免疫檢查點(diǎn)分子T細(xì)胞激活抑制物免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（VISTA）研究進(jìn)展①

劉婉梅 郄稱心 柳 軍 （中國藥科大學(xué)新藥篩選中心，南京 210009）

免疫系統(tǒng)受共刺激信號分子和抑制性分子（即免疫檢查點(diǎn)）的雙重調(diào)節(jié)。T 細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號，第一信號是抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）通過抗原肽/主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）與T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）相互作用提供的，確保所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對抗原具有特異性。T細(xì)胞和APC 上的共刺激信號為T 細(xì)胞活化的第二信號，刺激性檢查點(diǎn)促進(jìn)初始T 細(xì)胞激活及效應(yīng)細(xì)胞、記憶和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cell，Treg）反應(yīng)。抑制性檢查點(diǎn)限制了T細(xì)胞活化閾值，縮短了免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間，并具有調(diào)節(jié)炎癥和機(jī)體耐受等多種作用［1］。

目前發(fā)現(xiàn)的抑制性檢查點(diǎn)包括B7/CD28家族成員細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lympho?cyte associated antigen 4，CTLA-4）、程序性死亡受體1/配 體1（programmed death-1，PD-1）/（programmed cell death-ligand-1，PD-L1）、B7-H3（CD276）、B7-H4、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）超家族成員LAG-3、TIGIT 和CD96、胞外核苷酸水解酶CD39 和CD73 和TIM-3，可通過抑制T 細(xì)胞激活或影響T 細(xì)胞增殖影響免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用，從而導(dǎo)致免疫逃逸［2-7］。阻斷這些抑制信號即可提高抗癌免疫應(yīng)答，最終消除腫瘤。針對CTLA-4（ipilimumab）、PD-1（pembrolizumab 和nivolumab）的抗體阻斷共抑制受體與其配體相互作用已在多種抗腫瘤治療中取得了顯著效果［8-9］。隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immunocheckpoint inhibitors，ICIs）的發(fā)現(xiàn)及其在癌癥治療中的應(yīng)用，腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四大常規(guī)腫瘤治療手段。

T 細(xì)胞激活抑制物免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（V-domain immunoglobulin suppressor of T-cell acti?vation，VISTA）在髓細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞上的組成性表達(dá)與其在調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的重要作用相結(jié)合，使VISTA 成為有前景的免疫治療干預(yù)靶點(diǎn)。本文對VISTA 的結(jié)構(gòu)、功能以及免疫調(diào)節(jié)等進(jìn)行總結(jié)。

1 VISTA結(jié)構(gòu)

VISTA 也叫B7-H5、SISP1、Gi24、Dies-1、PD-1H和DD1α，由Visr 基因（RIKEN cDNA 4632428N05）編碼。鼠Visr 基因具有930 個(gè)堿基對，可翻譯為具有309 個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，包括130 個(gè)氨基酸組成的胞外IgV 結(jié)構(gòu)域、23 個(gè)氨基酸構(gòu)成的莖桿區(qū)、21個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)及97個(gè)氨基酸構(gòu)成的胞內(nèi)區(qū)［10］。VISTA 在物種間高度保守，是B7 家族中最保守的成員，在小鼠和人類之間有76%同源性，并具有相似表達(dá)模式。人VISTA 也是Ⅰ型跨膜蛋白，由311個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括1個(gè)由33個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號肽、130 個(gè)氨基酸構(gòu)成的胞外IgV 結(jié)構(gòu)域、20 個(gè)氨基酸組成的跨膜段以及90 個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)段［11］。

BLAST 序列比對顯示VISTA 的胞外IgV 結(jié)構(gòu)域和B7 家族中的PD-L1 最為接近，但與B7 家族不同的是，VISTA僅包含單個(gè)IgV結(jié)構(gòu)域，其他B7家族成員均包含IgV 和IgC 結(jié)構(gòu)域，如B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-DC（PD-L2）、B7-H1（PD-L1）和B7-H3 均為雙結(jié)構(gòu)域蛋白，且主要作為配體發(fā)揮作用。相反，這些蛋白受體，包括CD28、CTLA-4、誘導(dǎo)性T 細(xì)胞共刺激分子（inducible T-cell costimulator，ICOS）和PD-1，均具有單個(gè)IgV 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)［12］。盡管既往研究證明VISTA 具有配體功能，但基于VISTA 結(jié)構(gòu)域組成，相比于B7 家族配體，VISTA 在結(jié)構(gòu)和功能上似乎與受體更加相似，整個(gè)VISTA 分子的系統(tǒng)發(fā)育分析與PD-1、CD28 和CTLA-4 相似，與PD-1 同源性 最 高［10］。同 時(shí)，VISTA 的 胞 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 域 不 包 含ITIM、ITSM 或ITAM，而在胞質(zhì)氨基酸位置220 和272 處包含2 個(gè)潛在的蛋白激酶C 結(jié)合位點(diǎn)以及脯氨酸殘基，這些殘基可能充當(dāng)對接位點(diǎn)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，因此，VISTA同時(shí)充當(dāng)受體和配體［13］。

