70%，晝夜12 h／12 h，自由飲食飲水。所有動物操作實驗均按貴州醫(yī)科大學動物保護和利用委員會批準的規(guī)程進行。

1.3 試劑與藥物 青藤堿（批號S235901，純度99.88%）、LY294002（批號S110504，純度99.84%）均購自美國Selleck 公司。胎牛血清、RPMI-1640、0.25%胰蛋白酶、0.05% 不含EDTA 的胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；GeenNucTM活細胞caspase-3 活性檢測試劑盒［含GreenNucTMcaspase-3 Substrate與Ac-DEVD-CHO（乙酰基-天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨醛）］（南京碧云天生物技術有限公司）；AV-FITC／PI 凋亡試劑盒（美國BD 公司）；RIPA裂解緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（美國Millipore 公司）；cleaved caspase-3、PCNA、PI3K、p-Akt、Akt 抗體（美國CST 公司）；Ki67抗體（上海愛必信生物科技有限公司）；羊抗鼠、羊抗兔抗體（美國Boster Bio 公司）。

2 方法

2.1 GreenNucTM活細胞caspase-3 活性檢測 取對數(shù)生長期細胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用含10%血清的培養(yǎng)基終止消化后，得到細胞懸液。細胞計數(shù)后，以每孔4×103個的密度接種于96 孔板，待細胞貼壁后分為3組，分別為0 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿＋Ac-DEVD-CHO 抑制劑（20 μmol／L）組，重復3次，各孔加入相應試劑后放入培養(yǎng)箱孵育24 h，用含5 μmol／L GreenNucTMcaspase-3 Substrate 底物的RPIM-1640 培養(yǎng)液進行換液，Ac-DEVD-CHO 抑制劑組補充20 μmol／L 抑制劑。將96 孔板在室溫下避光孵育30 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，設置綠色熒光的濾光片最大激發(fā)波長為500 nm／530 nm，拍照并記錄結果，設置酶標儀激發(fā)波長／發(fā)射波長為485 nm／515 nm，采用酶標儀檢測，并記錄結果。

2.2 Annexin V／PI 雙染色檢測細胞凋亡率 取對數(shù)期生長膽管癌細胞，以每孔5×104個的密度接種6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后分為2組，分別為0 μL LY294002 組、5 μL LY294002（caspase-3 抑制劑）組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集各組細胞，將6 孔板內(nèi)上清液收集于15 mL 離心管中，PBS 清洗，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化細胞，用含血清培養(yǎng)基終止消化，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，加入PBS 至15 mL 離心管中，轉移細胞懸液于流式管內(nèi)，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，每管加入500 μL 1×Binding buffer、5×105個細胞，再加入5 μL AnnexinV FITC 染色液、10 μL PI染色液，輕輕吹打均勻，在4 ℃下避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.3 Western blot 檢測細胞增殖、凋亡及PI3K／Akt信號通路相關蛋白表達 取對數(shù)期生長膽管癌細胞，以每孔5×105個的密度接種于6 孔板中，待其貼壁后進行分組和加藥，24 h 后收集細胞，采用RIPA 裂解液，在4 ℃下提取細胞總蛋白采用，BCA 蛋白法檢測蛋白濃度，與5×Loading buffer 混合后在95 ℃下煮沸10 min，每孔泳道中加入20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳（90 V、2 h），再300 mA 恒流2 h 轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3次，每次15 min，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次15 min，最后使用ECL發(fā)光液曝光顯色，通過ImageJ 1.45s 軟件進行灰度值分析。

2.4 裸鼠皮下成瘤實驗 取對數(shù)期生長膽管癌Hucct-1 細胞，調(diào)整密度為4×106／200 μL，置于冰盒中待用，碘伏、酒精消毒裸鼠皮膚，胰島素針將200 μL 細胞懸液緩慢注射入裸鼠右腋下，形成3～5 mm 的皮丘。Hucct-1 細胞植入24 h后，裸鼠隨機分為生理鹽水組及青藤堿低、高劑量組（75、150 mg／kg），生理鹽水組腹腔注射生理鹽水，青藤堿組腹腔注射PBS 溶解的青藤堿混懸液，每只100 μL，每天1次，每周觀察腫瘤生長情況及生命體征，稱定體質量，游標卡尺測量腫瘤大小并計算其體積。給藥4 周后，乙醚麻醉處死裸鼠，測定腫瘤質量，組織提取蛋白，按“2.3”項下方法進行Western blot 實驗。

2.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 青藤堿抑制膽管癌細胞增殖 如圖1 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，隨著該成分濃度升高，Hucct-1、TFK-1 細胞中增殖關鍵蛋白Ki67、PCNA表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 青藤堿對Hucct-1、TFK-1 細胞中Ki67、PCNA 蛋白表達的影響（， n＝3）Fig.1 Effects of sinomenine on protein expressions of Ki67 and PCNA in Hucct-1 and TFK-1cells（， n＝3）

3.2 青藤堿促進膽管癌細胞凋亡 如圖2 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，1.0 mmol／L 青藤堿干預后Hucct-1、TFK-1 細胞核可見綠色熒光（凋亡細胞），細胞caspase-3 活性升高（P＜0.01）。

圖2 青藤堿對Hucct-1、TFK-1 細胞中caspase-3 活性的影響（， n＝3）Fig.2 Effects of sinomenine on caspase-3 activities in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

