菠蘿蜜果實(shí)PG基因的克隆與表達(dá)分析

陳杰　黃舒怡　李真琴　廖倩賢　宋康華　洪克前　王俊寧

摘? 要：為明確PG基因在菠蘿蜜果實(shí)后熟軟化過程中的作用，本研究以‘海大2號(hào)’菠蘿蜜果實(shí)為材料，采用0.5?mg/L 1-MCP和1000 mg/L ETH處理，研究了室溫（20℃）條件下果實(shí)成熟過程中硬度和果膠的動(dòng)態(tài)變化，克隆獲得4個(gè)PG基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)分析。結(jié)果表明：隨著菠蘿蜜果實(shí)的成熟，果肉硬度快速下降，可溶性果膠和離子型果膠不斷增加，共價(jià)態(tài)果膠有所下降;ETH處理促進(jìn)了果實(shí)WSP和ISP含量的上升，加速了軟化進(jìn)程，1-MCP處理抑制了貯藏前期果肉硬度的下降，推遲了軟化進(jìn)程，但明顯提高了3種果膠的含量?！虻拈_放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度1221～1434?bp，編碼406～477個(gè)氨基酸。AhePG1蛋白含有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（Ⅰ～Ⅳ），AhePG2和AhePG3只含結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ，AhePG4缺失結(jié)構(gòu)域Ⅲ;AhePG基因分別與桃（AF095577.1）、菜豆（XM_007162208.1）、葎草（MN971583.1）、菜豆（XM_007151391.1）PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系較近，相似度分別達(dá)75.63%、73.11%、79.71%、70.75%。qRT-PCR分析結(jié)果顯示：基因在果實(shí)成熟前期表達(dá)量低，在后期高表達(dá)，而基因的表達(dá)量在果實(shí)成熟過程中總體較低。ETH處理抑制了基因的表達(dá)量，而1-MCP處理延緩了4個(gè)AhePG基因表達(dá)量的增加，但增加了成熟后期基因的表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，果肉硬度與水溶性果膠含量和基因表達(dá)呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)，而水溶性果膠含量又與基因表達(dá)呈顯著正相關(guān)。本研究說明，菠蘿蜜果實(shí)的軟化與果膠降解有關(guān)，可能是菠蘿蜜果實(shí)果膠降解和果實(shí)軟化的關(guān)鍵PG基因之一，控制著果實(shí)成熟后期的軟化;1-MCP處理能延緩菠蘿蜜果實(shí)的成熟，但并不影響果實(shí)后期成熟時(shí)的軟化，基因可能對(duì)其軟化均有作用。

關(guān)鍵詞：菠蘿蜜;AhePG基因;克隆;基因表達(dá);果實(shí)軟化中圖分類號(hào)：S571.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Expression Analysis of PG Gene in Jackfruit

CHEN JieHUANG ShuyiLI ZhenqinLIAO QianxianSONG KanghuaHONG KeqianWANG Junning

To clarify the role of PG gene in the process of jackfruit ripening and softening， using ‘Haida 2’ jackfruit as the material， the dynamic changes of the hardness and pectin were studied at room temperature （20℃） during the ripening of the fruits treated with 0.5?mg/L 1-MCP and 1000?mg/L ETH， four polygalacturonase genes from ‘Haida 2’ fruits were cloned， and the bio-informatics and expression were analyzed . The results showed that with the ripening of the fruit， the firmness of the pulp droped rapidly， the soluble pectin and ionic pectin continued to increase， and the covalent pectin decreased. ETH treatment promoted the increase in WSP and ISP content and accelerated the process of fruit softening. 1-MCP treatment inhibited the decrease of pulp firmness in the early stage of fruit storage， delayed the process of fruit softening， but significantly increased the content of three types of pectins. The length of the open reading frames （ORF） of ～ genes were 1221?1434bp， encoding 406?477 amino acids. AhePG1 protein contained four conserved domains （I-IV）， AhePG2、AhePG3 only contained domains I and II， and AhePG4 lacked domain III. The relationship among amino acid sequences encoded by AhePG genes and PG genes from peach （AF095577.1）， （XM_007162208.1）， （MN971583.1）， and （XM_007151391.1） was close， with similarities of 75.63%， 73.11%， 79.71% and 70.75%， respectively. The results of qRT-PCR analysis showed that the expression level of gene was low in the early stage and high in the later stage of fruit ripening. The expression level of genes was generally lower. ETH treatment inhibited the expression of gene， while 1-MCP treatment delayed the increase of four AhePGs expression， but increased the expression of ， and genes in the late stage of maturity. The result of correlation analysis showed that pulp firmness had a significant and very significant negative correlation with water-soluble pectin content and gene expression， and water-soluble pectin content had a significant positive correlation with gene expression. It showed that the softening of jackfruit fruit was related to the degradation of pectin， and maight be one of the key PG genes in jackfruit fruit pectin degradation and fruit softening， which controlling the softening of the fruit at the later stage of maturity.1-MCP treatment could delay the ripening of jackfruit fruit， but did not affect the softening of the fruit during the later ripening period， which meight be affected by AhePG genes.

