甘青青蘭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

范瑩瑩馬青青楊鳳梅張煒駱桂法

（青海省藥品檢驗(yàn)檢測院，青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家藥品監(jiān)督管理局中藥藏藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810016）

甘青青蘭又名“唐古特青蘭”“隴塞青蘭”，是藏醫(yī)習(xí)用藥，常用于治療肝炎、胃炎、黃水類病，為唇形科植物甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim 的干燥地上部分，始載于《四部醫(yī)典》，生長在海拔3 000～4 600 m 的河谷階地、荒坡草灘、灌叢林緣，產(chǎn)于西藏東部、青海和甘肅西南部，四川西部［1-3］，主要有黃酮、萜類、多糖、無機(jī)元素、揮發(fā)油等成分［4-6］，具有抗缺氧、抗菌、抗病毒、降血糖等作用［7-12］，作為藏族民間常用藥大多入丸、散劑，常用相關(guān)品種有大月晶丸、秘訣清涼散、二十六味通經(jīng)膠囊等，臨床上還用其花季鮮全草提取的精油外涂加穴位按摩，用于亞健康的赤巴癥調(diào)理。但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 1995 年版藏藥第一冊）中甘青青蘭項(xiàng)下僅有基原、性狀、鑒別項(xiàng)，專屬性不強(qiáng)，缺乏必要的定量控制指標(biāo)，無法有效控制藥材質(zhì)量，目前也鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，在參考甘青青蘭及其近似種研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)建立了該藥材定性鑒別和定量測定方法，可為其整體質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Linomat 5 半自動(dòng)薄層點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司）；LC-20A 高效液相色譜儀，配置PDA 檢測器（日本島津公司）；E2695 型高效液相色譜儀，配置2998PDA 檢測器（美 國 Waters公司）；PURELAB Ultra Mk2 型純水儀（威立雅水處理技術(shù)有限公司）；AR5120 型電子天平（美國奧豪斯公司）；AUW220D 型電子天平（日本島津公司）；DT1028 CH 超聲波提取器（德國Bandelin 公司）。聚酰胺薄膜（浙江臺(tái)州四甲生化塑料廠）；Silica gel 60 型高效硅膠薄層層析板（德國Merck 公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠或自制）。甘青青蘭對照藥材（批號121529-201102）、齊墩果酸對照品（批號110709-201607）、綠原酸對照品（批號110753-201817，純度96.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；胡麻素-6-O-葡萄糖苷對照品（純度≥98%）由中國科學(xué)院西北高原生物研究所研制并提供。本實(shí)驗(yàn)從青海、甘肅、西藏、四川各地采集甘青青蘭共18批，經(jīng)西北高原生物研究所盧學(xué)峰教授鑒定為正品。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別

2.1.1 齊墩果酸 取甘青青蘭藥粉約1 g，加入10 mL 無水乙醇，超聲處理30 min，濾過，濾液通過活性炭小柱，濃縮至約2 mL，作為供試品溶液；取甘青青蘭對照藥材1 g，同法制備對照藥材溶液；取齊墩果酸對照品約5 mg，精密稱定，無水乙醇制成每1 mL 含1 mg 該成分的溶液，作為對照品溶液。吸取以上3 種溶液各5 μL，點(diǎn)樣于gel 60 型高效硅膠薄層色譜板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14∶4∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液顯色，加熱至斑點(diǎn)清晰后在紫外燈（365 nm）下檢查，結(jié)果見圖1。由此可知，在甘青青蘭對照藥材、齊墩果酸對照品相應(yīng)位置上，各批樣品均顯示相同的橙紅色熒光斑點(diǎn)。

圖1 齊墩果酸TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of oleanolic acid

2.1.2 綠原酸 取甘青青蘭藥粉約0.5 g，加入20 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過，蒸干濾液，加2 mL 甲醇溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤?；再?.5 g 甘青青蘭對照藥材，同法制備對照藥材溶液；取綠原酸對照品約5 mg，精密稱定，甲醇制成每1 mL含1 mg 該成分的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3 種溶液各1 μL，點(diǎn)樣于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸（30∶5∶5∶20∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖2。由此可知，在與甘青青蘭對照藥材、綠原酸對照品相應(yīng)位置上，各批樣品均顯示相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。

圖2 綠原酸TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of chlorogenic acid

2.2 HPLC 定量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～20 min，95%～85% B；20～25 min，85%～82% B；25～50 min，82%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長325 nm，色譜圖見圖3。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)，不低于3 000。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷對照品適量，50% 甲醇制成每1 mL分別含兩者233.3、207.7 μg 的貯備液，取適量，50% 甲醇制成每1 mL 分別含兩者116.6、83.1 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取甘青青蘭粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入50 mL50%甲醇，超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理30 min，50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液 2、4、10、12、16、20 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積積分值（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷方程分別為Y＝3.067×106X＋5.962×103（r＝0.999 9）、Y＝1.976×106X-3.669×104（r＝0.999 9），分別在0.23～2.33、0.17～1.67 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷峰面積RSD 分別為0.2%、0.1%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液（1 號）10 μL，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷峰面積RSD 分別為0.2%、0.3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（1 號）6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷含量RSD 分別為0.6%、0.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 耐用性試驗(yàn) 選擇沃特世e2695 高效液相色譜 儀（Agilent Extend C18色譜柱，4.6 mm ×250 mm，5 μm）、安捷倫高效液相色譜儀（Agilent ECLIPSE XDB C18色譜柱，4.6 mm × 250 mm，5 μm）、島津LC20AT 高效液相色譜儀（Waters XBridge C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，供試品溶液中各成分色譜峰的峰形對稱，分離度良好，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知（綠原酸8.92 mg／g、胡麻素-6-O-葡萄糖苷8.30 mg／g）的甘青青蘭粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入含綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷0.045 48、0.041 02 mg／mL 的50%甲醇50 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.10 樣品含量測定 取18 批甘青青蘭，每批2份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 討論

3.1 TLC 定性鑒別 本實(shí)驗(yàn)選擇甘青青蘭中的萜類化合物齊墩果酸、苯丙素類化合物綠原酸作為指標(biāo)成分，固定相分別采用硅膠G 薄層板、聚酰胺薄膜，還增加了對照藥材，可提高TLC 法專屬性。同時(shí)，分別采用不同廠家生產(chǎn)的硅膠G 薄層板、聚酰胺薄膜，在不同溫度、相對濕度下進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同條件下上述2 種成分均得到較好的分離，主斑點(diǎn)清晰，Rf值適中。

3.2 HPLC 定量測定 本實(shí)驗(yàn)選擇綠原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷作為指標(biāo)成分，其中前者具有抗菌、抗病毒、降脂、降糖、保護(hù)心血管等作用［13-16］，與甘青青蘭藥效相關(guān)，是藥材有效成分，而后者相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。結(jié)果，綠原酸含量在0.57%～2.48%范圍內(nèi)，平均1.32%；胡麻素-6-O-葡萄糖苷含量在0.01%～2.07% 范圍內(nèi)，平均0.72%，由于后者地域差異明顯，藥理作用不明確，故不建議列入甘青青蘭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。另外，由于梯度洗脫耗時(shí)、不環(huán)保，故采用等度洗脫對綠原酸含量進(jìn)行測定，并規(guī)定其限度為按干燥品計(jì)算，不得低于1.0 %。