3.3 PI3K／Akt 信號通路參與青藤堿誘導凋亡的過程 如圖3 所示，與0 mmol／L 青藤堿組比較，隨著青藤堿濃度升高，Hucct-1、TFK-1 細胞中p-Akt／Akt、PI3K 蛋白表達均降低（P＜0.01）。如圖4 所示，與0 μL LY294002 組比較，5 μL LY294002 干預后能降低Hucct-1、TFK-1 細胞中p-Akt／Akt 蛋白比值和增殖關鍵蛋白Ki67 表達，增加凋亡關鍵蛋白cleaved caspase-3 表達（P＜0.05，P＜0.01）。如圖5 所示，與單用1 mmol／L 青藤堿比較，5 μL LY294002＋1 mmol／L 青藤堿干預后可進一步降低Hucct-1、TFK-1 細胞中p-Akt／Akt、Ki67 蛋白表達，增加cleaved caspase-3 蛋白表達（P＜0.01）。如圖6 所示，與0 μL LY294002 組比較，5 μL LY294002 可促進Hucct-1、TFK-1 細胞的凋亡（P＜0.01）；與單用青藤堿比較，5 μL LY294002 ＋1 mmol／L青藤堿可促進Hucct-1、TFK-1 細胞凋亡（P＜0.01），而且效果優(yōu)于單用LY294002（P＜0.01）。

圖3 青藤堿對Hucct-1、TFK-1 細胞中PI3K／Akt 通路的抑制作用（， n＝3）Fig.3 Inhibitory effects of sinomenine on PI3K／Akt pathway in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖4 LY294002 對Hucct-1、TFK-1 細胞中增殖與凋亡關鍵蛋白的影響（， n＝3）Fig.4 Effects of LY294002 on the key proteins responsible for proliferation and apoptosis in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖5 青藤堿聯(lián)合LY294002 對Hucct-1、TFK-1 細胞中關鍵蛋白增殖與凋亡的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of combination use of sinomenine and LY294002 on the key proteins responsible for proliferation and apoptosis in Hucct-1 and TFK-1 cells（， n＝3）

圖6 青藤堿聯(lián)合LY294002 對Hucct-1、TFK-1 細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of combination use of sinomenine and LY294002 on the apoptosis of Hucct-1 and TFK-1 cells

3.4 青藤堿在體內(nèi)抑制膽管癌荷瘤生長 如圖7所示，給藥4 周內(nèi)各組裸鼠體質量均無明顯變化（P＞0.05）。如圖8 所示，與生理鹽水組比較，給藥2 周后青藤堿高劑量組對腫瘤生長有較強的抑制作用（P＜0.05），給藥4 周后各劑量組均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。如圖9所示，與生理鹽水組比較，青藤堿各劑量組裸鼠荷瘤組織細胞中Ki67、p-Akt／Akt 蛋白表達隨劑量增加而降低（P＜0.01），cleaved caspase-3 蛋白表達隨著劑量增加而升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 各組裸鼠體質量變化（， n＝6）Fig.7 Body weight changes of nude mice in each group（， n＝6）

圖8 各組裸鼠腫瘤體積、質量變化（， n＝6）Fig.8 Changes of tumor volumes and weights of nude mice in each group（， n＝6）

圖9 各組裸鼠腫瘤組織中關鍵蛋白表達（， n＝6）Fig.9 Expressions of key proteins in tumor tissues of nude mice in each group（， n＝6）

4 討論

膽管癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的肝膽腫瘤，其起病初期隱蔽，診斷困難，雖然相關治療取得了很大進展，但5 年生存率仍不理想［16-17］。目前，臨床上許多抗腫瘤藥物都存在免疫抑制、副作用大、價格昂貴、效果有限等問題，故尋找一種新型、廉價、低毒的藥物來提高患者的生活質量是非常迫切的。

青藤堿是從青藤中提取的活性成分，可在體外對膽管癌發(fā)揮優(yōu)秀的抑制作用［15］，但其分子機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁膽管癌組織與正常膽管組織比較，PI3K／Akt 通路在膽管癌組織中異常激活，表現(xiàn)出高表達水平［5-6］，提示其異常激活可能對促進膽管癌細胞增殖起到積極的促進作用，抑制此通路可起到良好的抗膽管癌作用。大量報道顯示，青藤堿抗癌作用與PI3K／Akt 通路密切相關［11，14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，青藤堿可顯著抑制膽管癌細胞中PI3K／Akt 信號通路和細胞株增殖，并誘導其凋亡。

前期發(fā)現(xiàn)，腹腔注射75 mg／kg 青藤堿可在裸鼠體內(nèi)發(fā)揮優(yōu)異的抗食管鱗狀細胞癌作用［18］；在150 mg／kg劑量下，可顯著改善小鼠乳腺癌細胞對骨的破壞［19］；在75、150 mg／kg 劑量下，可較好地抑制人乳腺癌腫瘤的生長［20］。因此，本實驗采用裸鼠建立皮下成瘤模型，每天腹腔注射給藥，發(fā)現(xiàn)相較于模型組，青藤堿治療組小鼠體質量并無明顯變化，但隨著其給藥劑量增加，對腫瘤生長的抑制作用增強，并且cleaved caspase-3 蛋白表達升高，Ki67、p-Akt／Akt 蛋白表達降低。

綜上所述，青藤堿可通過PI3K／Akt 途徑有效抑制膽管癌細胞增殖，并誘導其凋亡，具有明顯的抗膽管癌作用，可為臨床相關治療提供新視角，但該成分正式應用于臨床還需作進一步探索。