基于阿爾茨海默癥模型大鼠的開心散藥動(dòng)學(xué)研究

馮曉曉，王彬斌，陳 東，仇 峰，龔慕辛，李朝霞

基于阿爾茨海默癥模型大鼠的開心散藥動(dòng)學(xué)研究

馮曉曉，王彬斌，陳 東，仇 峰，龔慕辛，李朝霞*

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

表征開心散各成分在寡聚態(tài)β淀粉樣蛋白1-42（β amyloid protein 1-42，Aβ1-42）誘導(dǎo)阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，建立并驗(yàn)證同時(shí)測定大鼠血漿中開心散各成分含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。采用雙側(cè)海馬注射寡聚態(tài)Aβ1-42的方法建立AD大鼠模型，開心散單次ig給藥，于不同時(shí)間點(diǎn)取血，測定各成分的血藥濃度。采用DAS 2.0軟件以非房室模型擬合，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。建立的UPLC-MS/MS方法的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性等方法學(xué)考察結(jié)果均符合生物樣品分析的測定要求。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)成功構(gòu)建AD大鼠模型（＜0.05）。AD模型大鼠給予開心散后，按中藥化學(xué)結(jié)構(gòu)分類的同型化合物具有相似的藥動(dòng)學(xué)特征，如屬于同分異構(gòu)體的α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚、同屬于羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜的去氫土莫酸與松苓新酸以及同屬于3,4-開環(huán)-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜的茯苓新酸A和茯苓新酸B等。α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的達(dá)峰時(shí)間（max）和消除半衰期（1/2）均較短，表明二者在AD模型大鼠體內(nèi)吸收迅速，消除也快；茯苓新酸A和茯苓新酸B的達(dá)峰時(shí)間（max）較短，但二者的半衰期（1/2）卻較長，表明它們吸收迅速，但消除緩慢。去氫土莫酸和松苓新酸達(dá)峰時(shí)間（max）和半衰期（1/2）均較長，吸收和消除緩慢。此外，去氫土莫酸的藥時(shí)曲線存在雙峰現(xiàn)象，其平均滯留時(shí)間（MRT）也較長，這可能源于較強(qiáng)的肝腸循環(huán)，延長了其作用時(shí)間。揭示了AD疾病狀態(tài)下開心散的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程，為闡明開心散成分體內(nèi)過程及其后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

開心散；阿爾茨海默癥；藥動(dòng)學(xué)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；寡聚態(tài)β淀粉樣蛋白1-42；α-細(xì)辛醚；β-細(xì)辛醚；茯苓新酸A；茯苓新酸B；去氫土莫酸；松苓新酸

開心散源自唐代孫思邈所著的《備急千金要方》[1]，由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓4味藥組成，“主好忘”，歷代醫(yī)家記載開心散對(duì)健忘、怔忡等病癥具有良好的治療作用[2-4]。較多現(xiàn)代研究證實(shí)開心散在治療阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）方面具有良好的應(yīng)用前景[5-9]，然而其體內(nèi)過程、起效機(jī)制與臨床合理應(yīng)用尚不明確，有待深入研究。

藥動(dòng)學(xué)研究可揭示中藥復(fù)方中有效成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為闡明復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制提供依據(jù)[10]。目前開心散及其類方的藥動(dòng)學(xué)研究主要聚焦于源自人參和遠(yuǎn)志中的部分化學(xué)成分，如人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、遠(yuǎn)志𠮿酮III、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6等[11-18]，但對(duì)方中源自石菖蒲與茯苓的成分涉及較少。究其原因，可能是因?yàn)槭牌雅c茯苓成分在藥材中含量較低，且生物利用度不高，檢測難度大。本課題組在前期研究中選用臨床應(yīng)用較多的經(jīng)典開心散組方[19-23]，證實(shí)其能夠有效改善AD模型動(dòng)物/轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。鑒于此方重用石菖蒲和茯苓（人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓為1∶1∶25∶50），因此有必要在開展藥動(dòng)學(xué)研究時(shí)重視源自石菖蒲和茯苓2味藥中的成分，以期全面表征開心散的藥動(dòng)學(xué)特征。

