大蒜衍生的類外泌體樣納米顆粒通過上調(diào)腸道TGF-β1 改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究①

肖 定 紀桂寶 溫松奇 鄒雯佳 胡 勇

（武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)附屬普愛醫(yī)院普通外科，武漢 430030）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種臨床較為常見的慢性腸道疾病，同時也是一種由多因素引起的非特異性炎癥性疾病，其病程遷延不愈，病情輕重不一。UC 主要發(fā)病于結(jié)腸黏膜或黏膜下層，常累及患者的直腸及乙狀結(jié)腸。其臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、惡心、納差、里急后重、嘔吐、發(fā)熱及營養(yǎng)不良等，患者同時可伴有皮膚、黏膜、肝膽、眼及腸外的表現(xiàn)［1］。目前臨床上對UC 的治療主要采用藥物治療，即采用免疫抑制劑、生物制劑、糖皮質(zhì)激素及氨基水楊酸類治療，盡管藥物的使用能夠緩解患者癥狀，但其副作用仍然明顯且無法避免復(fù)發(fā)［1］。中醫(yī)藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)療的寶貴財富，越來越多的研究表明中藥在UC的治療中發(fā)揮重要作用，特別是中藥方劑聯(lián)合西藥的中西醫(yī)結(jié)合治療方法在臨床上被廣泛應(yīng)用［2］。盡管如此，中醫(yī)藥在UC 治療領(lǐng)域仍存在很多局限。因此尋找新的、綠色的中醫(yī)藥治療方法成為中醫(yī)臨床治療UC 面臨的難點。為此，本研究擬探討綠色無公害食物來源中藥材大蒜衍生的類外泌體樣納米顆粒（garlic-derived exosome-like nanoparticles，GDELN）在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中對腸道炎癥的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 5～6 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，采用國際標準方法清除腸道微生物，清除后收集小鼠糞便，采用常規(guī)細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測并細菌。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（2020-1102）。

1.2 方法

1.2.1 GDELN 的制備及鑒定 將產(chǎn)地為山東的新鮮大蒜參考文獻［3］方法去皮后勻漿，采用梯度離心法（500 g 10 min，2 000 g 20 min，5 000 g 30 min，10 000 g 1 h，100 000 g 2 h）離心，100 000 g 之前每次的沉淀均丟棄，收集100 000 g 后的沉淀物，用預(yù)冷的PBS重懸沉淀，參考文獻［4］中植物外泌體純化方法，通過8%、30%、45%及60%的梯度蔗糖離心純化，收集30%～45%的外泌體樣顆粒。電鏡檢測：將收集的GDELN 溶于含3%戊二醛及1%多聚甲醛的0.1 mol/L 的二甲胂酸鈉緩沖液，然后用含2%四氧化鋨的0.1 mol/L 的二甲胂酸鈉緩沖液固定1 h，2%醋酸鈾作用30 min 后經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇分別脫水15 min。電鏡下觀察顆粒形態(tài)。顆粒直徑分析：取純化后的納米顆粒溶于40μm濾膜過濾后的PBS，采用倍比稀釋法分析顆粒濃度，取1∶1 000 稀釋后的顆粒，采用NANOSIGHT 檢測GDELN的直徑及濃度。

1.2.2 GDELN進入小鼠腸道后的吸收分布檢測Dir 染料標記的2.5 mg GDELN 懸浮在0.5 ml PBS中，通過灌胃方式給予小鼠。在第0、2、4、6 小時使用珍珠脈沖成像系統(tǒng)（LI-COR Biosciences）捕獲活體圖像。16 h 后，對小鼠實施安樂死，采集小鼠肝、肺、心、腎、胃、腸、腸系膜淋巴結(jié)（MLN）、脾和腦，采用Odyssey CLX成像儀掃描GDELN在器官內(nèi)的分布。

1.2.3 結(jié)腸炎動物模型的建立及GDELN 處理小鼠 5～6周齡C57BL/6雄性小鼠隨機分3組，8只/組，第1 天開始3 組小鼠分別給予PBS、PBS、GDELN［2.5 mg/（只·d）］灌胃，在預(yù)處理10 d后，3組小鼠分別給予PBS、2%DSS、2%DSS+GDELN。

