PD-L1阻斷對膿毒癥小鼠T淋巴細胞凋亡及單核細胞功能的影響①

韋金磊 陳建新 張 森 （廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，南寧 530021）

膿毒癥是由細菌感染引起的全身性炎癥應(yīng)激反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），發(fā)病率較高，具體發(fā)生機制尚不明確，是導(dǎo)致ICU 患者死亡的主要原因，也是目前全球危重醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點［1］。研究表明，免疫抑制是膿毒癥晚期最重要的病理變化，膿毒癥患者因免疫系統(tǒng)改變易反復(fù)出現(xiàn)全身性嚴重感染［2］。進一步研究顯示，膿毒癥患者器官淋巴細胞凋亡與膿毒癥后期免疫抑制關(guān)系密切［3］。CAO 等［4］研究表明淋巴細胞數(shù)驟減是免疫功能下降的主要原因。YAO等［5］研究發(fā)現(xiàn)阻斷淋巴細胞凋亡可明顯提高膿毒癥小鼠存活率。最新研究表明，單核細胞功能失常在免疫抑制過程中發(fā)揮重要作用［6］。初始免疫時，單核細胞產(chǎn)生大量炎癥遞質(zhì)抵御感染。膿毒癥免疫抑制過程中，單核細胞對感染細菌的功能失常，加劇免疫抑制程度。臨床研究表明，單核細胞可維持促炎功能，明顯縮短患者住院時間［7］。程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡受體-1配體（programmed death-1 ligand，PD-L1）分別為分化簇（cluster of differentiation，CD）家族中的CD279 和CD274，PD-1/PD-L1 通路可通過調(diào)節(jié)T 淋巴細胞活化及細胞耐受性在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。YAGHOUBI 等［9］研究表明，阻斷PD-1/PD-L1 信號通路可明顯增強患者自身免疫功能，縮短結(jié)腸癌患者術(shù)后康復(fù)時間。臨床研究表明，膿毒癥患者T 淋巴細胞表面PD-1 及單核細胞表面PD-L1 表達升高，但PD-1/PD-L1 在膿毒癥中作用的研究鮮有報道［10］。本研究構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，探討PD-1/PD-L1 對T 淋巴細胞凋亡及單核細胞功能的影響，為臨床研究提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30 只8～10 周齡清潔級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量20～30 g，合格證號：TBHS-56-1A-2019，由廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白酶、麻醉劑（Gibco公司）；抗PD-L1（Santa公司）；ELISA、Western blot試劑盒（德國Rebstock 公司）；IL-6 抗體、TNF-α 抗體、IL-10 抗體（南京建成生物有限公司）；HE 試劑盒、TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；JSM23510LV 型掃描電鏡（加拿大Visual Sonics 公司）；LIOOS600T 熒光顯微鏡（日本尼康公司）；-80 ℃冰箱（德國維根斯公司）；Leica RM2135 組織切片機（德國Leica 公司）；高速低溫離心機（北京六一儀器廠）；流式細胞儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模與分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機分為3 組：sham 組、模型組、PD-L1 拮抗組，每組10只，模型組、PD-L1拮抗組小鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）構(gòu)建膿毒癥小鼠模型：術(shù)前12 h 禁食，10%異氟烷腹腔注射麻醉，仰臥位固定于無菌操作臺，于腹正中行2 cm 縱向切口，牽出盲腸，4號線結(jié)扎盲腸根部，14G套管針貫通穿孔（為確保穿刺孔通暢，在穿孔點輕微用力擠出少許大便），將腸管重新放回腹腔，逐層縫合傷口，皮下注射10 ml生理鹽水防止休克［11］。sham 組小鼠暴露盲腸后即縫合傷口，其他操作同上。PD-L1 拮抗組小鼠術(shù)后腹腔注射抗PD-L1 抗體（50 μg/只），每6 h 注射1 次，連續(xù)4 次，sham 組和模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 流式標記法檢測小鼠T 淋巴細胞表面PD-1和單核細胞表面PD-L1 表達 末次注射給藥4 h 后稱重，取小鼠外周抗凝血標本，流式標記法檢測各組小鼠CD3+T 細胞、單核細胞CD11b+表面PD-1、PD-L1表達；頸椎脫臼法處死小鼠，顯微鏡下準確剝離小鼠脾臟和胸腺，稱重，計算小鼠脾臟和胸腺指數(shù)=脾臟或胸腺重量/體質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HE 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織病理學(xué)改變 取10%各組小鼠脾臟和胸腺組織，HE染色，切片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理學(xué)改變。