基于VISTA 與B7 家族配體蛋白PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4或B7家族受體PD-1，ICOS和CTLA-4序列比對已確定了VISTA 序列中重要的保守氨基酸，VISTA 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含2 個(gè)在Ig 超家族中保守的半胱氨酸（Cys54和Cys145），同時(shí)，VISTA IgV 結(jié)構(gòu)域均包含將VISTA 與B7 家族配體和受體區(qū)分開的幾個(gè)特征，最顯著的區(qū)別特征是IgV域中的另外3個(gè)半胱氨酸（Cys44、Cys83和Cys144），莖桿區(qū)中的1 個(gè)半胱氨酸（Cys177）以及在C''和D 之間插入1 個(gè)環(huán)（C-C'環(huán)）［10］。MEHTA 等［12］獲得了1.85?的VISTA 胞外段晶體，發(fā)現(xiàn)VISTA 胞外段由10 個(gè)β 鏈和3 個(gè)α 螺旋組成，包含在VISTA 序列中發(fā)現(xiàn)的6 個(gè)半胱氨酸殘基以及3 個(gè)二硫鍵，其中包括1 個(gè)連接β 鏈B 和F 的保守的二硫鍵（C22/C114），是Ig 超家族蛋白的標(biāo)志性特征，另外2 個(gè)二硫鍵分別連接殘基C12/C146 和C51/C113，這在任何其他B7 家族蛋白中均不存在。C-C'環(huán)之間的蛋白片段包含21 個(gè)形成延伸環(huán)的殘基和4 個(gè)α 螺旋內(nèi)的殘基，通過環(huán)內(nèi)的分子內(nèi)相互作用以及蛋白核心殘基得以穩(wěn)定。SLATER 等［14］也獲得了1.9? 的VISTA 胞外段晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)VISTA結(jié)構(gòu)域比Pfam 數(shù)據(jù)庫V-set Ig 家族中其他已知的IgV 樣結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)更大，主要原因除較長的C-C'環(huán)外，還存在Hβ 鏈，該鏈通過將其連接至A'鏈的二硫鍵“鉗制”至IgV樣結(jié)構(gòu)域，這在已知的IgV結(jié)構(gòu)域中不存在。同時(shí)，VISTA 胞外段中組氨酸殘基的數(shù)量異常高，其中多數(shù)是高度保守的，且局部集中于分子表面互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining re?gion，CDR）的近半部分，而構(gòu)成FG 環(huán)的組氨酸三聯(lián)體是最重要的。

2 VISTA表達(dá)

正常情況下，鼠VISTA 主要在造血組織（脾臟、胸腺、骨髓等）中表達(dá)，在非造血組織（如心臟、腎臟、腦和卵巢）中表達(dá)較弱。造血細(xì)胞中，VISTA 主要表達(dá)于髓細(xì)胞，包括粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脾CD11b+單核細(xì)胞、CD11c+樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）。VISTA 在自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞表達(dá)較少。T淋巴細(xì)胞中，VISTA表達(dá)于初始CD4+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞，包括Treg、記憶T 細(xì)胞和TCRγδT 細(xì)胞，但在B 細(xì)胞表達(dá)較低。體外培養(yǎng)的T 細(xì)胞被激活后VISTA 表達(dá)瞬時(shí)上調(diào)，但體外24 h 或體內(nèi)幾天后表達(dá)下調(diào)［10，13］。因此在進(jìn)行VISTA 對CD4+T 細(xì)胞激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)程研究時(shí)，應(yīng)考慮VISTA在野生型（wild type，WT）CD4+T 細(xì)胞上表達(dá)下降相對于VISTA敲除細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