此外，AD疾病狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致開心散的體內(nèi)過程發(fā)生改變，影響臨床精準(zhǔn)用藥，故以AD模型動(dòng)物為研究對(duì)象開展藥動(dòng)學(xué)研究可更好地闡明開心散各成分的體內(nèi)過程[24]。因此，本研究選用雙側(cè)海馬CA1區(qū)立體定位注射寡聚態(tài)β淀粉樣蛋白1-42（β amyloid protein 1-42，Aβ1-42）建立AD模型大鼠，建立并驗(yàn)證超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法測定開心散中待測成分的血藥濃度，對(duì)開心散的體內(nèi)過程進(jìn)行研究，以期為開心散的臨床研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SYXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、濕度（50±10）%的屏障環(huán)境內(nèi)，給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng)并自由飲水，每日光照12 h。實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。倫理審查由首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)AEEI-2018-101，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在中華人民共和國科技部頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用的指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 藥材

開心散由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲和茯苓組成。人參（批號(hào)16110803）、石菖蒲（批號(hào)17110103）和茯苓（批號(hào)17111504）購自北京能濟(jì)中藥飲片有限公司，遠(yuǎn)志（批號(hào)16080803）購自北京明輝恒通藥業(yè)有限公司，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳副教授鑒定分別為五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖、天南星科植物石菖蒲Schott.的干燥根莖、多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核和遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.的干燥根，均符合《中國藥典》規(guī)定。

1.3 試劑

開心散待測成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。對(duì)照品α-細(xì)辛醚（批號(hào)PS001187，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、去氫土莫酸（批號(hào)PS011211，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、茯苓新酸A（批號(hào)PS010102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%）、鹽酸丁螺環(huán)酮（批號(hào)6-EOD-111-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）和斯皮諾素（批號(hào)PS000864，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；β-細(xì)辛醚對(duì)照品（批號(hào)11208-201601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品松苓新酸（批號(hào)Y08J7H8750，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、茯苓新酸B（批號(hào)P13J9L63651，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%）購自上海源葉生物科技有限公司；色譜純甲醇、色譜純甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；Aβ1-42購自MCE公司。

1.4 儀器

QTRAP6500型UPLC-QQQ-MS/MS（美國AB Sciex公司）；DV215CD型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；V0400型真空干燥箱（德國Memmert公司）；3K15型低溫高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；MG-2200型氮吹儀（日本EYELA公司）；ZH-2型渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；68025型腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；788130型顯微注射泵（美國KDS公司）；78001型顱鉆（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；63031型水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

圖1 開心散中待測成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 方法

2.1 開心散的制備

將4味藥材粉碎，過24目篩得到中藥粗粉。按比例稱取藥材粉末，加入12倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取2 h，濾過，濾渣用10倍量70%乙醇，回流提取1 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，干燥，得開心散提取物。經(jīng)檢測，每克開心散復(fù)方中含β-細(xì)辛醚1194 μg、α-細(xì)辛醚125.0 μg、去氫土莫酸193.2 μg、茯苓新酸A 9.326 μg、茯苓新酸B 10.93 μg、松苓新酸12.23 μg[23]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B對(duì)照品適量，以甲醇溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密吸取上述單一對(duì)照品溶液，以甲醇稀釋，配制為系列混合對(duì)照品溶液，于?20 ℃保存。

精密稱取丁螺環(huán)酮和斯皮諾素對(duì)照品適量，以甲醇溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液，用甲醇-乙腈溶液（1∶1）稀釋，得到內(nèi)標(biāo)溶液（含丁螺環(huán)酮10 ng/mL、斯皮諾素500 ng/mL），于?20 ℃保存。

2.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 安捷倫1290 Inifinity型超高效液相色譜儀，配有G4220A泵、G1316C柱溫箱、G4226A進(jìn)樣器、G1330B恒溫器。色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的甲醇溶液（B），梯度洗脫：0～1.0 min，35% B；1.0～3.0 min，35%～70% B；3.0～5.5 min，70%～73% B；5.5～5.6 min，73%～90% B；5.6～7.0 min，90% B；7.0～7.1 min，90%～100% B；7.1～9.0 min，100% B；9.0～9.1 min，100%～35% B；9.1～10.0 min，35% B。柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2.0 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 AB SCIEX API 4000?三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，離子源為電噴霧離子源（ESI），采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，在正負(fù)離子模式下同時(shí)檢測，質(zhì)譜參數(shù)如下：不同離子模式下氣簾氣137.90 kPa；毛細(xì)管溫度500 ℃；入口電壓±10 V；離子噴霧電壓±4500 V；霧化器氣體344.75 kPa，加熱器氣體344.75 kPa；碰撞池出口電壓正離子模式82.74 kPa，負(fù)離子模式?13.0 V。開心散待測成分與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4 血漿樣品的處理

