circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞線粒體功能和炎癥因子水平的調(diào)節(jié)作用①

李 毅 李文忠 師 路 高志勇 王聆宇

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬成都三六三醫(yī)院胃腸外科，成都 610097）

結(jié)腸癌（colon cancer，CC）是人類最常見、最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其病死率在惡性腫瘤中排名第二［1］。由于其發(fā)展速度快及高度轉(zhuǎn)移性，治療策略受到限制［2］。因此，急需發(fā)現(xiàn)用于早期檢測(cè)、術(shù)后監(jiān)測(cè)和管理的新型生物標(biāo)志物。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是一類新型的非編碼RNA，具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)且缺乏編碼潛力［3］。隨著高通量測(cè)序方法的發(fā)展，circRNAs 在各種動(dòng)物組織和細(xì)胞樣品中表現(xiàn)出高豐度和高組織特異性表達(dá)［4］。重要的是，已有研究證明circRNA 失調(diào)與多種人類疾?。ㄈ缟窠?jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥）有關(guān)［5-6］。據(jù)報(bào)道，circRNA_103809 可促進(jìn)肺癌發(fā)展［7］。circRNA_103809 參與調(diào)控與肝癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生［8-9］。在既往研究中，ZHANG 等［10］發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_103809在結(jié)直腸癌中下調(diào)，且與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。然而hsa_circRNA_103809 在結(jié)直腸癌中的功能和機(jī)制尚未在體內(nèi)或體外深入研究。本文主要探究hsa_circRNA_103809 在結(jié)腸癌中的表達(dá)及circRNA_103809對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑和4%多聚甲醛溶液（美國(guó)Invitrogen）；10%胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美國(guó)Sigma）；CCK8試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL 發(fā)光液和DAPI 染色液（上海碧云天）；Lipo?fectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher）；SybGreenⅠ（上海捷瑞生物）；Annexin-V-PI（美國(guó)BD Pharmingen）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore）；兔抗胱天蛋白酶（caspase，cas）-3 抗體多克隆抗體（ab13847）、兔抗caspase-9 單克隆抗體（ab185719）、兔抗Bcl-2單克隆抗體兔抗（ab32124）、兔抗Bax 單克隆抗體兔抗（ab32503）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ab205718）、HRP-兔抗小鼠IgG（ab6728）、山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?488，ab150077）（英國(guó)Abcam）；小鼠抗Lamin A 單克隆抗體（#86846）、p65 單克隆抗體（#8242）（美國(guó)CST）；BD MitoScreen（JC1）試劑盒（美國(guó)BD Biosci?ences）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（美國(guó)Sigma-Aldrich）；IL-1β、IL-6和IL-4 ELISA試劑盒（美國(guó)R&D Systems 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）；SmartSpec Plus 分光光度計(jì)Accuri C6 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences）；ABI PRISM7500PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康）；LV-circRNA_103809、LV-scramble（中國(guó)廣州銳博生物）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC 及結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW620、SW480和HT29均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2的潮濕空氣中，在添加有10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 結(jié)腸癌患者樣品檢測(cè) 臨床獲取25例結(jié)腸癌組織樣本和癌旁組織樣本，qRT-PCR 檢測(cè)circ-RNA_103809的表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將SW480 細(xì)胞分為對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染），circRNA_103809 過表達(dá)組（LV-circ-RNA_103809組）及其陰性對(duì)照組（LV-scramble組）。SW480細(xì)胞（1×106個(gè)/孔）接種于6個(gè)孔板，培養(yǎng)24 h后，使用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑分別對(duì)應(yīng)分組將100 nmol/L LV-circRNA_103809和LV-scramble轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.4 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將SW480 細(xì)胞按1.2.3 分組轉(zhuǎn)染24 h，10 μl CCK8 溶液添加到平板的每個(gè)孔中。37 ℃下孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處吸光度，孵育4 d，通過測(cè)量450 nm 處的吸光度評(píng)估活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè)circRNA_103809、Ki67 和p21mRNA 的表達(dá) 根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol試劑從結(jié)腸癌組織、癌旁組織和結(jié)腸癌細(xì)胞中提取總RNA。SmartSpec Plus 分光光度計(jì)中測(cè)量RNA 濃度和純度。A260/A280在1.8～2.0 之間表示RNA 純度高，用于進(jìn)一步檢測(cè)。按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR 試劑試劑盒的說明書分別將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并制備qPCR 體系。使用ABI PRISM7500 系統(tǒng)定量，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，65 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：circRNA_103809 正向引物為5'-ACGCATTCTTC?GAGACCTCT-3'，反向引物為5'-TGCCTGTAACTCCTCTTCAGT-3'；GAPDH 正向引物為5'-GAAGGT?GAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物為5'-GAAGATG?GTGATGGGATTTC-3'；Ki67 正向引物為5'-ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG-3'，反向引物為5'-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3'；p21 正向引物為5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'，反向引物為5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'。將GAPDH 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化circRNA 和mRNA 相對(duì)表達(dá)，應(yīng)用2-ΔΔCt計(jì)算。每個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)分析3次。