人VISTA 主要在造血組織及白細(xì)胞浸潤的組織中表達(dá)，且在人胎盤中具有高表達(dá)。人VISTA 也在髓細(xì)胞中高表達(dá)，包括CD14+單核細(xì)胞、CD11c+DC 及中性粒細(xì)胞，但在CD19+B 細(xì)胞及CD56hiNK 細(xì)胞中不表達(dá)，在CD45loNK 細(xì)胞中低表達(dá)，在CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞中也有VISTA 表達(dá)［11］。體外培養(yǎng)后，單核細(xì)胞VISTA 表達(dá)逐漸下降［15］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，VISTA 在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最高，而在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較低［16］。

腫瘤和炎癥條件下，VISTA 在各種細(xì)胞上的表達(dá)可能發(fā)生改變。咪喹莫特（imiquimod，IMQ）誘發(fā)的銀屑病模型小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)的耳朵皮膚中，TCRγδT 細(xì)胞與引流淋巴結(jié)相比，VISTA 表達(dá)更高［17］；系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythemato?sus，SLE）模型小鼠中，VISTA 在炎癥性單核細(xì)胞和活化T 細(xì)胞中表達(dá)減少［18］。人類腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)VISTA 表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，包括胃癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、食管腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌、惡性胸膜間皮瘤及黑色素瘤［19-26］。此外，正常人群和關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中均檢測到VISTA表達(dá)［27］。

3 VISTA表達(dá)調(diào)控

VISTA 表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)。FLIES 等［13］發(fā)現(xiàn)VISTA 在T 細(xì)胞上的表達(dá)受PMA+離子霉素刺激上調(diào)，而ConA、單獨(dú)的CD3抗體或聯(lián)合CD28抗體也可誘導(dǎo)VISTA 表達(dá)上調(diào)。慢性人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者外周血單 個(gè) 核 細(xì) 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中，TLR3 和TLR5 激動劑以及IL-10 和IFN-γ誘導(dǎo)單核細(xì)胞VISTA 表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)，而TLR8 和TLR9 激動劑可使VISTA 表達(dá)下調(diào)，VISTA表達(dá)不受TLR1、2、4影響［15］。但BORGGREWE 等［16］發(fā)現(xiàn)脂多糖（激動TLR4）刺激新生小鼠和成年恒河猴獼猴小膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致VISTA 表達(dá)下調(diào)，并伴有VISTA 啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域乙酰化水平降低，小鼠體內(nèi)模型不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中，小膠質(zhì)細(xì)胞中VISTA 表達(dá)降低，提示小膠質(zhì)細(xì)胞上VISTA 可能具有其他功能，轉(zhuǎn)錄因子Pu.1和Mafb可能調(diào)控VISTA表達(dá)。p53 可通過上調(diào)VISTA 表達(dá)促進(jìn)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞清除［28］。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducible factor 1-alpha，HIF-1α）結(jié)合至保守的缺氧反應(yīng)元件中的VISTA啟動子上調(diào)髓細(xì)胞上VISTA表達(dá)［29］。數(shù)據(jù)顯示Jund、Fos以及NF-κB可能是VISTA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制因子［30］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein，BMP4）在維持胚 胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）處于未分化狀態(tài)中起重要作用。研究表明，VISTA 是小鼠ESC 中miR-125a 的直接靶標(biāo)。BMP4誘導(dǎo)miR-125a 轉(zhuǎn)錄，后者下調(diào)VISTA，而VISTA 減少導(dǎo)致BMP4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)，因此ESC 中存在控制BMP4 信號的反饋回路。miR-125b 也被證明可通過下調(diào)VISTA 表達(dá)及影響B(tài)MP4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制ESC分化［31-33］。胃癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中發(fā)現(xiàn)，Visr基因5'端CpG 島甲基化也會導(dǎo)致VISTA 表達(dá)減少［24，34］。ROSENBAUM 等［26］發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞中Visr 基因受FOXD3 調(diào)節(jié)，BRAF 抑制導(dǎo)致FOXD3 表達(dá)上調(diào)和VISTA轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平下調(diào)。

