頂空-氣相色譜法對芹菜中代森鋅殘留量的測定

劉 帥，張 欣，王嘉樂，陳 炎，唐雪妹，萬 凱

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測技術(shù)研究所 廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

代森鋅作為乙撐雙二硫代氨基甲酸鹽(EBDCs)類保護(hù)性殺菌劑，能阻礙各種微生物的生長，廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹、麥類和煙草等作物真菌病害，可防治花生葉斑病，馬鈴薯晚疫病，番茄早疫病，蘋果樹炭疽病和斑點(diǎn)落葉病等[1]。盡管代森鋅屬于低毒農(nóng)藥，但越來越多的研究表明代森類物質(zhì)對人體具有較強(qiáng)的毒性機(jī)制，其殘留物會受熱分解成毒性較高的亞乙基硫脲(ETU)，有致甲狀腺癌作用[2，3]，并通過富集和滯留作用進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)?？梢?，代森鋅農(nóng)藥在環(huán)境要素中，尤其是食用作物上的殘留需要引起人們的重視[4]。

芹菜(ApiumgraveolensL.)作為一種高營養(yǎng)價(jià)值的小宗蔬菜，富含氨基酸、膳食纖維等營養(yǎng)元素和黃酮類物質(zhì)、抗氧化劑等藥理活性成分[5]，作為生長周期短、病蟲發(fā)生重、用藥頻次高的“三棵菜”之一，其主要病害以真菌引起的芹菜軟腐病和斑點(diǎn)病為主[1]，而代森鋅作為保護(hù)性殺菌劑，在蔬菜的病蟲害防治上發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外針對二硫代氨基甲酸鹽類農(nóng)藥檢測方法主要有分光光度法(Keppel法)、薄層層析法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法和液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[6-8]，其中以氣相色譜法最為普遍。我國GB 2763-2021上對代森類藥物在農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量均以CS2計(jì)[9]，推薦檢測方法為以氣相色譜儀(ECD)為檢測工具的SN 0139、SN 0157、SN/T 1541標(biāo)準(zhǔn)，原理是利用氣密性注射器吸取上層二硫化碳(CS2)氣體進(jìn)行手動進(jìn)樣檢測；另外，其他文獻(xiàn)報(bào)道的使用氣相色譜儀測定吸收了二硫化碳的正己烷溶液也是常用于檢測代森類殘留物的一種手段[10-11]。但以上方法處理過程中存在自動化程度低、平行性較差、基質(zhì)效益、CS2/代森鋅的質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)不確定等問題。針對上述情況，本文研究以芹菜為供試對象，通過在密閉系統(tǒng)中與還原性酸溶液反應(yīng)釋放出CS2，利用自動頂空進(jìn)樣器吸取上層氣體供氣相色譜儀(FPD)測定的方式，建立了一種操作簡單、快速高效、正確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留檢測要求的分析方法，為代森鋅的檢測方法研究提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑 代森鋅標(biāo)準(zhǔn)品(純度>90%)；SnCl2.2H2O(分析純)；濃鹽酸(優(yōu)級純，36%～38%)；重蒸餾去離子水；氯化鈉。

1.2 儀器 GC-2010Puls氣相色譜儀，配備火焰光度檢測器(S)；島津HS-10頂空進(jìn)樣器；20mL頂空瓶(含聚四氟乙烯密封墊和密封鋁蓋)；電子天平；恒溫干燥箱。

1.3 測定條件

1.3.1 自動頂空儀測定條件 爐溫60℃，1mL定量環(huán)80℃，傳輸線90℃， 樣品平衡15min，進(jìn)樣0.5min，GC 循環(huán)25min，加壓時(shí)間0.5min，進(jìn)樣時(shí)間0.5min。

1.3.2 氣相色譜儀條件 色譜柱：DB-624，60m×0.53mm×3μm，柱流量 5mL/min；進(jìn)樣口溫度200℃，檢測器溫度250℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：35℃保持5min，6℃/min升溫至85℃，保持3min。

1.4 代森鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

1.4.1 代森鋅標(biāo)準(zhǔn)樣品配制 準(zhǔn)確稱取代森鋅標(biāo)準(zhǔn)品10mg(精確到0.01mg)，用蒸餾水稀釋定容到10ml并搖勻，此時(shí)代森鋅的質(zhì)量濃度為1 000mg/L，并且每次使用前搖勻。使用蒸餾水將質(zhì)量濃度為1 000mg/L的代森鋅標(biāo)準(zhǔn)品逐級稀釋成濃度為20、50、100、150、200、500、800、1 000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析液。

