SSR 標(biāo)記熒光毛細(xì)管電泳在種子檢測中常見問題分析

李巧英

（山西省種業(yè)發(fā)展中心，太原 030006）

分子標(biāo)記技術(shù)是近年來發(fā)展較快的基因檢測技術(shù)，隨著新標(biāo)記方法的開發(fā)和試驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，在基因水平上檢測農(nóng)作物種子信息逐漸成為監(jiān)控種子質(zhì)量的一個(gè)重要手段。由于分子標(biāo)記法不受自然條件和表現(xiàn)性狀的約束，實(shí)現(xiàn)了種子品種遺傳信息室內(nèi)快速檢測，受到大家的青睞。SSR 作為第2 代分子標(biāo)記方法，是一種共顯性標(biāo)記，具有重復(fù)性好、等位變異多、數(shù)據(jù)分析簡便、易操作等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測中被廣泛使用。

熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)將熒光檢測的高靈敏度和毛細(xì)管電泳的高效性結(jié)合，利用電泳和電滲流的電動(dòng)力學(xué)原理，在毛細(xì)管中灌滿膠分離PCR 產(chǎn)物，檢測熒光信號，數(shù)據(jù)軟件分析系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)化成峰圖，顯示試驗(yàn)結(jié)果。該技術(shù)自動(dòng)化程度高，檢測通量高，試驗(yàn)操作簡單，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)程序化，避免人為估算的主觀性，結(jié)果精確到1bp[1]，直接顯示擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小，實(shí)現(xiàn)了指紋圖譜與堿基序列長短之間的對應(yīng)轉(zhuǎn)換，易于實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對，常用GeneMapper和GeneMarker 分析SSR 擴(kuò)增片段[2]。本文就試驗(yàn)中遇到的熒光信號強(qiáng)度、特異峰型的統(tǒng)計(jì)分析以及毛細(xì)管電泳儀運(yùn)行和維護(hù)、試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對等問題進(jìn)行分析，為SSR 分子標(biāo)記熒光毛細(xì)管電泳檢測農(nóng)作物種子質(zhì)量試驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

1 均一熒光信號采集的保證

SSR 分子標(biāo)記熒光毛細(xì)管電泳采集熒光信號作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，嚴(yán)格要求模板DNA 濃度和擴(kuò)增體系的配置比例，避免不同樣品孔間熒光信號強(qiáng)弱差異大帶來干擾。擴(kuò)增前將模板DNA 原液稀釋至濃度一致；擴(kuò)增體系按照引物、模板、酶最佳配比設(shè)置。優(yōu)質(zhì)的DNA 和完美的擴(kuò)增體系結(jié)合可以打造一套高質(zhì)量的品種信息指紋圖譜，獲得準(zhǔn)確可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

電泳過程中，為確保采集到的熒光信號真實(shí)可信，要求擴(kuò)增板每個(gè)樣品孔內(nèi)PCR 產(chǎn)物獨(dú)立有效，封口的膜和封膜技術(shù)是關(guān)鍵。封板膜要求均勻透光，有一定的韌性，電泳儀能清晰獲取熒光信號，且膜將樣品孔密封，形成互不干擾的PCR 微循環(huán)環(huán)境。通常采用熱封或激光封膜，防止PCR 產(chǎn)物蒸發(fā)損失和樣品間的交叉污染，保證PCR 產(chǎn)物的獨(dú)特屬性和檢測結(jié)果準(zhǔn)確有效。