4 VISTA功能

4.1 VISTA 在髓細(xì)胞上的功能 VISTA 在髓細(xì)胞上可充當(dāng)配體發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，相比于未表達(dá)VISTA 的骨髓來源樹突狀細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDC），表達(dá)VISTA 的BMDC 可抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。VISTA-Ig 融合蛋白可抑制T 細(xì)胞（包括CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、初始T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞）增殖活化、減少細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ等）分泌并促進(jìn)T細(xì)胞早期激活標(biāo)志物（CD69、CD44和CD25）表達(dá)，但不會導(dǎo)致T 細(xì)胞凋亡，且不會抑制B 細(xì)胞增殖?；罨?4 h 去除VISTA-Ig，其抑制作用仍存在，因此，VISTA 誘導(dǎo)T 細(xì)胞的抑制作用是持久的［10］。研究發(fā)現(xiàn)，VISTA-Ig 抑制T 細(xì)胞活化連接蛋白（linker for activation of T cell，LAT）磷酸化及CD3復(fù)合物募集，同時(shí)也抑制近端信號分子，即含有SH2 結(jié)構(gòu)域的76 kD 白細(xì)胞蛋白（SH2 domain con?taining leukocyte protein of 76 kD，SLP-76）和磷脂酶Cγ1（phospholipase Cγ1）以及下游分子Akt 和ERK1/2磷酸化，從而影響TCR 信號早期傳導(dǎo)［35］。體外存在TGF-β的情況下，VISTA-Ig可促進(jìn)Treg誘導(dǎo)作用［36］。

最近研究表明，單核細(xì)胞上表達(dá)的VISTA 可能具有受體功能。單核細(xì)胞上VISTA 表達(dá)超過一定閾值足以使其被激活，從而導(dǎo)致自發(fā)的細(xì)胞因子產(chǎn)生［15］。BHARAJ等［37］在VISTA 過表達(dá)人單核細(xì)胞中觀察到促炎基因（如TNF-α、IL-1β、IFN-α、γ、λ和IL-27）表達(dá)上調(diào)以及多種抗炎基因（如Hcar2、TAB1 和IL1RN）表達(dá)下調(diào)，上調(diào)最為顯著的信號傳導(dǎo)途徑為TNF-α/NF-κB，該作用需要VISTA 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域存在。引起VISTA 對T細(xì)胞的抑制作用以及對單核細(xì)胞的激活作用矛盾的原因尚不清楚。此外，VISTA 敲除（VISTA-/-）的骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow derived macrophage，BMDM）培養(yǎng)上清中，趨化因子受體CCR2 和CCR5 表面表達(dá)明顯下調(diào)，嚴(yán)重破壞了巨噬細(xì)胞的趨化性，且VISTA-/-小鼠巨噬細(xì)胞和骨髓來源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）遷移至腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）能力降低［38］。CEERAZ等［27］發(fā)現(xiàn)VISTA-/-BMDM 與免疫復(fù)合物結(jié)合后，抗炎基因表達(dá)增強(qiáng)，且VISTA-/-炎癥性單核細(xì)胞在脂多糖刺激后產(chǎn)生的TNF、IL-17 和IL-12p70減少。因此VISTA 可調(diào)節(jié)髓系單核細(xì)胞功能，進(jìn)一步研究VISTA 在該調(diào)節(jié)過程中的作用機(jī)制以及探索VISTA 在T細(xì)胞和髓細(xì)胞中的不同作用具有重要意義。

4.2 VISTA 在T 細(xì)胞上的功能 T 細(xì)胞上表達(dá)的VISTA 也有其內(nèi)在作用。不依賴APC 的情況下，采用CD3 刺激VISTA-/-CD4+T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞增多且細(xì)胞因子分泌增加。此外，采用VISTA-/-APC 刺激抗原特異性CD4+OT-ⅡT 細(xì)胞，與WT OT-Ⅱ相比，VISTA-/-OT-ⅡT 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌能力增強(qiáng)，均說明VISTA 充當(dāng)CD4+T 細(xì)胞上的受體以傳遞抑制信號［39］。ELTANBOULY 等［30］指出VISTA 在初始T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，可增強(qiáng)初始T 細(xì)胞靜止性，VISTA 缺失或抗體阻斷導(dǎo)致抗原特異性T 細(xì)胞顯著擴(kuò)增并降低其耐受性。VISTA在CD4譜系分化中也發(fā)揮作用，VISTA 是Foxp3（Treg譜系標(biāo)志）穩(wěn)定所必需的，并維持Treg表型，選擇性促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（induced Treg，iTreg），但iTreg 和天然調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（natural Treg，nTreg）的抑制功能皆不受影響，在炎癥環(huán)境中可抑制Treg 轉(zhuǎn)化為Th1和Th17細(xì)胞。VISTA 缺失導(dǎo)致各種體外和體內(nèi)系統(tǒng)和模型中Treg迅速減少［40-41］。