1.2.4 電鏡觀察各組小鼠脾臟和胸腺組織超微結(jié)構(gòu)改變 取10%各組小鼠脾臟和胸腺組織，制成0.3 cm×0.5 cm 超薄組織切片，2.5%戊二醛固定8 h，生理鹽水清洗3 次，梯度乙醇脫水，-20 ℃冷凍干燥過夜，掃描電鏡下觀察各組小鼠脾臟和胸腺超微病理結(jié)構(gòu)改變。

1.2.5 TUNEL 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織細胞凋亡 取10%各組小鼠脾臟和胸腺組織，固定，切片，梯度乙醇洗脫，過氧化氫-甲醇浸泡，加入0.1%TritonX-100、0.1% 緩沖液、TUNEL 混合液37 ℃反應(yīng)1 h，梯度乙醇脫水，封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠胸腺組織T 淋巴細胞凋亡 取10%各組小鼠胸腺組織，制成胸腺單細胞懸液，流式細胞儀檢測各組小鼠T 淋巴細胞凋亡情況。

1.2.7 ELISA檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Caspase-3及血清TNF-α、IL-6 和IL-10 水平 采用ELISA 試劑盒檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Caspase-3 表達及血清TNF-α、IL-6、IL-10 含量，Varioskan LUX 多功能酶標儀分別測定OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式標記法檢測PD-1和PD-L1表達 與sham組相比，模型組小鼠CD3+、CD11b+細胞表面PD-1 和PD-L1表達明顯升高（P<0.05），提示構(gòu)建模型成功；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠CD3+、CD11b+細胞表面PD-1和PD-L1表達明顯降低（P<0.05，圖1）。

圖1 流式標記法檢測PD-1和PD-L1表達Fig.1 Flow cytometry method to detect expressions of PD-1 and PD-L1

2.2 各組小鼠臟器指數(shù)比較 與sham 組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯下降（P<0.05），提示模型組小鼠免疫功能受限；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯升高（P<0.05，圖2），提示PD-L1拮抗組小鼠免疫功能有所恢復(fù)。

圖2 各組小鼠臟器指數(shù)Fig.2 Organ index of mice in each group

2.3 HE 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織病理學(xué)改變 sham 組小鼠脾臟表面有光澤，結(jié)構(gòu)完整，紅髓、白髓界限清晰，脾小體形態(tài)和數(shù)量正常，脾小結(jié)性狀正常，淋巴細胞未見明顯分化分裂現(xiàn)象，細胞分布致密；模型組小鼠脾臟腫脹明顯，體積變大，脾臟結(jié)構(gòu)破壞明顯，紅髓、白髓分界不清，紅髓縮小，白髓區(qū)域擴張，濾泡增加，結(jié)締組織增加，脾小體明顯減少，脾小結(jié)不同程度腫脹，淋巴細胞排列稀疏；PD-L1拮抗組小鼠脾臟可見清晰白髓、紅髓及邊緣區(qū)，脾小體數(shù)量有所恢復(fù)，淋巴細胞數(shù)量有所增加，脾臟病理學(xué)變化有所改善（圖3A）。sham 組小鼠胸腺可見小葉內(nèi)梁，分葉清晰，胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，大小和形態(tài)未見異常，細胞密集排列。模型組小鼠胸腺髓質(zhì)和皮質(zhì)分界不清晰，細胞稀疏，胸小葉及胸腺小體結(jié)構(gòu)缺失嚴重；PD-L1拮抗組小鼠雖無法辨別胸小葉分區(qū)，但皮質(zhì)和髓質(zhì)形態(tài)較模型組明顯好轉(zhuǎn)，淋巴細胞數(shù)明顯增多（圖3B）。

圖3 各組小鼠脾臟和胸腺組織病理學(xué)改變（×400）Fig.3 Pathological changes of spleen and thymus tissues of mice in each group（×400）