1.4.2 代森鋅標(biāo)準(zhǔn)樣品分析 取4.0mL標(biāo)準(zhǔn)曲線分析液放入到20mL裝有2g NaCl的頂空瓶中，加入8mL SnCl2-HCl溶液，迅速蓋緊瓶蓋，放入80+2℃烘箱中酸解2h， 每隔20min搖1次。取出冷卻至室溫，供頂空-氣相色譜儀(HS-GC-FPD(S))測定。在設(shè)定的氣相測定條件下，以標(biāo)準(zhǔn)工作曲線各點(diǎn)代森鋅濃度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)測定的色譜峰響應(yīng)值(峰面積)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.5 樣品分析 以勻漿后的芹菜基質(zhì)作為供試對象，取4.0g試樣于裝有2g NaCl的20mL頂空瓶中，加入8mLSnCl2-HCl溶液，迅速壓緊瓶蓋后放入80+2℃烘箱中酸解2h， 每隔20 min搖1次。取出冷卻至室溫，供頂空-氣相色譜儀(HS-GC-FPD(S))測定。

2 結(jié)果

2.1 空白試驗(yàn) 分別稱取4.0g芹菜進(jìn)行空白處理(圖1-A)，0.1mg/kg濃度水平的添加回收試驗(yàn)(圖1-B)，同時(shí)用等質(zhì)量的蒸餾水代替芹菜試樣進(jìn)行同濃度水平的CS2添加試驗(yàn)(圖1-C)。通過圖1對比分析可知，在本方法條件下，CS2的保留時(shí)間為8.413min，而代森鋅經(jīng)過反應(yīng)后，在相同的前處理方法和儀器條件下，CS2的色譜峰出峰時(shí)間為8.419min，并且所選基質(zhì)中未檢測出代森鋅轉(zhuǎn)化為CS2的農(nóng)藥殘留。

2.2 工作曲線 本試驗(yàn)采用代森鋅工作曲線的方法進(jìn)行定量，以 CS2量代表代森鋅殘留量建立了代森鋅工作曲線。結(jié)果表明，代森鋅的濃度(x， μg/L)在20～1 000μg/L范圍內(nèi)與CS2峰面積(y)呈2階多項(xiàng)式關(guān)系。由于代森鋅在高濃度下的CS2峰面積顯示較大，因此采用分段計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方式進(jìn)行定量，在20～200μg/L的曲線方程為y = 37.55x2+ 4 796.7x - 105 225(R2=0.998 2)；在100～1000μg/L的曲線方程為y = 298.6 x2- 114 128.1 x + 11 158 853(R2=1)。

2.3 方法正確度與精密度、定量限 稱取4g空白樣品，分別進(jìn)行0.05、0.1、1.0 mg/kg的3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加回收率試驗(yàn)，按照1.4代森鋅標(biāo)準(zhǔn)樣品處理方法和1.5樣品處理方法測定，分別計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。其中0.05和0.1mg/kg添加回收試驗(yàn)使用范圍在20～200μg /L的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，1.0mg/kg的添加回收試驗(yàn)使用范圍在100～1000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，結(jié)果(表1)?？芍?，代森鋅在芹菜中的回收范圍為82.4%～103.4%，RSD范圍為4.0%～5.2%，該方法正確度及精密度良好，可滿足芹菜中代森鋅殘留的分析要求。按照最低添加濃度進(jìn)行回收率試驗(yàn)，方法定量限為0.05mg/kg。

表1 芹菜中代森鋅的添加回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 不同振蕩間隔對CS2產(chǎn)出的影響 本方法在前處理過程中會產(chǎn)生CS2氣體，并通過酸解振蕩過程釋放，但有關(guān)振蕩間隔是否是提高CS2產(chǎn)出的研究報(bào)告較少。針對此現(xiàn)象，本研究分別考察了在80℃的0.1mg/kg添加濃度水平下，15、20、30、45、60min的不同振蕩間隔對CS2產(chǎn)出的影響，結(jié)果(圖2)，可知，合理的振蕩間隔能增加CS2產(chǎn)出，當(dāng)振蕩間隔為<20min時(shí)CS2產(chǎn)出效果較高，>30min后，CS2產(chǎn)出存在顯著性差異，因此本研究最終確度振蕩間隔為20min。

圖2 不同振蕩時(shí)間對CS2產(chǎn)出的影響

2.5 樣品測定 分別對不同來源的6份芹菜樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果(表2)。代森鋅殘留物在農(nóng)貿(mào)市場環(huán)節(jié)抽取的一份樣品中有檢出，殘留量為0.069mg/kg。