4.3 VISTA 在其他細(xì)胞上的功能 WANG 等［10］在MCA105 纖維肉瘤模型中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞上的VISTA 表達(dá)降低了疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫力，促進(jìn)腫瘤生長。MULATI 等［24］在子宮內(nèi)膜和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)，體外腫瘤細(xì)胞中的VISTA 抑制了T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，并降低了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）細(xì)胞浸潤。

新生兒CD71+紅細(xì)胞表達(dá)高水平VISTA，并通過分泌TGFβ 將初始CD4+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg，T 細(xì)胞與CD71+VISTA+紅細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，Akt 和mTOR 磷酸化水平顯著降低，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞向Treg 亞型分化［42］。小鼠和人類中均發(fā)現(xiàn)VISTA 在白色脂肪組織中呈高表達(dá)，且前脂肪細(xì)胞上的VISTA 表達(dá)沉默抑制其向脂肪細(xì)胞分化［43］。

5 VISTA受體和配體

如前所述，VISTA既可作為配體又可作為受體。作為配體，VISTA 與初始T 細(xì)胞或效應(yīng)T 細(xì)胞上的未知受體結(jié)合抑制T 細(xì)胞活化［10-11，44］。VISTA 作為受體，在T 細(xì)胞上表達(dá)并減少T 細(xì)胞活化，在單核細(xì)胞上作為受體調(diào)節(jié)單核細(xì)胞功能［45］。

WANG 等［46］將VSIG3（V-set and immunoglobulin domain containing 3）鑒定為VISTA 配體，VSIG3 可抑制T 細(xì)胞活化和增殖，減少細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生，抗VISTA 中和抗體可抑制VSIG3 和VISTA 結(jié)合以及VSIG3誘導(dǎo)的T 細(xì)胞抑制作用。盡管有專利認(rèn)為VSIG8 是VISTA 的 受 體［47］，但WANG 等［46］在VISTA 與VSIG3 結(jié)合的相同實(shí)驗(yàn)條件下未觀察到VSIG8與VISTA間的任何顯著相互作用。

TINOCO 等［48］注意到VISTA 胞外域異常富含組氨酸。酸性條件下，組氨酸的咪唑側(cè)鏈帶正電荷，具有極性和親水性，其假設(shè)VISTA 的富含組氨酸區(qū)域會產(chǎn)生pH 依賴性結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)優(yōu)先與酸性TME 中的受體結(jié)合，因此其在pH=6.0 條件下采用VISTA-Fc 嵌合蛋白和人CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行基于配體的受體捕獲，并確定P選擇素糖蛋白配體-1（P-selec?tin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）是VISTA 受體，同時(shí)證實(shí)PSGL-1 與VISTA 結(jié)合是由PSGL-1 硫酸化酪氨酸和VISTA 質(zhì)子化組氨酸殘基的電荷相互作用介導(dǎo)的。但VISTA 受體和配體相互作用的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。

ALOIA 等［32］發(fā)現(xiàn)VISTA 的胞外段可與BMP4 相互作用。YOON 等［28］發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞利用VISTAVISTA 相互作用介導(dǎo)對凋亡細(xì)胞的吞噬，具有潛在相互作用，且IgV 結(jié)構(gòu)域?qū)ISTA 間的相互作用是必不可少的。

6 VISAT抑制劑和激動劑

目前用于研究的VISTA 單克隆抗體如表1 所示。但CEERAZ 等［27］將8G8 和MH5A 作為VISTA 抑制 劑，而FLIES 等［13］及CHEN 等［51］以 單 克 隆 抗 體MH5A 作為VISTA 激動劑治療小鼠移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，aGVHD）和SLE，ELTAN?BOULY 等［30］將8G8 作為VISTA 激動劑，這種差別的原因可能為實(shí)驗(yàn)室制備抗體方式不同［52］。WANG等［53］將VISTA 的IgV 結(jié)構(gòu)域與軟骨低聚基質(zhì)蛋白（carti?lage oligomeric matrix protein，COMP）五聚結(jié)構(gòu)域結(jié)合設(shè)計(jì)了穩(wěn)定的五聚VISTA 構(gòu)建體（VISTA.COMP），是一種可有效激動VISTA 受體的免疫抑制劑。

表1 VISTA抗體及來源Tab.1 VISTA agonistic and antagonistic agents

NOELLE 等［54］通過噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種肽（AP1049），其氨基酸序列為Ser-Ser-Ala-Cys-Asp-Trp-Ile-Lys-Arg-Ser-Cys-His，或包含該氨基酸序列的其他肽（允許有1 或2 個(gè)殘基突變），可用于阻斷、抑制或中和VISTA。