取血漿樣品，在室溫下解凍，渦旋30 s，精密吸取血漿樣品50 μL，加入10 μL甲醇溶液、150 μL含2種內(nèi)標(biāo)的甲醇-乙腈溶液（1∶1），渦旋30 s。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液定量轉(zhuǎn)移至離心管，氮?dú)饬飨抡舾?。殘?jiān)?0 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻30 s，超聲處理5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

表1 開心散待測成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

Table 1 Mass spectrum conditions of analytes of Kaixin Powder and internal standard

化合物ESI模式母離子(m/z)子離子(m/z)去簇電壓/V碰撞能量/eV α-細(xì)辛醚＋209.2194.18021.0 β-細(xì)辛醚＋209.1194.18021.0 鹽酸丁螺環(huán)酮＋386.0122.014537.2 去氫土莫酸?483.5483.5?220?45.8 松苓新酸?453.3453.3?220?46.7 茯苓新酸A?497.5423.2?190?40.8 茯苓新酸B?483.4465.1?200?33.5 斯皮諾素?607.3427.3?200?41.3

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)《中國藥典》2020年版四部中的生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則對(duì)本研究建立的定量分析方法進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證。

2.5.1 選擇性 比較空白血漿、空白血漿中加入定量下限（low limits of quantification，LLOQ）對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液以及大鼠開心散30 min后的血漿樣品的MRM質(zhì)譜圖，考察方法的選擇性。

2.5.2 線性及LLOQ 分別取大鼠空白血漿50 μL，加入10 μL系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按樣品測定方法處理測定?；旌蠈?duì)照品溶液配制如下：分別定量吸取α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B母液，加入定量甲醇，配制成混合對(duì)照品溶液，吸取一定量的混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成系列混合對(duì)照品溶液。α-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度均為500、200、100、50.0、25.0、10.0、5.00、2.00 ng/mL；β-細(xì)辛醚的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為1000、500、200、100、50.0、25.0、10.0、5.00、2.00、1.00 ng/mL；松苓新酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為1000、500、200、100、50.0、25.0、10.0 ng/mL。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（），用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，建立待測成分對(duì)照品在大鼠空白血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測成分LLOQ。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 取一個(gè)分析批的LLOQ及低、中、高3種質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品（每個(gè)濃度6份樣品），并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定，計(jì)算各成分的日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；連續(xù)測定3個(gè)分析批（3 d內(nèi)），計(jì)算各成分的日間精密度和準(zhǔn)確度。

2.5.4 穩(wěn)定性 制備低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，進(jìn)行室溫放置24 h，?80 ℃保存7 d，?80 ℃反復(fù)凍融3次實(shí)驗(yàn)，測定（各實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度6份樣品）。

2.5.5 提取回收率 制備低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6份樣品，進(jìn)樣分析。取空白血漿，除不加混合對(duì)照品溶液之外按樣品處理，氮吹后加入混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。將質(zhì)控樣品峰面積和氮吹后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品的峰面積相比，計(jì)算各成分的提取回收率。

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿，除不加混合對(duì)照品溶液之外按樣品處理，氮吹后再加入混合對(duì)照品溶液，制備含有基質(zhì)的低、中、高質(zhì)量濃度樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度6份樣品。制備不含基質(zhì)的樣品（待測成分和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海總€(gè)質(zhì)量濃度6份樣品。進(jìn)樣分析考察基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 AD模型大鼠的建立

2.6.1 寡聚態(tài)Aβ1-42的制備 取Aβ1-42粉末1 mg，加入二甲基亞砜和無菌生理鹽水，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/μL的Aβ1-42溶液（含5%二甲基亞砜）。37 ℃孵育3 d，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 造模 雄性SD大鼠采用雙側(cè)海馬CA1區(qū)立體定位注射寡聚態(tài)Aβ1-42造模[25-28]。大鼠麻醉去毛備皮后固定在腦立體定位儀上，消毒，切開顱骨外皮膚，去除骨膜。以前囟為原點(diǎn)，在前囟后?3.3 mm、左右±2.2 mm、背腹側(cè)?2.8 mm處，使用微量注射器各注射5 μL Aβ1-42（1 μg/μL），注射速度為1 μL/min，注射結(jié)束后留針5 min。退針后縫合傷口，傷口處用碘伏消毒，并給予青霉素粉末抗菌。

