HPLC 法同時測定復(fù)方瘡瘍搽劑中7 種成分

曹賀龔雪姬生國

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州510006； 2.廣州大學(xué)城健康產(chǎn)業(yè)科技園投資管理有限公司，廣東 廣州510006）

復(fù)方瘡瘍搽劑為老中醫(yī)經(jīng)驗方，由金銀花、大黃、黃柏、當(dāng)歸等中藥組成［1］，方中金銀花為君藥［2］，以其甘、寒之性起清熱解毒、散癰消腫之效［3］；大黃、當(dāng)歸為臣藥［4］，起涼血解毒、逐淤通經(jīng)、活血止痛之效［5］；佐以五倍子、烏梅，以達斂瘡止血之效［6-7］，諸藥配伍，共奏散瘀消腫，托毒生肌、抗菌消炎、斂瘡作用［8］，用于治療外傷、瘡瘍、甲溝炎、口腔潰瘍［9-11］、糖尿病足潰瘍［12-13］等病癥。前期對復(fù)方瘡瘍搽劑制備工藝進行優(yōu)化［14］，最終確定為金銀花、當(dāng)歸用水蒸氣蒸餾法收集芳香水［15］，藥渣同其余藥材一同煎煮2次，合并煎煮液，濃縮后回收乙醇，即得。

為了更好地對復(fù)方瘡瘍搽劑質(zhì)量進行有效控制，本實驗采用HPLC 法同時測定該制劑中鹽酸小檗堿、綠原酸、沒食子酸、阿魏酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素的含量的含量，以期確保該制劑臨床應(yīng)用的安全有效。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀，配置PDA 2998 二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；AY120 電子天平（十萬分之一，日本島津公司）。

1.2 試劑與藥物 鹽酸小檗堿（批號110713-200910，純度 97.9%）、綠原酸（批 號 MUST-17030620，純度99.39%）、沒食子酸（批號MUST-16022801，純度99.04%）、阿魏酸（批號MUST-17010908，純度99.32%）、蘆薈大黃素（批號MUST-16031605，純度98.64%）、大黃酸（批號MUST-16031604，純度98.68%）、大黃素（批號MUST-16031601，純度98.40%）對照品均購自中國科學(xué)院成都生物研究所。復(fù)方瘡瘍搽劑（自制，批號20160823、20160825、20160827、20160829、20160831、20160902）。乙腈為色譜純（德國默克公司）；其他試劑均為分析純；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 美國Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～95%B；5～7 min，7%～93%B；7～15 min，11%～89%B；15～25 min，13%～87%B；25～40 min，18%～82%B；40～50 min，30%～70% B；50～100 min，85%～15%B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長315 nm（0～11.00 min）、320 nm（11.01～25.30 min）、358 nm（25.31～90.00 min）、440 nm（90.01～125.00 min）；進樣量5 μL。

2.2 供試品溶液制備 取本品50 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，50%甲醇制成分別含沒食子酸1.54 mg／mL、綠原酸1.016 mg／mL、阿魏酸0.104 mg／mL、鹽酸小檗堿0.120 mg／mL、蘆薈大黃素0.008 mg／mL、大黃酸0.042 mg／mL、大黃素0.023 mg／mL 的貯備液，分別精密量取1 mL（綠原酸儲備液2 mL），置于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按本品處方工藝，分別制備缺金銀花，缺當(dāng)歸，缺烏梅，缺五倍子，缺訶子，缺大黃，缺黃柏，缺五倍子、訶子，缺金銀花、烏梅，缺金銀花、當(dāng)歸、烏梅陰性樣品，按“2.2”項下方法制備，即得。

2.5 專屬性考察 吸取供試品、對照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分色譜峰在對照品溶液相應(yīng)位置上一致，陰性樣品溶液對測定無影響，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項下對照品溶液3、5、10、15、20、25 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液（批號20160823）5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各成分峰面積RSD 分別為沒食子酸0.43%、綠原酸0.37%、阿魏酸1.92%、鹽酸小檗堿0.75%、蘆薈大黃素0.70%、大黃酸0.89%、大黃素0.85%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批本品（批號20160823）適量，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD 分別為沒食子酸1.11%、綠原酸1.05%、阿魏酸1.91%、鹽酸小檗堿1.12%、蘆薈大黃素1.19%、大黃酸0.80%、大黃素1.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液（批號20160823）5 μL，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD 分別為沒食子酸0.61%、綠原酸0.63%、阿魏酸1.90%、鹽酸小檗堿0.81%、蘆薈大黃素1.00%、大黃酸0.66%、大黃素1.00%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密吸取同一份供試品溶液（批號20160823）2、15 mL，平行6份，精密加入對照品沒食子酸6.00 mg、綠原酸6.36 mg；精密稱取阿魏酸6.40 mg、鹽酸小檗堿6.55 mg、蘆薈大黃素5.50 mg、大黃酸6.30 mg、大黃素9.00 mg，50% 甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.006 4、0.013 1、0.001 1、0.006 3、0.001 8 mg／mL的溶液，分別精密吸取1 mL，再精密吸取同一份供試品溶液（批號20160823）1 mL，一同置于2 mL 量瓶中，50%甲醇定容，同法平行制備6份，分別精密吸取5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，沒食子酸平均加樣回收率為99.36%，RSD 為0.03%；綠原酸平均加樣回收率為96.34%，RSD 為0.09%；阿魏酸平均加樣回收率為96.34%，RSD 為0.09%；鹽酸小檗堿平均加樣回收率為97.16%，RSD 為0.04%；蘆薈大黃素平均加樣回收率為100.96%，RSD 為1.56%；大黃酸平均加樣回收率為97.62%，RSD 為0.67%；大黃素平均加樣回收率為99.96%，RSD 為1.23%。

2.11 樣品含量測定 取6 批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，每批平行5次，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（mg／mL， n＝5）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／mL， n＝5）

3 討論

3.1 流動相選擇 本實驗考察不同流動相對各成分色譜峰分離的影響，發(fā)現(xiàn)加入一定量磷酸可優(yōu)化峰形，改善分離效果，并隨著其體積分數(shù)升高效果更明顯，但酸度越高，對色譜柱的損傷也越大，而且色譜柱所承受的pH 范圍也較窄。最終確定，流動相為乙腈-0.2%磷酸。

3.2 溫度選擇 本實驗分別考察在20、25、30、35 ℃柱溫下各成分色譜峰分離情況，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫升高，色譜峰保留時間提前，在20 ℃下出峰少，峰矮?。?5 ℃下峰型理想，分離度良好；30、35℃下出峰時間提前，但其分離度有所降低。最終確定，柱溫為25 ℃。

3.3 檢測波長選擇 各成分極性跨度大，在單一波長下溶劑峰和雜質(zhì)峰對其影響較大，故采用定時波長進行檢測，分別設(shè)定為0～11.00 min，315 nm；11.01～25.30 min，320 nm；25.31～90.00 min，358 nm；90.01～125.00 min，440 nm。

3.4 指標成分選擇 復(fù)方瘡瘍搽劑中金銀花主要成分為綠原酸，當(dāng)歸主要成分為阿魏酸，大黃主要成分為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素，黃柏主要成分為鹽酸小檗堿，烏梅、五倍子、訶子主要成分為沒食子酸，故選擇上述7 種成分作為指標。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC 法同時測定復(fù)方瘡瘍搽劑中鹽酸小檗堿、綠原酸、沒食子酸、阿魏酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素的含量，該方法穩(wěn)定可靠，可更好地對該制劑質(zhì)量進行控制，并為相關(guān)新藥開發(fā)提供參考。