表2 不同來源芹菜中代森鋅殘留量

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制及轉(zhuǎn)化率 代森鋅標(biāo)樣為粉末狀，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、丙酮等)，常見配制標(biāo)樣方式為固體配制(石滑粉、無水硫酸鎂、硅藻土等)[9，10，12]或液體配制(去離子水，室溫水中溶解度為10mg/L)[13]。為保證代森鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)際樣品質(zhì)量的一致性，本研究采用去離子水對代森鋅標(biāo)樣進(jìn)行稀釋定容，并且每次使用前采用超聲溶解5 min，添加標(biāo)樣時(shí)進(jìn)行渦旋振蕩，確保代森鋅粉末在去離子水中分散均勻，此外頂空瓶的標(biāo)準(zhǔn)化瓶蓋、壓瓶器和耐壓性也是決定試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵步驟。目前，代森鋅在農(nóng)產(chǎn)品上的農(nóng)藥殘留含量是以測定酸解產(chǎn)生的二硫化碳的量來表述，這不可避免的需要測定代森鋅在基質(zhì)中的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(理論折算系數(shù)為1.81，回收率100%)，而研究表明，代森鋅轉(zhuǎn)化率隨其含量的增加而降低，且在不同環(huán)境下的代森鋅轉(zhuǎn)化率并不相同，可能與反應(yīng)試劑量和基質(zhì)色素有關(guān)[14]。如代森鋅在萵筍和葉用萵苣中的轉(zhuǎn)化率分別為90.4%和92.0%，而在芹菜和芒果上的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到96.7%和97.0%[10，14，15]，由此可見，轉(zhuǎn)化率的代入會給代森鋅殘留量的定量分析帶來困難。針對上述情況，本試驗(yàn)以 CS2量代表代森鋅殘留量建立了代森鋅的工作曲線，消除了由于CS2代森鋅的質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)帶來的不確定性，對代森鋅母體殘留量的測定更加科學(xué)、可靠。

3.2 自動頂空進(jìn)樣的應(yīng)用 除頂空進(jìn)樣檢測方法外，文獻(xiàn)報(bào)道的其他二硫代氨基甲酸鹽類檢測方法主要原理為溶劑吸收法，通常為在密閉的頂空瓶中添加正己烷溶液，目標(biāo)農(nóng)藥與SnCl2-HCl溶液酸解，生成的CS2氣體被正己烷吸收，后經(jīng)火焰光度檢測器(FPD)或電子捕獲檢測器(ECD)檢測。雖然此方法比Keppel方法更加簡單高效，但因?yàn)槭侨軇┻M(jìn)樣，往往存在較強(qiáng)的基質(zhì)效益，尤其是針對含油量高的作物，如花生、大豆、植物油等樣品中的油脂類物質(zhì)也溶于正己烷有機(jī)相，造成樣品本底干擾和儀器污染，導(dǎo)致方法的重復(fù)性及精密度較差。秦曙[9]等人的研究表明，采用溶劑吸收法測定代森錳鋅時(shí)，在花生中的數(shù)據(jù)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到22%。另外，現(xiàn)行SN 0139等標(biāo)準(zhǔn)方法中進(jìn)樣方式為手動進(jìn)樣，易受到酸解后容器上層體積溫度、平衡時(shí)間以及樣品進(jìn)樣時(shí)間、速度的影響。而本試驗(yàn)以自動頂空進(jìn)樣器為基礎(chǔ)，較好地解決了上述問題，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定進(jìn)樣，且前處理過程無需加入正己烷吸收CS2氣體，有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3.3 進(jìn)一步研究方向 本文雖然探討了不同振蕩間隔對CS2含量的影響，結(jié)果顯示當(dāng)振蕩間隔小于20min時(shí)產(chǎn)出CS2效果較好，但由于二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥范圍廣泛，其處理后均以CS2形式存在，在氣相色譜中難以區(qū)分其母體，目前也尚未出現(xiàn)利用氣相色譜測定其中單一化合物的方法。近年來，前處理衍生化是對二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行區(qū)分檢測的重點(diǎn)研究方向，利用甲基化衍生原理檢測其甲基化產(chǎn)物，有學(xué)者[16～18]研究用堿性EDTA溶液處理，使二硫代氨基甲酸酯的鋅鹽轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄遭c鹽，經(jīng)碘甲烷烷基化后供氣相色譜儀或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，雖然前處理較為繁瑣，耗時(shí)長，但靈敏度和重現(xiàn)性好，可使代森鹽類化合物在茶葉和水體中的定量限達(dá)到0.01mg/kg，且利用質(zhì)譜手段能區(qū)分不同結(jié)構(gòu)類型和殺菌劑母體及其代謝物，具有較好的研究前景。

4 結(jié)論

本文利用頂空進(jìn)樣-氣相色譜火焰光度檢測器(GC-FPD-S)建立了測定芹菜中代森鋅殘留量的方法，該方法通過自動頂空進(jìn)樣裝置，更加方便簡單，操作性強(qiáng)，正確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析要求，為芹菜中代森鋅殘留量的檢測提供了新思路。