2.6.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 手術(shù)1周后，采用Morris水迷宮測試評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力。第1天起將平臺(tái)置于某一象限，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄逃逸潛伏期，共實(shí)驗(yàn)5 d，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄動(dòng)物在120 s內(nèi)的穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間比以及目標(biāo)象限距離比。造模成功大鼠用于藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究

取上述經(jīng)驗(yàn)證造模成功的AD模型大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。大鼠ig開心散（10 g/kg），分別于給藥前和給藥后5、10、15、30 min及1、2、4、6、8、12、24 h時(shí)間點(diǎn)，取靜脈血200 μL至含有肝素鈉的離心管中，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血漿，于?80 ℃保存。

2.8 數(shù)據(jù)處理

在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用雙因素重復(fù)測量方差分析。空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)以表示。

使用DAS 2.0軟件以非房室模型計(jì)算成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。使用GraphPad Prism v6.0軟件繪制血藥濃度-時(shí)間曲線。數(shù)據(jù)以表示。

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮評(píng)價(jià)AD模型大鼠

如圖2所示，在定位航行實(shí)驗(yàn)的第1、2、3天，AD模型大鼠的逃逸潛伏期較正常大鼠更長（＜0.05），說明AD模型大鼠找到水下隱藏平臺(tái)需要更長的時(shí)間；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，AD模型大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間比和目標(biāo)象限距離比均明顯低于正常大鼠（＜0.05）。綜上，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AD模型大鼠模型建立成功。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 選擇性 如圖3所示，各化合物峰形良好，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)、可能的代謝產(chǎn)物等對(duì)待測成分和內(nèi)標(biāo)的測定無干擾。

與正常組比較：*P＜0.05

1-β-細(xì)辛醚 2-α-細(xì)辛醚 3-去氫土莫酸 4-茯苓新酸B 5-茯苓新酸A 6-松苓新酸 7-丁螺環(huán)酮 8-斯皮諾素

3.2.2 線性和LLOQ 采用UPLC-MS/MS法測定AD模型大鼠血漿中開心散待測成分的LLOQ及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，如表2所示，各成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯示出良好的線性。

3.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 如表3所示，各成分的日內(nèi)精密度和日間精密度均在±15%以內(nèi)，日內(nèi)準(zhǔn)確度和日間準(zhǔn)確度均在±15%以內(nèi)，符合要求。

3.2.4 穩(wěn)定性 穩(wěn)定性考察結(jié)果見表4。室溫放置24 h，?80 ℃保存7 d，?80 ℃反復(fù)凍融3次實(shí)驗(yàn)樣品測定結(jié)果符合要求。

3.2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表5，各成分提取回收率為86.36%～97.47%，RSD值為1.45%～6.60%，基質(zhì)效應(yīng)為80.50%～100.23%，RSD值為0.95%～6.88%，均符合要求。

3.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用建立的UPLC-MS/MS方法，檢測AD模型大鼠給藥開心散后待測成分在不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，繪制得到平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖4。采用DAS 2.0軟件，以非房室模型計(jì)算AD模型大鼠給藥開心散后待測成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，α-細(xì)辛醚的達(dá)峰時(shí)間（max）值與半衰期（1/2）值分別為（0.26±0.12）、（0.54±0.25）h，β-細(xì)辛醚的max值與1/2值分別為（0.21±0.05）、（0.65±0.24）h，兩者的達(dá)峰時(shí)間與半衰期均較短。去氫土莫酸的max值與1/2值分別為（3.92±4.11）、（3.57±1.04）h，松苓新酸的max值與1/2值分別為（1.25±0.61）、（5.43±2.25）h，兩者的達(dá)峰時(shí)間與半衰期均較長。茯苓新酸A和茯苓新酸B的max值分別為（0.28±0.11）、（0.24±0.03）h，兩者的1/2值分別為（3.90±1.67）、（7.99±2.88）h，成分達(dá)峰時(shí)間較短但半衰期較長。