1.2.4 GDELN 對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、生存期及腸道炎癥的影響 從小鼠給予DSS開始每天稱量、記錄并分析各組小鼠體質(zhì)量，在處死小鼠前比較分析各組小鼠體質(zhì)量差異；從實驗開始記錄每組每只小鼠生存的時間，直至其中1 組小鼠全部死亡，統(tǒng)計分析各小組的生存期；在第14 天時處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織，一部分用于固定后組織切片染色，HE 及Alcian blue 染色參照參考文獻［5］的方法；一部分用于蛋白Array（The Common Cytokines RT2Profiler，ARY006）檢測結(jié)腸組織中炎癥細胞因子的表達（參照試劑盒說明書）。

1.2.5 炎癥細胞因子及Smad信號通路的檢測 按照ELISA檢測方法提取組織蛋白，對蛋白Array篩選出的促炎細胞因子IL-8、TNF-α 和IL-6 及抑炎細胞因子TGF-β1、IL-10 和IL-4 進行一一驗證，統(tǒng)計分析各細胞因子的表達差異。qPCR及Western blot 檢測結(jié)腸組織中TGF-β1 受體的表達，Western blot 檢測結(jié)腸組織Smad2和Smad3的磷酸化。

1.2.6 去除腸道微生物后GDELN 對小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的影響 3 組小鼠飲水中分別加入氨芐青霉素鈉（1 g/L）、硫酸新霉素（1 g/L）、鹽酸萬古霉素（500 mg/L）和甲硝唑（1 g/L）4 種抗生素組合連續(xù)喂養(yǎng)4 周，以完全清除小鼠腸道共生細菌。然后分別給3 組小鼠PBS、PBS、GDELN［2.5 mg/（只·d）］灌胃10 d（灌胃所用試劑及器材均為無菌），10 d 后分別給予PBS、2%DSS、2%DSS+GDELN（無菌），從給予DSS開始，每天稱量體質(zhì)量，在處死前比較分析各組小鼠體質(zhì)量差異。記錄每組每只小鼠的生存時間，直至其中一組小鼠全部死亡后統(tǒng)計分析各小組的生存期。第14 天處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織，部分用于固定后組織切片染色，部分用于ELISA 檢測IL-8、TNF-α、IL-6、TGF-β1、IL-10 和IL-4 水平，qPCR及Western blot 檢測TGF-β1 受體表達，Western blot檢測Smad2和Smad3的磷酸化。

1.2.7 GDELN 進入腸道后腸道微生物代謝產(chǎn)物對結(jié)腸上皮細胞TGF-β1 表達的影響 收集實驗小鼠的糞便及結(jié)腸內(nèi)容物，以預(yù)冷的PBS溶解，然后梯度離心（500 g 10 min，2 000 g 20 min，5 000 g 30 min，10 000 g 1 h）去除沉淀，收集上清（無菌）。結(jié)腸上皮細胞株MC-38培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，當細胞生長至85%時消化后接種至6孔板，1×105個/孔，24 h 后加入各組動物腸道內(nèi)容物離心后的上清液，再次培養(yǎng)48 h，期間再次加入1 次代謝物上清。當細胞長滿培養(yǎng)板時，分別收集細胞制備RNA 和蛋白。qPCR及Western blot檢測TGF-β1表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究采用Graphad8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDELN 的制備、鑒定及其在體內(nèi)的內(nèi)化分布 通過梯度離心及蔗糖純化后對GDELN 的直徑進行測定，結(jié)果顯示，GDELN 的直徑為（156±48）nm（圖1A、B）。電鏡結(jié)果顯示，GDELN呈現(xiàn)球形（圖1C）。小鼠活體成像結(jié)果顯示，GDELN 能夠在小鼠體內(nèi)被吸收，其中肝臟、消化道比例最高（圖1D、E）。

圖1 GDELN的制備、鑒定及其在體內(nèi)的內(nèi)化分布Fig.1 Preparation and identification of GDELN and its internalization distribution in vivo

2.2 GDELN 對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量及生存期的影響 GDELN 處理小鼠能顯著抑制DSS 導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量下降，與未處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖2A）；此外，給予GDELN 的小鼠生存期顯著高于未給予GDELN 的小鼠（P<0.05），在DSS 組小鼠均死亡的情況下，GDELN 處理組仍未有小鼠發(fā)生死亡事件（圖2B）。