1.2.6 Annexin-V-FITC/PI 染色 收集按1.2.3 步驟轉(zhuǎn)染的48 h 的各組SW480 細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，4 ℃、1 000 g 離心5 min，棄上清液，將細(xì)胞重懸于膜聯(lián)蛋白結(jié)合溶液，10μl膜聯(lián)蛋白V 懸浮。室溫下避光添加異硫氰酸熒光素（FITC）和碘化丙啶（PI）溶液。15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡分析 收獲SW480 細(xì)胞并用細(xì)胞裂解緩沖液裂解以進(jìn)行免疫印跡。蛋白質(zhì)（每泳道30 μg）以10%SDS-PAGE 凝膠分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。含5%牛奶Tween20（TBST）的Tris 緩沖鹽水室溫封閉膜1 h，與一抗β-actin（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、caspase3（1∶500）、caspase9（1∶1 000）、p65（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌3次后，將膜與抗兔、抗鼠IgG-HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶4 000）37 ℃孵育1 h。TBST 洗滌3 次后，使用ECL 發(fā)光液檢測(cè)免疫反應(yīng)帶。

1.2.8 線粒體膜電位的測(cè)量 根據(jù)制造商的說明，使用BD MitoScreen 試劑盒評(píng)估ΔΨm 的變化。將SW480 細(xì)胞按照1.2.3 分組轉(zhuǎn)染48 h 后，收獲細(xì)胞并用PBS 洗滌2 次。然后將細(xì)胞懸浮在500 μl JC-1 工作溶液中，并在37 ℃孵育30 min。通過流式細(xì)胞儀記錄總共1×104個(gè)細(xì)胞，采用BD CFlow 軟件分析。

1.2.9 SOD 和MDA 測(cè)定 SW480 細(xì)胞按照1.2.3分組轉(zhuǎn)染48 h 后，離心獲取細(xì)胞并裂解，收集上清液，并通過BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將裂解液（35 μg）用于測(cè)定SOD 和MDA活性。

1.2.10 ELISA 檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-4收集各組轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞，離心10 min。收集上清液，使用ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.11 免疫熒光染色檢測(cè)NF-κBp65 的核定位將各組轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞用溶于0.1%Triton100-PBS的4%多聚甲醛溶液固定20 min，5%BSA-PBS 封閉1 h。細(xì)胞與抗NF-κBp65 抗體在2%BSA-PBS 中于4 ℃孵育過夜。Alex Fluor 488 山羊抗兔IgG 的2%BSA-PBS 溶液作為二抗，避光孵育1 h。DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色1 min，熒光顯微鏡拍攝圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均表示為至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的±s，使用SPSS19.0 軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響 如圖1 所示，與人正常結(jié)腸組織及上皮細(xì)胞相比，結(jié)腸癌組織及各結(jié)腸癌細(xì)胞中circRNA_103809的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），選擇表達(dá)相對(duì)低的SW480 繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，LV-circRNA_103809 組SW480 細(xì)胞中circRNA_103809 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05），Ki67表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），p21 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），LV-scramble組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 circRNA_103809抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖Fig.1 circRNA_103809 inhibits proliferation of colon can?cer SW480 cells

2.2 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞凋亡的影響 如圖2 所示，與對(duì)照組相比，LV-circRNA_103809 組SW480 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），LV-scramble 組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 circRNA_103809誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡Fig.2 circRNA_103809 induces apoptosis of colon cancer SW480 cells

2.3 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體功能的影響 如圖3所示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)circRNA_103809降低SW480細(xì)胞線粒體膜電位，并顯著上調(diào)Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3（P<0.05）。LV-scramble組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞線粒體功能的影響Fig.3 Effect of circRNA_103809 on mitochondrial func?tion of colon cancer SW480 cells

2.4 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 如圖4 所示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)circRNA_103809減少SW480細(xì)胞中SOD含量（P<0.05），增加MDA 含量（P<0.05），LV-scramble 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 circRNA_103809對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.4 Effect of circRNA_103809 on oxidative stress of colon cancer SW480 cells