表2 開心散待測成分的線性回歸方程及LLOQ

Table 2 Calibration curves and LLOQ of analytes of Kaixin Powder

化合物線性方程r線性范圍/(ng·mL?1)LLOQ/(ng·mL?1) α-細(xì)辛醚y＝8.383×10?4 x＋5.130×10?40.998 32.0～500.02.0 β-細(xì)辛醚y＝5.768×10?4 x－2.469×10?20.995 91.0～1 000.01.0 去氫土莫酸y＝1.925×10?4 x＋2.563×10?40.995 72.0～500.02.0 松苓新酸y＝1.250×10?5 x＋4.300×10?40.999 610.0～500.010.0 茯苓新酸Ay＝9.476×10?5 x－1.191×10?40.997 12.0～500.02.0 茯苓新酸By＝1.250×10?5 x＋1.410×10?40.996 82.0～500.02.0

表3 開心散待測成分的精密度和準(zhǔn)確度(, n = 6)

Table 3 Accuracy and precision of analytes of Kaixin Powder (, n = 6)

化合物質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)日內(nèi)日間 實(shí)測值/(ng·mL?1)準(zhǔn)確度/%精密度/%實(shí)測值/(ng·mL?1)準(zhǔn)確度/%精密度/% α-細(xì)辛醚2.02.11±0.08105.583.852.06±0.02103.091.17 5.05.06±0.12101.302.445.13±0.04102.580.72 50.052.10±2.60104.204.9952.25±1.96104.503.75 400.0400.92±12.03100.233.00411.56±18.68102.894.54 β-細(xì)辛醚1.01.00±0.07100.177.271.01±0.02101.392.23 2.01.94±0.1496.927.121.99±0.0699.923.18 50.051.13±1.14102.262.2250.96±0.64101.911.25 800.0775.60±26.1496.953.37771.92±28.0296.493.63 去氫土莫酸2.02.07±0.10103.334.952.04±0.03101.751.60 5.05.03±0.08100.631.505.03±0.03100.580.55 50.051.32±1.62102.633.1653.71±2.73107.425.08 400.0389.56±6.5897.391.69389.68±12.4797.423.20 松苓新酸10.010.46±0.61104.625.8410.44±0.42104.394.02 20.020.47±0.73102.343.5720.44±0.08102.210.39 100.0103.95±1.37103.951.32104.21±1.32104.211.27 400.0407.16±7.25101.791.78398.52±7.6999.631.93 茯苓新酸A2.02.06±0.08103.254.072.09±0.04104.531.72 5.05.26±0.27105.105.135.16±0.19103.273.68 50.051.42±1.90102.843.7054.22±2.67108.444.93 400.0414.00±11.84103.502.86395.92±21.5898.985.45 茯苓新酸B2.02.04±0.12101.836.042.22±0.21111.199.27 5.05.06±0.16101.203.225.14±0.10102.721.98 50.051.67±1.66103.343.2253.60±1.70107.203.18 400.0396.72±10.9099.182.77385.00±16.7996.254.36

表4 開心散待測成分的穩(wěn)定性(, n = 6)

Table 4 Stability of analytes of Kaixin Powder (, n = 6)

化合物質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)室溫放置24 h?80 ℃凍存7 d反復(fù)凍融3次 實(shí)測值/(ng·mL?1)準(zhǔn)確度/%精密度/%實(shí)測值/(ng·mL?1)準(zhǔn)確度/%精密度/%實(shí)測值/(ng·mL?1)準(zhǔn)確度/%精密度/% α-細(xì)辛醚5.05.16±0.01103.200.195.04±0.05100.870.985.10±0.16101.933.05 50.051.92±0.89103.831.7150.44±2.07100.874.1049.48±2.2798.964.58 400.0396.56±10.1999.142.57395.56±16.2298.894.10370.96±2.5692.740.69 β-細(xì)辛醚2.01.97±0.2198.3310.472.02±0.08101.174.142.02±0.10100.834.89 50.051.22±1.15102.432.2451.15±1.87102.313.6651.80±1.32103.612.55 800.0787.84±11.2798.481.43749.68±18.1493.712.42860.80±29.18107.603.39 去氫土莫酸5.05.06±0.04101.270.755.04±0.05100.871.025.01±0.13100.132.53 50.052.94±0.98105.871.8552.00±1.59104.013.0551.46±1.38102.932.68 400.0405.76±4.75101.441.17382.00±9.3695.502.45402.04±12.10100.513.01 松苓新酸20.020.81±0.35104.051.6920.18±0.14100.900.6719.76±0.1298.780.59 100.0105.66±2.74105.662.59105.30±3.34105.303.1799.79±2.9499.792.95 400.0393.88±3.2798.470.83395.88±7.3298.971.85394.48±7.3498.621.86 茯苓新酸A5.05.12±0.13102.472.525.44±0.15108.802.715.31±0.34106.136.44 50.050.10±2.24100.204.9452.74±1.92105.493.6451.14±3.97102.287.77 400.0401.48±13.53100.373.37383.00±13.7195.753.58402.04±12.10100.513.01 茯苓新酸B5.05.03±0.15100.602.945.15±0.05103.000.895.31±0.05106.201.00 50.053.02±1.74106.033.2949.22±0.3698.450.7351.36±3.10102.736.03 400.0389.68±10.1797.422.61381.32±8.7795.332.30 388.23±6.1397.071.58

