利多卡因通過PI3K/Akt途徑抑制人口腔癌細(xì)胞HN13增殖并促進(jìn)其凋亡①

常冰梅 肖瑞琳 趙 虹 楊小慶 張 棟 王麗麗

（山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，太原 030001）

口腔癌是指發(fā)生于口腔的惡性腫瘤，其病理分型以鱗狀細(xì)胞癌最為多見，按發(fā)生部位分為舌癌、牙齦癌、頰癌、腭癌、上下頜骨癌、唇癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌和上頜竇癌以及發(fā)生于顏面部皮膚的癌癥［1-2］?？谇话轭^頸部較為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤發(fā)病率的5%，我國口腔癌發(fā)病率為3.6/10 萬～8.0/10 萬，已居全身惡性腫瘤發(fā)病率第10 位［3］?？谇话┚哂胁〕踢M(jìn)展快、腫瘤浸潤廣、預(yù)后差等特點，對人類生命健康造成極大威脅。

近年局部麻醉藥抗腫瘤的作用及機(jī)制逐漸受到重視。已有研究表明，局部麻醉藥能夠影響部分腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移、癌基因表觀修飾等行為［4-5］。臨床上利多卡因和其他局部麻醉劑可用于緩解腫瘤患者來自口腔或直腸的癌癥疼痛，目前認(rèn)為其在口腔使用局部麻醉劑緩解癌痛的同時可抑制口腔癌細(xì)胞擴(kuò)散，其機(jī)制可能為利多卡因通過抑制酪氨酸激酶受體EGFR 活性途徑抑制凋亡［6］。但不同局部麻醉藥對不同惡性腫瘤的抗腫瘤作用效果有所不同。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt 信號通路對細(xì)胞增殖、分化、凋亡都起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，大量數(shù)據(jù)表明該通路在多種腫瘤細(xì)胞中呈過度激活狀態(tài)，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)［7］。基于此，本文就利多卡因在抑制人口腔鱗癌細(xì)胞增殖及機(jī)制方面進(jìn)行了進(jìn)一步研究，以期為利多卡因在口腔腫瘤的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人口腔鱗細(xì)胞HN13（Cellbio 公司）；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco 公司）；10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物材料有限公司）；順鉑注射液（云南植物藥業(yè)有限公司）；利多卡因注射液（四環(huán)藥業(yè)）；FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司）；CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗人p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、GAPDH一抗（Cell Signaling公司）；過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 及eECL 高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒（博士德生物公司）；GELDOC XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 采用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)癌細(xì)胞株HN13，其中含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉 素、100 U/ml 鏈 霉 素，pH=7.2～7.4，于5%CO2、37 ℃、90%相對濕度下培養(yǎng)。每2 d 換液1 次，保持細(xì)胞正常生長，常規(guī)消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞1×105個/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。參照文獻(xiàn)和細(xì)胞學(xué)預(yù)實驗結(jié)果選取藥物濃度及分組，實驗細(xì)胞分為5組：①陰性對照組（NC），以無血清DMEM為對照；②陽性對照組（PC）：終濃度100 μmol/L 順鉑；③低濃度組：終濃度40 μmol/L利多卡因；④中濃度組：終濃度400 μmol/L利多卡因；⑤高濃度組：終濃度4 000 μmol/L 利多卡因。以上各組均在無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6 h［8-9］。