SNYDER 等［55］發(fā)明了抗VISTA抗體和片段的制備方法，并證實(shí)VSTB可促進(jìn)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，在人VISTA 敲入（knockin，KI）小鼠膀胱癌模型中，VSTB112可有效抑制腫瘤進(jìn)展。

IMMUNEXT和JANSSEN合作開發(fā)的針對VISTA的抗體JNJ-61610588 在2016 年開啟了Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT02671955），但由于商業(yè)決定而結(jié)束研究，而后Curis 公司將繼續(xù)開展CI-8993（即JNJ-61610588）Ⅰ期臨床試驗(yàn)。此外，Curis 還開發(fā)了CA-170（NCT02812875），是一種小分子口服PD-L1/VISTA雙重抑制劑，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，且顯示出了良好的安全性和有效性，尤其是非鱗狀非小細(xì)胞肺癌［56］。CA-170 結(jié)構(gòu)尚未披露，據(jù)推測可能為1，2，4-噁二唑或1，3，4-噁二唑類結(jié)構(gòu)，取代側(cè)鏈一般為氨基酸殘基［57］。

7 VISTA與疾病

7.1 VISTA 與腫瘤 免疫監(jiān)視是免疫系統(tǒng)識別并迅速清除體內(nèi)突變細(xì)胞以防止腫瘤發(fā)生的功能。多項(xiàng)研究證實(shí)了VISTA 在抗腫瘤免疫方面的作用。小鼠腫瘤模型（包括MB49 膀胱腫瘤、B16OVA 黑色素瘤等）中采用VISTA 抗體可提高TME 中白細(xì)胞百分比，促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞浸潤、增殖和效應(yīng)分子（IFNγ和顆粒酶B）產(chǎn)生，且MDSC 和Treg減少，證明了VISTA 抗體可改變TME 抑制特征［36，49］。小鼠模型中觀察到即使腫瘤細(xì)胞上檢測不到任何VISTA表達(dá)或在腫瘤高PD-L1 表達(dá)情況下，VISTA 阻斷仍是有效的，表明VISTA 阻斷劑可能具有廣泛臨床適用性以及聯(lián)合治療的可能性，因此，可根據(jù)特定腫瘤中免疫檢查點(diǎn)表達(dá)情況制定特定免疫檢查點(diǎn)抑制劑的組合治療，以達(dá)到最佳抗腫瘤效果。課題組推測了VISTA在腫瘤發(fā)展中的作用（圖1）。

圖1 VISTA在腫瘤發(fā)展中的可能作用Fig.1 Possible role of VISTA in tumor development

小鼠腫瘤模型中觀察到VISTA 的抗腫瘤作用后，多項(xiàng)研究開始評估VISTA 在人類癌癥中的表達(dá)。人急性髓細(xì)胞性白血病（acute myelocytic leuke?mia，AML）分析發(fā)現(xiàn)，VISTA 主要表達(dá)于患者外周血MDSC，并介導(dǎo)AML 中CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答抑制［58］。KAKAVAND 等［59］研究了接受抗PD-1 抑制劑或抗PD-1 和抗CTLA-4 抑制劑組合的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者治療前和獲得耐藥治療后的樣本，發(fā)現(xiàn)治療后腫瘤內(nèi)VISTA+淋巴細(xì)胞及Treg 增加；GAO 等［60］發(fā)現(xiàn)在Ipilimumab 治療后，VISTA 在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，且CD68+PD-L1+和CD68+VISTA+巨噬細(xì)胞比例顯著提高。同樣，免疫檢查點(diǎn)耐藥的胰腺癌中發(fā)現(xiàn)VISTA 主要表達(dá)于CD68+巨噬細(xì)胞，表明其可能是耐藥性的重要機(jī)制，針對VISTA 免疫檢查點(diǎn)途徑有望成為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、前列腺癌和胰腺癌患者（尤其是耐藥后）的治療策略［61］。