表5 開心散待測成分的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)(, n = 6)

Table 5 Recovery and matrix effect of analytes of Kaixin Powder (, n = 6)

化合物質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)提取回收率/%基質(zhì)效應(yīng)/% α-細(xì)辛醚5.095.07±3.0893.39±6.35 50.088.12±2.5984.37±2.88 400.086.72±3.1080.50±1.27 β-細(xì)辛醚2.090.81±2.1498.01±6.88 50.090.86±1.5887.54±1.91 800.089.46±2.3584.87±2.11 去氫土莫酸5.097.47±6.60100.28±1.24 50.094.31±3.3996.95±2.57 400.096.83±1.6499.69±2.51 松苓新酸20.087.50±2.5690.41±2.48 100.090.85±1.4580.88±1.27 400.097.08±2.5692.69±0.95 茯苓新酸A5.086.50±3.1491.54±4.17 50.090.71±4.0791.19±4.47 400.095.95±5.6296.65±2.20 茯苓新酸B5.086.36±2.1192.16±6.08 50.092.85±4.6493.93±5.58 400.096.29±4.7498.00±3.99

4 討論

4.1 目標(biāo)成分選擇

基于復(fù)方配伍藥味相關(guān)文獻(xiàn)參考分析[29-30]，本研究在初期選擇開心散中人參皂苷類成分（人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re）、遠(yuǎn)志𠮿酮類成分（遠(yuǎn)志𠮿酮III）、寡糖酯類成分（3,6′-二芥子?；崽牵?、細(xì)辛醚類成分（α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚）、茯苓三萜酸類成分（去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B）作為藥動(dòng)學(xué)檢測的目標(biāo)成分，但由于開心散中人參和遠(yuǎn)志的配伍比例比較低，導(dǎo)致人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、3,6′-二芥子?；崽呛瓦h(yuǎn)志𠮿酮III等在復(fù)方中的含量較低，因此在血漿樣品中其含量低于LLOQ，未能被準(zhǔn)確定量。本研究最終以α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B為檢測成分進(jìn)行開心散的藥動(dòng)學(xué)表征。

圖4 AD模型大鼠ig開心散后待測成分的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(, n = 6)

表6 AD模型大鼠ig開心散后待測成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 6)

Table 6 Pharmacokinetic parameters of analytes in AD rats after ig Kaixin Powder (, n = 6)

參數(shù)單位α-細(xì)辛醚β-細(xì)辛醚去氫土莫酸松苓新酸茯苓新酸A茯苓新酸B tmaxh0.26±0.120.21±0.053.92±4.411.25±0.610.28±0.110.24±0.03 Cmaxng·mL?135.88±5.81269.00±45.30120.38±53.68114.88±37.1991.56±36.28117.30±54.65 AUC0～tng·mL?1·h38.52±13.01329.20±106.131 373.54±530.78640.55±187.42193.15±59.51398.54±137.70 AUC0～∞ng·mL?1·h39.92±13.19354.17±111.261 381.30±530.43795.20±208.57213.27±49.45498.05±210.28 t1/2h0.54±0.250.65±0.243.57±1.045.43±2.253.90±1.677.99±2.88 MRT0～th0.91±0.580.77±0.308.53±1.014.49±0.783.19±0.865.18±0.49 MRT0～∞h0.99±0.570.97±0.378.67±1.047.88±2.494.14±1.0110.92±6.04 CLz/FL·h?1·kg?132.63±18.7038.87±20.721.55±0.490.16±0.050.46±0.130.25±0.11 Vz/FL·kg?121.73±7.0535.00±15.918.43±4.651.35±0.913.26±2.212.21±1.63