1.2.3 不同濃度利多卡因?qū)?xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞處理6 h 后，常規(guī)消化細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)，按照1×104個/100 μl 將細(xì)胞接種于96 孔板。加入DMDM 培養(yǎng)液，10%胎牛血清，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液至96 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，于入射光波長450 nm處測定吸光度，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 按1.2.3 方法培養(yǎng)的各組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，PBS沖洗細(xì)胞2次，再將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，收集至10 ml 離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer。加入10 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI，充分混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢 測p-PI3K、p-Akt，Bcl-2 表達(dá) 將1.2.3培養(yǎng)的各組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后分別收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參。BCA定量分別得出樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，調(diào)整蛋白上樣濃度一致，行SDS-PAGE 電泳（110 V，2 h），隨后按1.5 A/cm2選擇恒流半干式轉(zhuǎn)膜2～2.5 h。將PVDF 膜浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST 中，小搖床中封閉1 h 后，加一抗4 ℃孵育過夜，按說明書比例室溫孵育二抗2 h，隨后用凝膠成像儀進(jìn)行發(fā)光并記錄灰度值，蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度利多卡因?qū)?xì)胞增殖的影響 隨著利多卡因藥物濃度增大，細(xì)胞OD 值呈下降趨勢，與對照組相比，利多卡因400 μmol/L、4 000 μmol/L 處理組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），利多卡因40 μmol/L處理組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與順鉑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖1）。利多卡因中、高濃度組細(xì)胞增殖能力降低。

圖1 不同濃度利多卡因作用下細(xì)胞A值變化Fig.1 Absorbtance value changes of cells in different doses of lidocaine groups

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 為進(jìn)一步檢測利多卡因?qū)?xì)胞凋亡的作用效果，采用流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行具體分析。利多卡因400 μmol/L、4 000 μmol/L處理組與對照組相比凋亡率升高（P<0.05）；利多卡因40 μmol/L、400 μmol/L 處理組與順鉑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表1、圖2）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡Fig.2 Detection of cell apoptosis by FCM

表1 各組細(xì)胞凋亡率（±s）Tab.1 Apoptosis rates in each group（±s）

表1 各組細(xì)胞凋亡率（±s）Tab.1 Apoptosis rates in each group（±s）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with PC group，2）P<0.05.

Apoptosis rate/%9.63±1.52 42.51±1.18 11.35±2.022）17.00±2.021）2）38.25±1.181）Groups NC PC Lidocaine low dose（40 μmol/L）Lidocaine medium dose（400 μmol/L）Lidocaine high dose（4 000 μmol/L）

2.3 不同劑量利多卡因?qū)Φ鞍妆磉_(dá)影響 采用Western blot 檢測各組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 蛋白表達(dá)變化，與對照組相比，利多卡因低、中、高劑量組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 表達(dá)降低（P<0.05），且呈劑量依賴性（P<0.05）。利多卡因低、中劑量組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 表達(dá)高于順鉑組（P<0.05）；利多卡因高劑量組p-Akt 表達(dá)高于順鉑組（P<0.05）；利多卡因高劑量組p-PI3K、Bcl-2表達(dá)與順鉑組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖3。

圖3 不同劑量利多卡因?qū)Φ鞍妆磉_(dá)影響Fig.3 Effects of different doses of lidocaine on proteins expressions

3 討論

利多卡因?qū)儆诮?jīng)典的酰胺類麻醉藥，臨床常用于黏膜麻醉、局部皮膚及區(qū)域神經(jīng)阻滯，并有抗炎、抗菌等特殊作用［10-11］。在口腔科各類診療技術(shù)中應(yīng)用非常普遍，主要用于牙體牙髓病、齦下刮治術(shù)、三叉神經(jīng)痛等封閉麻醉以及與其他藥物組成復(fù)方用于口腔潰瘍、口腔黏膜炎、口腔單純皰疹治療，療效顯著［12-13］。近年隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，研究者逐漸認(rèn)識到圍術(shù)期應(yīng)用不同麻醉藥物對腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、生存期也存在一定影響，且發(fā)現(xiàn)利多卡因這一低細(xì)胞毒性、傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)藥物在腫瘤治療、預(yù)防方面具有較好的應(yīng)用前景［14］。