此外，多個(gè)腫瘤樣本分析也評估了VISTA 與患者生存率的關(guān)系。HE 等［62］綜合了10 項(xiàng)關(guān)于實(shí)體瘤中VISTA 的研究并進(jìn)行了Meta 分析，發(fā)現(xiàn)相對于低表達(dá)VISTA 患者，實(shí)體瘤中VISTA 高表達(dá)與良好的總生存期（overall survival，OS）以及CD8+腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）浸潤相關(guān)。從表2 中可以看出，VISTA 表達(dá)導(dǎo)致黑色素瘤、人口腔鱗狀細(xì)胞癌等患者生存率降低，但對晚期漿液性卵巢癌、上皮樣惡性胸膜間皮瘤等患者生存期有益，因此不同類型的腫瘤中VISTA 表達(dá)方式不同，腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞上表達(dá)的VISTA 可能涉及不同功能和機(jī)制，深入研究VISTA 在腫瘤中的作用對抗腫瘤免疫治療具有重要意義［25-26，63-65］。

表2 不同類型腫瘤上VISTA表達(dá)及與患者生存率的關(guān)系Tab.2 VISTA expression in tumors and its relationship with patient survival rate

7.2 VISTA 與自身免疫病 VISTA 對免疫細(xì)胞具有不同功能，包括對T 細(xì)胞的抑制以及對髓細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活作用。VISTA 敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細(xì)胞自發(fā)激活，細(xì)胞因子產(chǎn)生增加（如IFN-γ、TNF-α和IL-17A）以及多種組織慢性炎癥，表明VISTA 途徑受破壞后外周耐受性喪失。但VISTA缺乏并未導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫病，表明其他免疫調(diào)節(jié)途徑可減輕VISTA 缺乏引起的炎癥和自身免疫病發(fā)展［66］。

LIU等［35］鑒別了VISTA敲除、PD-1敲除和VISTA/PD-1雙敲除小鼠的免疫應(yīng)答特征，發(fā)現(xiàn)VISTA/PD-1雙敲除小鼠發(fā)生慢性炎癥和T細(xì)胞自發(fā)性激活反應(yīng)水平明顯高于單敲除小鼠，且在易感背景下更易患自身免疫性疾病，采用VISTA 和PD-L1 特異性單克隆抗體組合阻斷可達(dá)到最佳腫瘤清除效果，表明VISTA和PD-1功能具有非重復(fù)性。

IL-23/IL-17介導(dǎo)的炎癥軸在多種炎癥性疾病和自身免疫性疾?。ㄈ玢y屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和炎癥性腸?。┲衅痍P(guān)鍵作用。IMQ 誘導(dǎo)的銀屑病模型中，VISTA缺乏導(dǎo)致疾病惡化。VISTA-/-DC中TLR7 信號傳導(dǎo)增強(qiáng)導(dǎo)致Erk1/2 和Jnk1/2 過度激活，IL-23 產(chǎn)生增加。IL-23 反過來促進(jìn)TCRγδ+T 細(xì)胞和CD4+Th17細(xì)胞中IL-17A表達(dá)。此外，VISTA 調(diào)節(jié)CD27-γδT 細(xì)胞外周穩(wěn)態(tài)及其在TCR 介導(dǎo)的或細(xì)胞因子介導(dǎo)的活化。CD27-γδT 細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A 在VISTA-/-小鼠中擴(kuò)增并放大了炎癥級聯(lián)反應(yīng)［17］。

WANG 等［10］發(fā)現(xiàn)采用抗VISTA 抗體（13F3）可導(dǎo)致自身免疫性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠中產(chǎn)生IL-17A 的CD4+T細(xì)胞浸潤，加劇疾病進(jìn)展。VISTA-/-小鼠與表達(dá)識別髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白（MOG35-55）TCR 的2D2 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時(shí)，后代更易發(fā)生EAE，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生IFN-γ 和IL-17A 的CD4+T 細(xì)胞增加，表明VISTA 缺乏促進(jìn)Th1/17 介導(dǎo)的自身免疫病發(fā)展。HAN 等［50］發(fā)現(xiàn)VISTA 是狼瘡發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，VISTA-/-BALB/c 小鼠皮膚狼瘡病灶發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid DC，pDC）聚集，且促炎中性粒細(xì)胞是病灶中最豐富的早期免疫浸潤細(xì)胞。VISTA激動劑（MH5A）減少了中性粒細(xì)胞和pDC 的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，包括狼瘡中的關(guān)鍵致病性細(xì)胞因子IFN-α，表明VISTA 可能起抑制自身免疫性炎癥作用，并可能在皮膚和全身性自身免疫性狼瘡中成為治療靶點(diǎn)。