4.2 檢測條件優(yōu)化與樣品處理優(yōu)化

通過比較正負(fù)離子模式下各成分的響應(yīng)，本研究選擇了響應(yīng)更高的離子模式進(jìn)行檢測：α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚在正離子模式下檢測；去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B在負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測。不同檢測離子模式下需要選用不同的內(nèi)標(biāo)成分，本研究選擇鹽酸丁螺環(huán)酮作為正離子模式下的內(nèi)標(biāo)成分，選擇斯皮諾素作為負(fù)離子模式下的內(nèi)標(biāo)成分。

通過對(duì)比使用水-甲醇、水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)各成分的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)各成分在甲醇作為有機(jī)相時(shí)響應(yīng)更高；在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸水溶液后成分峰形有所優(yōu)化，最終選定以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液為流動(dòng)相。

處理血漿樣品處理時(shí)，為保證蛋白沉淀完全，本研究選擇50 μL血漿中加入150 μL甲醇-乙腈混合溶液（1∶1）進(jìn)行樣品處理。此外，由于血漿樣品中成分含量較低，本研究取沉淀蛋白所得上清液定量，氮吹濃縮，殘?jiān)?0 μL甲醇復(fù)溶，離心取上清液進(jìn)樣測定。

4.3 AD大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

AD是一種以β淀粉樣蛋白沉積形成的“老年斑”與Tau蛋白磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前相關(guān)假說多樣包括有Aβ沉積學(xué)說、膽堿能學(xué)說、Tau蛋白假說、氧化應(yīng)激學(xué)說、神經(jīng)血管學(xué)說等[31-33]，其中Aβ沉積學(xué)說占據(jù)主要地位。本課題組前期研究表明，開心散可在一定程度上改善AD模型動(dòng)物（/轉(zhuǎn)基因小鼠）的Aβ沉積，因此，本研究選擇基于Aβ沉積相關(guān)的AD大鼠模型進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。目前研究表明，采用Aβ1-42腦內(nèi)定位注射方法建立的AD大鼠模型穩(wěn)定，可重復(fù)且操作簡便[23,33]。因此，本研究選用該方法進(jìn)行AD大鼠模型建立，并采用AD動(dòng)物模型的經(jīng)典評(píng)價(jià)指標(biāo)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[31-32]進(jìn)行AD大鼠模型的評(píng)價(jià)。

4.4 開心散各成分的藥動(dòng)學(xué)特征分析

α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚互為同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因而兩者體內(nèi)過程相似，多個(gè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)值相近，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)表明ig開心散后α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚均迅速吸收進(jìn)入體內(nèi)并且消除較快，成分的體內(nèi)變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道相近[34-35]。在本研究中，兩者在達(dá)峰濃度（max）和曲線下面積（AUC）值的差異較大，推測其主要原因?yàn)閺?fù)方中成分含量差異較大。文獻(xiàn)報(bào)道[34]大鼠ig石菖蒲揮發(fā)油提取物后α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的max分別為（1.42±0.18）、（1.58±0.18）h，而本研究中大鼠ig開心散后α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的max分別為（0.26±0.12）、（0.21±0.05）h，這提示開心散配伍可能促進(jìn)α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚吸收。

去氫土莫酸與松苓新酸均為羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜，其藥動(dòng)學(xué)過程存在相似性，即呈現(xiàn)消除緩慢的現(xiàn)象。Zhang等[36]進(jìn)行了茯苓醇提物的成分藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果顯示去氫土莫酸為單峰吸收，而本研究中去氫土莫酸體內(nèi)過程呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這與Xiao等[37]研究中顯示去氫土莫酸在茯苓提取物給藥后單峰吸收、制劑給藥后呈現(xiàn)雙峰吸收結(jié)果相近，推測這一結(jié)果可能是由于肝腸循環(huán)[38]。本研究中松苓新酸的體內(nèi)過程呈現(xiàn)單峰吸收、消除緩慢的現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道[36,38]相近。另外，開心散中去氫土莫酸的含量是松苓新酸的15.8倍，但是去氫土莫酸和松苓新酸的max值接近，這一結(jié)果提示松苓新酸可能為更易被吸收的成分，值得關(guān)注。