2.5 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 如圖5 所示，與對(duì)照組相比，LV-circ-RNA_103809 組SW480 細(xì)胞上清液中IL-1β 和IL-6水平顯著降低（P<0.05），IL-4 水平顯著升高（P<0.05），SW480 細(xì)胞核中p65 表達(dá)顯著下調(diào)，免疫熒光結(jié)果顯示過表達(dá)circRNA_103809 減少p65 的細(xì)胞核定位。LV-scramble 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖5 circRNA_103809 對(duì)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of circRNA_103809 on inflammatory response of colon cancer SW480 cells

3 討論

結(jié)腸癌是一種惡性腫瘤，發(fā)病率高，一般認(rèn)為與環(huán)境因素、遺傳因素有關(guān)［11］。結(jié)腸癌常規(guī)治療包括手術(shù)，輔助治療和分子靶向治療，但預(yù)后不理想［12-13］。因此有必要進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及其潛在分子機(jī)制，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)，以改善患者預(yù)后并減輕患者痛苦。越來越多的研究表明，circRNA 在生命過程中許多方面都發(fā)揮至關(guān)重要的作用，例如分化、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。例如circRNA-CDR1as（與小腦變性相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄物反義）可通過影響miR-7 表達(dá)參與多種癌癥生物學(xué)功能［14］。BIAN 等［8］研究表明Hsa_circRNA_103809 在大腸癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，并通過miR-532e3p/FOXO4軸調(diào)控大腸癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果與之一致，結(jié)果顯示circRNA_103809 在結(jié)腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)較正常組織和細(xì)胞顯著降低。進(jìn)一步過表達(dá)circRNA_103809，則SW480細(xì)胞活力顯著下降，Ki67 表達(dá)顯著下調(diào)，p21 表達(dá)顯著上調(diào)。因此，過表達(dá)circRNA_103809 能抑制SW480細(xì)胞增殖。

凋亡是消除癌細(xì)胞的主要機(jī)制，可以用作癌癥藥物開發(fā)研究的重要靶標(biāo)［15］。本研究表明過表達(dá)circRNA_103809 可誘導(dǎo)SW480 凋亡，線粒體膜電位降低，促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 比值顯著升高。線粒體跨膜電位降低是細(xì)胞凋亡早期的不可逆事件［16］?？沟蛲龅鞍譈cl-2 和促凋亡蛋白Bax 同屬于Bcl-2 家族，是細(xì)胞凋亡內(nèi)源性線粒體途徑的重要調(diào)節(jié)因子［17］。線粒體膜通透性增加，線粒體釋放細(xì)胞色素到細(xì)胞質(zhì)中，會(huì)激活cas-9，進(jìn)而導(dǎo)致cas-3 的裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］。

腫瘤治療過程中常以抗氧化酶為作用靶點(diǎn)，通過降低抗氧化劑（如SOD）水平導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡而具有抗癌作用［19］。MDA 水平作為脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，通常用作細(xì)胞和組織中氧化損傷的標(biāo)志［20］。本研究表明過表達(dá)circRNA_103809 降低SW480 細(xì)胞中SOD 水平，升高M(jìn)DA 水平，通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

炎癥在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其不僅具有腫瘤促進(jìn)劑的作用，還能通過誘導(dǎo)血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移而影響腫瘤發(fā)生的進(jìn)程［21-22］。本研究結(jié)果表明過表達(dá)circRNA_103809 可顯著下調(diào)促炎因子IL-1β 和IL-6 表達(dá)，上調(diào)抗炎因子IL-4 表達(dá)，顯著下調(diào)NF-κB p65 表達(dá)并減少p65 的核定位。NF-κB 對(duì)許多控制各種細(xì)胞反應(yīng)（例如凋亡，應(yīng)激和炎癥）的靶基因發(fā)揮作用。臨床和實(shí)驗(yàn)室研究表明NF-κB途徑參與多種人類疾病，例如心肌病、糖尿病腎病、白內(nèi)障和癌癥［23-26］。NF-κBp65 作為NF-κB 家族重要成員，與各種刺激、應(yīng)激有關(guān)，尤其是氧化應(yīng)激［27］。受刺激時(shí)，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。因此circRNA_103809 通過調(diào)控NF-κBp65 的核定位抑制炎癥反應(yīng)，從而阻止腫瘤發(fā)生進(jìn)程。

綜上所述，circRNA_103809 在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，并通過降低細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)和抑制炎癥發(fā)揮抑癌功能。這些結(jié)果提示circRNA_103809可能是一種新型治療靶標(biāo)。