2.4 電鏡觀察各組小鼠脾臟和胸腺組織超微結(jié)構(gòu)改變 sham 組小鼠脾臟組織脾索與脾竇相間排列，脾索內(nèi)網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)清晰可辨，淋巴細胞、巨噬細胞及紅細胞黏附于網(wǎng)狀支架，菱形或短桿狀內(nèi)皮細胞平行排列構(gòu)成穩(wěn)定的脾竇組織；模型組小鼠脾臟組織脾索與脾竇結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度損傷，部分淋巴細胞從網(wǎng)狀支架上脫落導(dǎo)致局部間質(zhì)網(wǎng)狀支架裸露，出現(xiàn)較多空洞。淋巴細胞排列散亂、稀松，體積明顯變小；PD-L1 拮抗組小鼠脾臟較模型組明顯改善，淋巴細胞數(shù)明顯增多，脾臟內(nèi)空洞基本消失（圖4A）。sham 組小鼠胸腺組織胸小葉及小葉間隔結(jié)構(gòu)完整，胸腺內(nèi)淋巴細胞形狀規(guī)整，呈圓形，細胞數(shù)量豐富，排列致密，未見空洞或凹陷；模型組小鼠胸腺組織胸小葉體積明顯縮小，間隔不清晰，結(jié)締纖維組織增生明顯，淋巴細胞排列散亂、疏松，部分淋巴細胞與間質(zhì)脫離呈空洞結(jié)構(gòu)，部分淋巴與間質(zhì)徹底脫離出現(xiàn)明顯凹陷；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠胸腺組織胸小葉明顯增大，結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細胞基本無脫落現(xiàn)象，排列緊密（圖4B）。

圖4 各組小鼠脾臟、胸腺組織超微結(jié)構(gòu)改變Fig.4 Ultrastructure changes of spleen and thymus of mice in each group

2.5 TUNEL 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺細胞凋亡 與sham 組相比，模型組小鼠脾臟和胸腺組織細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠脾臟和胸腺組織細胞凋亡率明顯降低（P<0.05，圖5）。

圖5 TUNEL染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺細胞凋亡Fig.5 TUNEL staining to detect cell apoptosis of spleen and thymus of mice in each group

2.6 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠胸腺組織T 淋巴細胞凋亡 與sham 組相比，模型組小鼠T 淋巴細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠T淋巴細胞凋亡率明顯降低（P<0.05，圖6）。

圖6 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠胸腺T細胞的凋亡Fig.6 Flow cytometry to detect apoptosis of thymus T cells of mice in each group

2.7 ELISA 檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10表達 與sham組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10 表達明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠血清中促炎分子TNF-α、IL-6表達明顯降低（P<0.05），抑炎分子IL-10 表達明顯升高（P<0.05，圖7）。提示PD-L1 拮抗組小鼠單核細胞功能有所恢復(fù)。

圖7 ELISA檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10表達Fig.7 ELISA to detected expressions of serum TNF-α，IL-6 and IL-10 of mice in each group

2.8 PD-L1 與Caspase-3 蛋白關(guān)系預(yù)測 Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末端剪切酶，是細胞凋亡的執(zhí)行分子，本研究首先在生物信息學(xué)網(wǎng)站http：//genemania.org 數(shù)據(jù)庫顯示PD-L1 可直接影響Caspase-3表達（圖8）。

圖8 PD-L1與Caspase-3蛋白關(guān)系預(yù)測Fig.8 Prediction of relationship between PD-L1 and Cas?pase-3 protein

2.9 ELISA 檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Cas?pase-3 表達 與sham 組相比，模型組小鼠細胞中Caspase-3蛋白表達明顯上升（P<0.05），與模型組相比，PD-L1 拮抗組小鼠Caspase-3 表達明顯下降（P<0.05，圖9）。

圖9 ELISA檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Caspase-3表達Fig.9 ELISA to detect expression of Caspase-3 in spleen and thymus tissues of mice in each group