腫瘤細(xì)胞增殖失控是導(dǎo)致腫瘤患者病程進(jìn)展惡化的主要原因，嚴(yán)重威脅腫瘤患者生命。抑制腫瘤細(xì)胞迅速增殖是一種有效的抗腫瘤方式，日本學(xué)者SAKAGUCHI 等［6］發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制人類舌癌細(xì)胞株CA127 增殖。該項研究采用利多卡因處理高表達(dá)表皮生長因子受體的人舌癌細(xì)胞株CA127，證實利多卡因通過抑制EGFR 酪氨酸激酶途徑發(fā)揮抗人舌癌細(xì)胞增殖作用。本研究證實利多卡因?qū)谇击[癌有增殖抑制作用，為局麻藥利多卡因用于口腔腫瘤治療提供了實驗依據(jù)。

除抑制腫瘤細(xì)胞增殖外，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡也是治療腫瘤的有效策略。目前研究證實利多卡因體外抗腫瘤作用可通過多種途徑促進(jìn)其凋亡［15］。以上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑包括去內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、甲基化途徑、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑、類肝素結(jié)合樣表皮生長因子（HB-EGF）途徑以及其他非死亡受體途徑等。其中PI3K/Akt 信號通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞中起抗凋亡、促進(jìn)增殖、生存的重要調(diào)控作用。該通路在多種腫瘤細(xì)胞中均呈過度激活狀態(tài)，其過度激活與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、遷移密切相關(guān)。P13K 家族參與的眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，P13K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，當(dāng)胞外信號與受體酪氨酸激酶或G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后將PI3K 募集到細(xì)胞膜，激活PI3K，PI3K 后可磷酸化膜磷脂磷脂酰肌醇PI肌醇環(huán)的第3位碳原子參與多種PI 中間體磷酸化，如產(chǎn)生PIP3。PIP3 與細(xì)胞內(nèi)含有PH 結(jié) 構(gòu) 域 的 信 號 蛋 白PDK1（phosphoinositide de?pendent kinase-1）和Akt 結(jié)合，促使PDK1 磷酸化Akt而活化Akt。Akt又稱PKB，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶是PI3K最重要的下游分子。Akt分子上有位于CAT（central kinase catalytic）結(jié)構(gòu)域T308 和調(diào)節(jié)性疏水結(jié)構(gòu)域的S473 2 個磷酸化位點，發(fā)生磷酸化后Akt被完全激活。激活后Akt轉(zhuǎn)位到細(xì)胞漿或細(xì)胞核通過改變下游分子磷酸化水平調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。PI3K活化的Akt能夠作用于其下游關(guān)鍵的凋亡蛋白，如凋亡Bcl-2家族成員BAD、mTOR、eNOS、NF-κB、FOXO、MDM2、CREB、caspase-9 等下游底物分子，發(fā)揮其抗凋亡、促生存的生物學(xué)效應(yīng)［16-18］。本研究證實利多卡因可通過抑制PI3K/Akt 途徑，抑制Bcl-2 等抗凋亡蛋白表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)凋亡作用。細(xì)胞內(nèi)的各種信號通路并不是單一存在的，而是相互交叉形成網(wǎng)絡(luò)，PI3K/Akt僅是這些通路中的中心位點之一，還可被EGFR、ras、IRS1、JAK、FAK、c-met 等多種上游分子激活。利多卡因所表現(xiàn)出的抗腫瘤療效仍是值得肯定的，所涉及的凋亡途徑眾多，有待進(jìn)一步研究。

總之，常用藥利多卡因在腫瘤外科并與化療、放療、生物治療聯(lián)合應(yīng)用，在增效減毒、降低圍手術(shù)期應(yīng)激、減少多因素致腫瘤擴(kuò)散等方面具有重要應(yīng)用前景。近年關(guān)于在臨床圍術(shù)期應(yīng)用利多卡因降低腫瘤復(fù)發(fā)率及總體死亡率多有報道，為傳統(tǒng)麻醉藥利多卡因用于腫瘤治療提供了更多新的依據(jù)，但利多卡因在抗腫瘤方面涉及的分子機(jī)制有待深入研究［19-20］。