液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中丙硫多菌靈的殘留量

楊 森

(畢節(jié)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

丙硫多菌靈屬于苯并咪唑類農(nóng)藥，是1975年由美國史克制藥公司研制成功的一種苯并咪唑類驅(qū)蟲藥[1]。目前該藥在茶樹上用于防治茶樹茶枝梢黑點病和茶餅病以及殘留檢測均未見相關(guān)報道。在殘留檢測方面，該藥在動物肌肉組織中的MRL值規(guī)定為0.1mg/kg[2]。

茶葉是世界上消費最為普遍的飲用產(chǎn)品，國內(nèi)外對茶葉的需求量日益增長，隨之對質(zhì)量安全也越來越嚴(yán)[3]。在茶葉的生產(chǎn)過程中，需要對殘留量進行檢測，最大能力滿足無公害的標(biāo)準(zhǔn)[4]，無公害茶有綠色茶、有機茶等[5]。但由于近年來受溫度等影響病蟲害加重，在防治措施上缺乏科學(xué)合理的使用農(nóng)藥，盲目追求產(chǎn)量而大量使用農(nóng)藥損害人類健康，目前對于該類農(nóng)藥的的檢測方法有高效液相色譜法[6-8]、液相-色譜分析法[9-10]、免疫分析法[11-12]、LC-MS/MS檢測法等[13]。目前該藥于農(nóng)作物只有在煙草、水稻和香蕉上見過相關(guān)研究[14-16]，在茶葉中的檢測分析尚未見報道。本研究在貴州省畢節(jié)市自行田間試驗的基礎(chǔ)上動態(tài)觀察茶葉的各個生長周期，采用不同比例兌水施藥最終得出防治茶葉的關(guān)鍵施藥時間、稀釋倍數(shù)、施藥次數(shù)以及安全采收期，對最終采收(明前茶即一葉一芽)的茶葉進行殘留量檢測，為茶葉的常見病害防治技術(shù)和殘留檢測提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：Waters ACQUITY UPLC (美國Waters公司)；色譜柱： C18(2.1×50 mm，1.7μm)；高效液相色譜儀：(LC-20ADXR型)；質(zhì)譜儀(4000QTRAP型)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000A型)；渦旋混合器(VORTEX4)；氮吹儀(CM-24S型)。

試劑：甲醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、二氯甲烷，超純水，氯化鈉，硅藻土，無水硫酸鈉，丙硫多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品 (純度97.6%)。

1.2 色譜實驗條件

1.2.1 液質(zhì)聯(lián)用儀的儀器參數(shù) 電噴霧離子源，ESI+掃描模式，離子噴霧電壓5600V，離子源溫度560°C，輔助氣壓1(N2) 365.8kPa，輔助氣壓2(N2) 365.8kPa，氣簾氣壓力202.5kPa。多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式及具體參數(shù)(表1)。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)數(shù)據(jù)表

1.2.2 液相色譜的儀器參數(shù) 色譜柱：C18(2.1×50mm，1.7μm)；柱溫為25℃，進樣量是2.0μL，流速為0.5mL/min。液相色譜梯度洗脫條件(表2)。保留時間為5.0min。

表2 液相色譜梯度洗脫條件

1.3 分析方法的建立

1.3.1 儀器的選擇 丙硫多菌靈對熱不穩(wěn)定，因此不適用氣相色譜直接分析，該藥物在Aglient1100高效液相色譜儀(DAD)上有響應(yīng)，但是靈敏度較低，樣品分析時間過長，達不到實驗要求；而在Waters Acuuity UPLC H-Class 超高效液相色譜儀(PDA)具有較高的響應(yīng)，峰形好。最后采用高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)探索色譜條件。

1.3.2 質(zhì)譜條件的選擇 采用流動注射質(zhì)量濃度為0.20μg/mL的單標(biāo)工作液對丙硫多菌靈的參數(shù)進行優(yōu)化。對離子源溫度、離子噴霧電壓、碰撞能量等條件進行優(yōu)化。通過Q1 MS掃描得到分子離子峰，再優(yōu)化錐孔電壓的數(shù)值，并得到定量和輔助定性離子，再在Product Ion模式下優(yōu)化碰撞能量，然后用優(yōu)化得到的質(zhì)譜條件進行MRM監(jiān)測。經(jīng)過反復(fù)測試并優(yōu)化，最終得出丙硫多菌靈殺菌劑的優(yōu)化質(zhì)譜條件。

1.3.3 最適色譜柱和最大吸收波長的選擇 本方法在超高效液相色譜中，選用了C18(2.1×50 mm，1.7μm)色譜柱峰形好，運用全波長掃描觀察得知，在波長為254nm的時候，響應(yīng)高，無其他基質(zhì)的影響，峰形對稱呈正態(tài)分布；在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中，選用C18(2.1×50 mm，1.7μm)色譜柱不僅響應(yīng)高、峰形好，還能夠?qū)⒎治鑫锱c雜質(zhì)進行有效的分離。