3 討論

膿毒癥是一種與免疫抑制密切相關(guān)的危及生命的器官功能障礙綜合征，常見于外科術(shù)后、創(chuàng)傷以及免疫低下等情況，如未有效控制細菌引發(fā)的全身性嚴重感染可進一步演變?yōu)槟摱景Y休克或多器官衰竭綜合征，威脅患者生命［12］。由于其病理生理發(fā)病機制尚未明確，尚無有效藥物用于膿毒癥治療，因此解除患者免疫抑制，提高其自身免疫功能在膿毒癥臨床治療中意義重大。

免疫系統(tǒng)包括器官、組織、細胞和效應(yīng)分子在內(nèi)的綜合復(fù)雜系統(tǒng)，其中脾臟和胸腺是哺乳動物最重要的免疫器官，脾臟是外周免疫器官的關(guān)鍵，是機體內(nèi)最大的淋巴器官，可產(chǎn)生淋巴細胞，胸腺是中樞免疫器官核心，是成熟的T 淋巴細胞主要分布區(qū)域，是T 淋巴細胞進行分化、發(fā)揮免疫功能的場所。免疫器官臟器指數(shù)是衡量免疫系統(tǒng)臟器是否受損的關(guān)鍵指標［13］。CHANG 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，提高膿毒癥大鼠免疫功能可明顯改善膿毒癥引起的器官損傷。黃鑫等［15］研究表明，免疫抑制膿毒癥大鼠脾臟和胸腺受到不同程度損傷，導(dǎo)致免疫功能下降。T 淋巴細胞數(shù)量驟減是導(dǎo)致膿毒癥免疫抑制的重要原因。研究表明，提高早期膿毒癥大鼠T細胞水平能明顯改善其免疫功能［16-17］。許志恒等［18］研究發(fā)現(xiàn)，提高外周血T淋巴細胞水平能明顯緩解膿毒癥相關(guān)肺損傷。本研究中模型組小鼠脾臟、胸腺組織T 淋巴細胞凋亡率明顯升高，抑制T 細胞凋亡可明顯改善脾臟和胸腺組織損傷。

PD-1/PD-L1通路在多種免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。GANE 等［20］研究表明，控制PD-1 抗體用量阻斷PD-1/PD-L1 通路可明顯增強慢性病毒性肝炎患者淋巴細胞功能，提高其抗感染能力。SAGE等［21］研究報道，樹突狀細胞PD-L1 可抑制濾泡性T 細胞分化，導(dǎo)致免疫功能障礙。研究證實，PD-1/PD-L1通路與淋巴細胞凋亡關(guān)系密切［22］。但PD-1/PD-L1通路在膿毒癥淋巴細胞凋亡中的作用機制鮮有報道。本研究表明，阻斷PD-L1 后，PD-L1 拮抗組小鼠在膿毒癥病理以及細胞凋亡率方面均有明顯改善。生物信息數(shù)據(jù)庫顯示，PD-L1 和凋亡蛋白Caspase-3存在調(diào)控關(guān)系，ELISA 結(jié)果表明阻斷PD-L1 可明顯降低膿毒癥小鼠組織Caspase-3表達，推斷阻斷PD-L1可能通過抑制Caspase-3表達抑制T細胞凋亡。

單核細胞在機體炎癥應(yīng)激中占據(jù)核心地位。機體膿毒癥應(yīng)激過程中單核細胞釋放TNF-α、IL-6和IL-10 等炎癥因子［23］。危重膿毒癥患者單核細胞體外分泌炎癥因子能力下降，直接導(dǎo)致其免疫削弱和病死率提高［24］。陳海龍等［25］研究報道，干預(yù)膿毒癥患者單核細胞功能可明顯改善重型膿毒癥患者免疫抑制情況。PD-1/PD-L1 信號通路在誘導(dǎo)和維持外周組織免疫耐受中發(fā)揮重要作用，對防止組織過度炎癥反應(yīng)發(fā)生具有積極作用［26］。ELISA 結(jié)果表明，阻斷PD-L1 可明顯降低促炎分子TNF-α、IL-6 表達，增強抑炎分子IL-10 表達，說明PD-L1 阻斷可明顯改善膿毒癥小鼠單核細胞功能。

綜上所述，膿毒癥小鼠中，PD-L1阻斷可有效降低T細胞凋亡率，改善其單核細胞功能，但如何將其應(yīng)用于膿毒癥臨床靶向治療仍需進一步研究。