小鼠實(shí)驗(yàn)性哮喘模型中觀察到VISTA 缺失促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞在肺部大量積累，導(dǎo)致先天細(xì)胞因子（IL-6、MCP-1 和TNFα）和Th2 細(xì)胞因子（IL-5 和IL-13）等氣道炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，此外，也抑制哮喘誘導(dǎo)過程中全身和肺部Treg擴(kuò)增。VISTA激動性單克隆抗體（4c11）治療可降低哮喘嚴(yán)重程度，并減輕肺部炎癥［50］。小鼠膠原抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen antibody induced arthritis，CAIA）是由補(bǔ)體受體、趨化因子受體和Fc受體在吞噬細(xì)胞上結(jié)合所驅(qū)動的促炎反應(yīng)，VISTA-/-巨噬細(xì)胞C5R 表達(dá)下降，且免疫復(fù)合物Fc受體反應(yīng)后FcRⅠ、FcRⅡ和FcRⅢ細(xì)胞表面表達(dá)降低，VISTA 敲除或用抗VISTA 單克隆抗體（MH5A 和8G8）治療后小鼠關(guān)節(jié)損傷減輕，并具有更高水平的IL-1 受體拮抗劑（interleukin 1 receptor antagonist，IL1ra），IL-1 受 體 拮 抗 劑 或Anakinra（Kineret）是FDA 批準(zhǔn)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療藥物［27］。因此VISTA 對先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用與疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)，且在自身免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

7.3 VISTA 與 免 疫 排 斥 反 應(yīng) FLIES 等［13］發(fā) 現(xiàn)VISTA 激動性抗體（MH5A）完全可防止aGVHD，減少組織（包括脾臟、肝臟、小腸、肺和腎臟）中浸潤T細(xì)胞數(shù)量，且僅在aGVHD 誘導(dǎo)-1 或0 d 開始治療才有效果，在這之后，激動VISTA 對Agvhd 無治療作用，提出了VISTA 誘導(dǎo)T 細(xì)胞耐受性的兩種不同機(jī)制。首先，通過VISTA 共抑制受體的信號傳導(dǎo)有效阻止了同種反應(yīng)性供體T細(xì)胞在起始階段的活化和擴(kuò)增。其次，供體Treg 被擴(kuò)增以維持長期耐受性和aGVHD 抑制［45］。小鼠同種異體角膜移植模型中，VISTA 抑制性抗體（MIH63）治療的受體小鼠角膜中CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞增加且小鼠存活率降低，可能機(jī)制是VISTA 參與誘導(dǎo)抗原特異性外周耐受，即前房相關(guān)免疫偏離（anterior chamber-associated immune deviation，ACAID），供體特異性ACAID 誘導(dǎo)可促進(jìn)同種異體角膜存活［67］。

8 展望

VISTA 是參與調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活性的免疫檢查點(diǎn)蛋白，在髓細(xì)胞和T細(xì)胞上發(fā)揮不同作用，具有配體和受體雙重功能，是自身免疫病和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，并在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，但在人類腫瘤中的具體作用還需進(jìn)一步研究。

PSGL-1 作為新發(fā)現(xiàn)的VISTA 受體，具有重要研究價(jià)值。PSGL-1 在介導(dǎo)白細(xì)胞滾動和遷移過程中具有重要作用，同時(shí)也被認(rèn)為是免疫檢查點(diǎn)，且與VISTA有多種相似之處。PSGL-1在T細(xì)胞和造血細(xì)胞上表達(dá)，但在B細(xì)胞上低表達(dá)，且可抑制TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制T細(xì)胞增殖分化以及效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)DC 誘導(dǎo)的Treg 產(chǎn)生，還可通過翻譯后進(jìn)一步修飾調(diào)節(jié)T 細(xì)胞歸巢［68］。由于PSGL-1 和VISTA 在酸性條件下結(jié)合，推測VISTA 與PSGL-1結(jié)合可能促進(jìn)Treg、巨噬細(xì)胞、MDSC 募集至TME，但需進(jìn)一步研究證實(shí)。ELTANBOULY 等［69］認(rèn)為這兩種蛋白可能在同一細(xì)胞上相互作用形成異二聚體，并在某些情況下可能是共同信號傳遞所必需的。

進(jìn)一步研究VISTA 受體和配體的作用機(jī)制以及VISTA的晶體結(jié)構(gòu)有助于開發(fā)VISTA小分子抑制劑和激動劑或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的抑制劑或激動劑。研究VISTA 在先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中作用的分子機(jī)制具有重要意義，采用增強(qiáng)或抑制先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抗VISTA 抗體是治療癌癥和炎癥疾病重要策略之一。