1.3.4 最佳流動相組成、比例及流速的選擇 分別試驗了不同比例的甲醇-水、甲醇-水(0.5%冰醋酸)作為流動相進行色譜分離對比。以甲醇-水作為流動相，色譜峰拖尾且峰寬矮胖；以甲醇-水(0.5%冰醋酸)作為流動相體系，發(fā)現(xiàn)選用甲醇-甲醇-水(0.5%冰醋酸)作為流動相采用梯度洗脫，流動相流速為0.3mL/min，靈敏度高，峰形對稱，色譜峰既不前沿也不拖尾，達到理想色譜分離效果。

1.3.5 提取劑的選擇 土壤和茶葉樣品中分別使用不同提取溶劑：石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇，不同提取溶劑的提取結(jié)果(表3)，可知二氯甲烷的提取效果最佳。

表3 茶葉樣品在不同提取劑下的回收率(n=5)

1.4 分析方法

1.4.1 樣品的提取 土壤提?。悍Q取10.0g土壤樣品置于100mL錐形瓶中，加入40mL二氯甲烷，振蕩提取30min后在鋪有Celite545的砂芯漏斗中抽濾，在45℃下旋蒸濃縮近干后用氮氣吹干，最后用1mL甲醇定容，待超高效液相色譜檢測。

茶葉提?。悍Q取5.0g茶葉樣品置于100mL錐形瓶中，然后加入50mL二氯甲烷，渦旋振蕩3min后在鋪有Celite545的砂芯漏斗中抽濾，在45℃下旋蒸濃縮，氮氣吹干，待凈化。

1.4.2 樣品的凈化 茶葉樣品凈化：向梨形瓶中加入0.2g C18和0.15g PSA用1mL甲醇定容，渦旋2min，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，待超高效液相色譜檢測。

在上述色譜條件下，對丙硫多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白、土壤添加和茶葉添加進行上機檢測，獲得如下(圖1)所示的色譜圖。

圖1 丙硫多菌靈檢測型色譜圖(a：空白; b： 土壤添加; c： 茶葉添加0.05 mg/kg; d： 標(biāo)準(zhǔn)樣品0.05 mg/kg)

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將已配制的質(zhì)量濃度為30.0mg/L的母液依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.03、0.30、1.50、7.50、15.00μg/mL 5個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進行測定。以濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程y=24 670x-95.026y=30.12x-9.052，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，丙硫多菌靈在0.03～15.00mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 丙硫多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.5 田間試驗 田間試驗按如下方法設(shè)計：每個小區(qū)的面積為30m2，各處理設(shè)3個重復(fù)，小區(qū)間設(shè)保護行，同時設(shè)空白對照區(qū)。施藥方法按試驗設(shè)計施用劑量稀釋藥液。用10%丙硫多菌靈懸浮劑于茶葉在清明節(jié)前60d進行第1次施藥，第2次噴藥于第1次噴藥后14d施藥，第3次噴藥于第2次噴藥后14d施藥。待清明節(jié)前21d隨機采集一葉一芽鮮葉100g樣品待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的回收率、精密度和定量限 丙硫多菌靈在超高效液相條件下的保留時間在8.2 min左右，最小檢出量為6×10-11g，最低檢出質(zhì)量濃度為0.01mg/kg。丙硫多菌靈在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下的保留時間在5.0min左右，最小檢出量為5.0×10-14g，最低檢出質(zhì)量濃度為0.005mg/kg。

準(zhǔn)確度以平均值表示，土壤中添加試驗濃度分別為0.03、0.15、3.0mg/kg 3檔，茶葉中添加試驗濃度分別為0.03、0.15、3.0mg/kg 3檔。

由表4可知：按上述實驗條件，同一色譜條件下，進行添加回收實驗，土壤和茶葉樣品添加水平為0.03～3.0mg/kg時，平均回收率分別為78.9%～84.5%，81.7%～87.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)分別為4.6%～8.2%，7.1%～8.3%，方法的定量限(LOQ)為0.03mg/kg，回收率和精密度良好，達到農(nóng)藥殘留檢測的要求。

表4 丙硫多菌靈在土壤和茶葉中的添加回收率 (n=5)

3 結(jié)論

目前，我國沒有規(guī)定丙硫多菌靈在茶葉中的殘留限量 (MRL)值，本試驗屬于首次運用LC-MS/MS方法檢測其殘留量，方法的定量限(LOQ)為0.03mg/kg，在茶葉中進行添加回收試驗，添加濃度為0.03mg/kg、0.15mg/kg、3.0mg/kg，測得其添加回收率為73.5%～95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～8.3%。運用該方法操作簡單、定量準(zhǔn)確，可有效適用于茶葉中丙硫多菌靈殘留的定量分析。

茶葉中的丙硫多菌靈在供試地貴州省畢節(jié)市以推薦使用高劑量的1.5倍施藥，施藥3次，距末次施藥間隔21d采收茶葉中未檢出丙硫多菌靈。依據(jù)試驗結(jié)果，用10%丙硫多菌靈懸浮劑防治茶樹茶枝梢黑點病和茶餅病，用藥量兌水比例為1：1000(1000倍液)，施藥3次，效果最佳，清明節(jié)前21d采摘一葉一芽茶葉和土壤中的丙硫多菌靈的檢出量均