茯苓新酸A和茯苓新酸B均為3,4-開環(huán)-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜，ig開心散后，2成分均被迅速吸收入血并且消除較慢，與文獻(xiàn)報(bào)道[36,38]相近。復(fù)方中，這2種成分的含量相近，但茯苓新酸B的max值、AUC值、平均滯留時(shí)間（MRT）值等參數(shù)均高于茯苓新酸A，這一結(jié)果提示茯苓新酸B可能更易被吸收入血，從而在體內(nèi)發(fā)揮作用。另外，本研究結(jié)果顯示給藥開心散后松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B的達(dá)峰時(shí)間均低于文獻(xiàn)報(bào)道[36]中給予茯苓醇提物后各成分達(dá)峰時(shí)間，這提示開心散復(fù)方可能促進(jìn)茯苓三萜酸類成分吸收。

綜上所述，本研究建立了同時(shí)測定大鼠血漿中開心散主要成分含量的UPLC-MS/MS方法，并將該方法成功地應(yīng)用于開心散在AD模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。本研究明確了AD疾病狀態(tài)下開心散中α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B這6種成分的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征，為明確開心散的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考，并為開心散的臨床應(yīng)用以及后續(xù)研究提供借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacokinetic study of Kaixin Powder in rats with Alzheimer’s disease

FENG Xiao-xiao, WANG Bin-bin, CHEN Dong, QIU Feng, GONG Mu-xin, LI Zhao-xia

Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To characterize the pharmacokinetic behavior of the analytes of Kaixin Powder (開心散) in Alzheimer’s disease (AD) rats induced by oligomeric β amyloid protein 1-42 (Aβ1-42), and establish and verify an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method for simultaneous determination of components of Kaixin Powder in rat plasma.Rats model of AD was established by bilateral hippocampal injection of oligomeric Aβ1-42. Kaixin Powder was administered by single ig, blood was collected at different time points, and plasma concentrations of ingredients were determined. DAS 2.0 software was used to fit non-compartmental models to calculate pharmacokinetic parameters.The established UPLC-MS/MS method in terms of precision, accuracy, extraction recovery, matrix effect and stability and other methodological investigation results all met the determination requirements of biological sample analysis. The results of Morris water maze test confirmed that AD rats model was successfully constructed (< 0.05). After administration of Kaixin Powder, pharmacokinetic parameters of analytes with similar structure were similar, such as α-asarone and β-asarone belonging to isomers, dehydrotumulosic acid and dehydrotrametenolic acid belonging to lanosta-7,9(11)-diene type triterpenes, poricoic acid A and poricoic acid B belonging to 3,4-seco-lanostan-7,9(11)- diene type triterpenes.maxand1/2of α-asarone and β-asarone were short which showed a rapid absorption and elimination.maxof poricoic acid A and poricoic acid B were short but1/2of them were long, suggesting a rapid absorption and slow elimination;maxand1/2of dehydrotumulosic acid and dehydrotrametenolic acid were long, so the absorption and elimination rates of these compounds were slow. Moreover, dehydrotumulosic acid played a double-peak phenomenon and MRT of it was long. This might be caused by the enterohepatic circulation, and time of dehydrotumulosic acidcould be prolonged.Thepharmacokinetic process of the analytes of Kaixin Powder in AD rats is revealed, which can provide reference for clarifying theprocess of Kaixin Powder and its subsequent research and development.

Kaixin Powder; Alzheimer’s disease; pharmacokinetics; UPLC-MS/MS; oligomeric Aβ1-42; α-asarone; β-asarone; poricoic acid A; poricoic acid B; dehydrotumulosic acid; dehydrotrametenolic acid

R285.61

A

0253 - 2670(2022)14 - 4388 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.018

2022-03-07

北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（7182019）；北京市青年拔尖人才培育計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD201504098）

馮曉曉，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庴w內(nèi)過程和作用機(jī)制研究。E-mail: ccmufxx@163.com

李朝霞，副教授，研究方向?yàn)橹兴庴w內(nèi)過程和作用機(jī)制研究。E-mail: gmacli@ccmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]