2 特異峰型的統(tǒng)計(jì)分析規(guī)律

電泳結(jié)束，分析軟件將檢測結(jié)果繪制成峰圖展示出來，統(tǒng)計(jì)分析各位點(diǎn)的特異峰，自動(dòng)過濾非特異峰。理想的特異峰（圖1a 左）為獨(dú)立的單峰，峰型尖銳鋒利，周圍有若干小峰；非特異峰（圖1a 右）偏矮胖，峰較低，不作統(tǒng)計(jì)。實(shí)際檢測中會遇到不同的峰型，有連續(xù)峰（圖1b）、高低峰（圖1c）、n+1 峰（圖1d）、多峰（圖1e，f）、pull-up 峰[2-3]等情況。連續(xù)峰（圖1b）多由幾個(gè)相差2bp 的峰群組成，以較高的峰或最右邊的峰大小為試驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)為單峰，避免識別為多峰；遇到高低峰（圖1c）時(shí)，通常讀取較高峰的數(shù)值，或比對數(shù)據(jù)庫中參照樣品峰型的統(tǒng)計(jì)規(guī)律；n+1 峰（圖1d）在試驗(yàn)中比較常見，即同一位置出現(xiàn)2 個(gè)峰，相差1bp，作為單峰計(jì)算，識別較高峰的數(shù)值；多峰（圖1e，f）在混樣檢測時(shí)出現(xiàn)，首先要確定是由于樣品混雜引起的多峰，還是此品種在該位點(diǎn)的特異屬性，需要采用單粒提取DNA，重新擴(kuò)增，證實(shí)多峰的屬性，當(dāng)多峰為特異峰時(shí)識別最高的峰。pull-up 峰是一種干擾峰，在多重?zé)晒怆娪緯r(shí)，由于某色熒光引物的特異峰在某個(gè)位置較高，把這個(gè)位置其他色熒光引物的峰連帶升高而產(chǎn)生，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)剔除。

圖1 熒光毛細(xì)管電泳峰圖類型

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與指紋數(shù)據(jù)庫比對

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，先分析分子量內(nèi)標(biāo)（LIZ）、參照樣品和空白對照的峰型，LIZ 峰型準(zhǔn)確，參照樣品數(shù)據(jù)與指紋數(shù)據(jù)庫一致，空白對照中無明顯的特異峰，則表明試驗(yàn)準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)可采納。試驗(yàn)中可選擇合適的LIZ，用LIZ校正等位基因峰值，SSR分子標(biāo)記屬于短串聯(lián)重復(fù)，DNA 片段較短，如玉米種子真實(shí)性檢測SSR 分子標(biāo)記等位基因位于100～430bp 之間[4]，可選用LIZ500 作為分子量對照。參照樣品一般選擇常見的指紋穩(wěn)定且具有特異峰型的品種，設(shè)置參照樣品用于校正不同試驗(yàn)批次的指紋數(shù)據(jù)，提取有效峰值并將數(shù)據(jù)整合標(biāo)準(zhǔn)化?？瞻讓φ沼糜跈z測試劑耗材和試驗(yàn)環(huán)境是否被污染，以確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)與指紋數(shù)據(jù)庫比對時(shí)，需要比較特異峰的位置及峰型。參照樣品的峰圖與指紋數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)吻合，待測樣品與參照樣品采用統(tǒng)一的讀數(shù)規(guī)則計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)整理后，上傳指紋數(shù)據(jù)庫比對[5]。同名品種比較，確認(rèn)待測樣品品種的真實(shí)性；與全庫品種比較，識別待測樣品的身份，比對過程中，個(gè)別差異位點(diǎn)需要人工確認(rèn)。

4 毛細(xì)管電泳儀的運(yùn)行與維護(hù)

毛細(xì)管電泳儀的運(yùn)行環(huán)境溫度適宜保持在24±2℃，室溫太高毛細(xì)管內(nèi)溫度升高，會使溶液黏度下降，電滲速度增大；室溫太低，加溫爐升溫慢，影響電泳速率和分離效果，適宜的檢測溫度可保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。電極槽倒入緩沖液，兩極插入緩沖液中，電泳通路保持濕潤，如果干燥，會導(dǎo)致毛細(xì)管堵塞，影響電泳。儀器運(yùn)行時(shí)各級連接口密封，避免進(jìn)入空氣，氣泡會阻斷電流，產(chǎn)生放電，損壞密閉的電泳通路，如有氣泡，用凝膠把系統(tǒng)中的氣泡排出。進(jìn)樣前經(jīng)專用洗液清洗毛細(xì)管和連接管路，保證電泳通道暢通。正式電泳時(shí)，毛細(xì)管進(jìn)口端連接凝膠，用新膠灌注毛細(xì)管，暫時(shí)不用時(shí)可以用清洗液浸沒凝膠入口。

5 小結(jié)

SSR 分子標(biāo)記熒光毛細(xì)管電泳檢測方法在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測中的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了快速高效檢測，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，解放了人力，減少了人員誤差，并且試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，精確度高[6]，可以單獨(dú)檢測待測樣品，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對。綜上所述，解決好試驗(yàn)中遇到的問題，能夠大大提高檢測效率，適應(yīng)當(dāng)前種子市場管理的需要，為農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)測提供一個(gè)可靠的檢測平臺。