2.3 GDELN 對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的影響 GDELN 處理組小鼠結(jié)腸長度明顯長于未處理組（P<0.05，圖3A），經(jīng)HE 及阿利新藍染色后觀察發(fā)現(xiàn)，GDELN 可顯著抑制DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)完整性顯著優(yōu)于未處理組（圖3B、C）。細胞因子蛋白Array 檢測結(jié)果表明，GDELN 可抑制IL-8、TNF-α 及IL-6 的表達，同時上調(diào)TGF-β1 表達（P<0.05，圖3D、E）。ELISA 結(jié)果表明，GDELN 處理組小鼠IL-8、TNF-α 及IL-6 均顯著低于未處理組，而TGF-β1 顯著高于未處理組（P<0.05，圖3F）。Western blot結(jié)果則表明，GDELN處理組小鼠結(jié)腸組織中Smad2和Smad3磷酸化水平顯著高于未處理組（P<0.05，圖3G）。

圖3 GDELN對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥的影響Fig.3 Effect of GDELN on colonic inflammation in mice with DSS-induced colitis

2.4 腸道微生物對GDELN 緩解DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的影響 清除小鼠腸道內(nèi)菌群后，GDELN 抑制結(jié)小鼠體質(zhì)量下降的作用被消除（P<0.05，圖4A）；小鼠生存期也未得到顯著延長（P<0.05，圖4B）；結(jié)腸組織染色表明，清除腸道微生物后，GDELN 無法發(fā)揮抑制腸道炎癥的作用（P<0.05，圖4C）；ELISA 結(jié)果顯示，清除腸道微生物后，GDELN 無法上調(diào)結(jié)腸組織中TGF-β1 表達，也無法抑制IL-8、TNF-α 及IL-6 表達（圖4D）；Western blot 結(jié)果顯示，清除腸道微生物后，GDELN 無法上調(diào)TGF-β1 的表達及Smad2 和Smad3 的磷酸化水平（P<0.05，圖4E）；體外細胞實驗結(jié)果表明，GDELN 處理小鼠腸道微生物的代謝產(chǎn)物能顯著上調(diào)結(jié)腸上皮細胞MC-38 中TGF-β1 的表達（圖4F）。

圖4 去除腸道微生物后GDELN 對小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的影響Fig.4 Effect of GDELN on DSS-induced colitis in mice after removal of intestinal microorganisms

3 討論

目前UC 的病因尚不明確，但其發(fā)病機制正在被逐步破解。在過去的十幾年中，全基因組關(guān)聯(lián)研究、基于微陣列的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析以及基于腸道微生物的16s 測序分析都為UC 的研究提供了新的研究方向［5-7］。由于對發(fā)病機制的逐步了解，新的治療靶點也在被不斷發(fā)現(xiàn)。消化系統(tǒng)每天都暴露在食源性的納米顆粒中，其中包括可食用植物來源的納米顆粒。在健康人的腸道中，免疫系統(tǒng)和微生物通過適當調(diào)節(jié)外來抗原（包括食物源性抗原負荷及其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)）從而維持腸道的恒定平衡［8］。一旦這種平衡被打破，就可能導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。研究組在小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)，食用來源的GDELN能夠降低小鼠結(jié)腸炎癥的嚴重程度，緩解小鼠體質(zhì)量下降程度，且結(jié)腸縮短程度明顯低于未給予GDELN組小鼠。提示GDELN 可能通過調(diào)控腸道免疫反應(yīng)從而調(diào)節(jié)腸道平衡抑制結(jié)腸炎癥。

研究表明，細胞因子在調(diào)節(jié)腸道免疫中發(fā)揮重要作用，而在腸道免疫中的細胞因子又分為促炎細胞因子和抑炎細胞因子［9-11］。促炎癥細胞因子主要包括IL-8、TNF-α、IL-6 等，抑炎細胞因子主要包括TGF-β1、IL-10、IL-4 等。在UC 的發(fā)生過程中，促炎細胞因子和抑炎細胞因子的平衡失調(diào)，IL-8、TNF-α及IL-6 顯著上調(diào)，TGF-β1 顯著下調(diào)［12］。IL-8 能夠促進PMN 進入炎癥結(jié)腸組織，從而加重炎癥反應(yīng)［13］。TNF-α 能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達，同時誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生血小板活化因子和IL-8，這些因素共同導(dǎo)致PMN、淋巴細胞及單核巨噬細胞等與血管內(nèi)皮細胞的黏附，進而遷移和外滲至結(jié)腸局部組織，引起腸道炎癥反應(yīng)［14-15］。此外，在IL-6 的參與下，TNF-α能夠誘導(dǎo)凝血酶形成，從而使內(nèi)皮細胞表面從抗凝血狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌獱顟B(tài)，導(dǎo)致黏膜微循環(huán)出現(xiàn)障礙，從而降低腸道黏膜的屏障作用，促進細菌進入腸黏膜加重腸道炎癥［16］。本研究結(jié)果表明，小鼠經(jīng)GDELN 處理后可顯著抑制DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中促炎癥細胞因子IL-8、TNF-α 及IL-6 的表達。進一步提示GDELN 可能通過調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)從而緩解結(jié)腸的炎癥。

TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子家族中的重要成員，是一種具有免疫抑制作用的細胞因子，目前的研究表明，體內(nèi)幾乎所有細胞均可表達并分泌TGF-β1，同時也都對該細胞因子產(chǎn)生反應(yīng)。正常情況下，腸道黏膜中高度表達TGF-β1，而TGF-β1 作為抑制炎癥的細胞因子，其功能非常強大，可抑制巨噬細胞的黏附和遷移，同時還能抑制T 細胞和B 細胞凋亡，抑制許多重要的炎癥介質(zhì)表達從而抑制腸道炎癥［17］。在活動性結(jié)腸炎患者中，TGF-β1表達下調(diào)，而在UC患者中，TGF-β1 表達上調(diào)與病情緩解明顯有關(guān)［18］。TGF-β1 與其受體的結(jié)合導(dǎo)致細胞內(nèi)Smad2 和Smad3 的磷酸化，進而與Smad4 形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細胞核并抑制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄水平，其中就包括IL-8、TNF-α 及IL-6 等［19-22］。本研究以DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠GDELN 后，結(jié)腸組織中TGF-β1 的表達顯著上調(diào)，同時Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著上調(diào)。

腸道黏膜穩(wěn)態(tài)是基于豐富多樣的共生細菌生態(tài)系統(tǒng)的生理共存。越來越多的證據(jù)表明腸道菌群代謝物（包括細菌與膳食成分相互作用的副產(chǎn)物）均可影響腸道的免疫平衡。任何微生物的異常代謝物都能通過改變營養(yǎng)和支持網(wǎng)絡(luò)的機制，降低腸黏膜的防御能力，影響腸道免疫系統(tǒng)，進而影響機體健康［23］。微生物群從宿主無法消化的食物成分中獲取能量，這些食物成分被代謝生成物質(zhì)，然后被宿主吸收，隨后合成為必需營養(yǎng)素，如維生素B和K等，這個過程改變了整體能量的平衡［24］。因此，局部微生物群、腸上皮細胞和常駐免疫細胞間復(fù)雜的相互作用有助于胃腸道環(huán)境的穩(wěn)定。在這個系統(tǒng)中，細菌代謝產(chǎn)物對上皮屏障和免疫細胞正常功能發(fā)揮重要的反饋信號作用。本研究去除小鼠腸道微生物，再給予DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠GDELN 后，GDELN對腸道炎癥的緩解作用被消除，其中TGF-β1表達顯著下調(diào)，炎癥因子IL-8、TNF-α 及IL-6 表達顯著上調(diào)。提示GDELN進入小鼠腸道后，是通過腸道微生物發(fā)揮其對腸道免疫調(diào)控作用的。研究組在收集小鼠腸道微生物代謝產(chǎn)物進行體外實驗后，發(fā)現(xiàn)腸道微生物代謝產(chǎn)物能夠上調(diào)結(jié)腸上皮細胞TGF-β1的表達，進一步證實GDELN 進入腸道后，通過調(diào)控微生物代謝產(chǎn)物從而實現(xiàn)對結(jié)腸炎癥的緩解。

綜上所述，本研究證實了日?？墒秤弥兴幉腉DELN 能夠顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，并通過小鼠動物模型及細胞體外實驗證實GDELN 通過調(diào)控腸道微生物的代謝產(chǎn)物從而上調(diào)TGF-β1 表達，進而激活其下游的Smad2/Smad3 信號通路，實現(xiàn)對炎癥細胞因子的調(diào)控，緩解結(jié)腸炎癥。