jackfruit; AhePG genes; cloning; gene expression; fruit softening

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.002

果膠是由不同酯化程度的D-半乳糖醛酸以α-1、4-糖苷鍵聚合而成的多糖，是植物細(xì)胞初生壁和胞間層的主要成分，其存在形式和含量對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度有重要影響。在未成熟果實(shí)中，不溶性的原果膠與纖維素等物質(zhì)緊密結(jié)合，并將相鄰細(xì)胞粘連在一起，賦予果實(shí)一定的脆硬度。隨著果實(shí)的成熟，原果膠逐漸降解為可溶性果膠，細(xì)胞間粘附力減弱，胞間層和初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，果實(shí)質(zhì)地變軟。果膠根據(jù)其溶解度可分為可溶性果膠（water soluble pectin， WSP）、共價(jià)結(jié)合果膠（covalent binding pectin， CSP）和離子結(jié)合果膠（ionic soluble pectin， ISP）。高滋藝等發(fā)現(xiàn)，脆性好的成熟蘋果中WSP含量較高，硬度低的品種中ISP含量較高，說明ISP與WSP含量的差異與果實(shí)的質(zhì)地有關(guān)。柿果實(shí)采收時(shí)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，3 d后細(xì)胞壁中膠層溶解，初生壁也發(fā)生局部降解，同時(shí)原果膠含量迅速下降，水溶性果膠含量迅速上升。在梨、木棗和冬棗成熟過程中也伴隨著果膠物質(zhì)的降解。

多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase， PG）是一種能催化果膠降解的細(xì)胞壁水解酶，參與果實(shí)的成熟軟化，這在蘋果、梨、桃、番茄、草莓、杧果等果實(shí)中得到了證實(shí)。如水蜜桃成熟之前PG酶活性很低，果實(shí)較硬，隨著果實(shí)的成熟，PG酶活性和水溶性果膠含量增加，果實(shí)硬度下降，其中PG酶活性與果實(shí)硬度呈負(fù)相關(guān)。PG是一類由多基因家族編碼的蛋白，目前已從擬南芥、水稻、白菜、蘋果、桃、棗、杧果的基因組中分別鑒定出了66、44、99、85、84、41、51個(gè)PG基因成員。PG基因進(jìn)化關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，依據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可將PG聚類為不同的亞類。在擬南芥、杧果、棗上，可將PG基因分成A～F 6個(gè)亞類，而在蘋果、桃、白菜上，PG基因被分成A～G 7個(gè)亞類。不同亞類的PG基因在表達(dá)模式上存在差異，其中一些亞類成員趨向于在生殖器官中表達(dá)，另一些則趨向于在營養(yǎng)組織中表達(dá)，這預(yù)示著不同亞類的PG可能有其獨(dú)特的生物學(xué)功能。

菠蘿蜜（ Lam.）是典型的呼吸躍變果實(shí)，在果實(shí)的成熟過程中有明顯的后熟軟化現(xiàn)象，果實(shí)中的原果膠和纖維素逐漸被降解，可溶性果膠和可溶性的糖不斷增加，細(xì)胞中的淀粉粒逐漸消失，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得松散，果肉逐漸變軟。劉光財(cái)研究發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)α-淀粉酶和4個(gè)β-淀粉酶基因參與了菠蘿蜜果實(shí)后熟過程中淀粉的降解。董黎梨等發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶在濕苞菠蘿蜜果實(shí)的成熟過程中呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，說明它與菠蘿蜜果實(shí)的成熟軟化有關(guān)。許多研究表明，PG參與了多種果實(shí)的成熟軟化，但在菠蘿蜜果實(shí)的成熟軟化中研究較少。鑒于此，本研究以‘海大2號(hào)’菠蘿蜜果實(shí)為研究材料，克隆并結(jié)合不同采后處理研究了菠蘿蜜PG基因在貯藏期間的表達(dá)特性，以期揭示菠蘿蜜PG基因在其果實(shí)后熟軟化過程中的作用，并為采取適宜措施延長(zhǎng)菠蘿蜜果實(shí)的貨架期提供理論依據(jù)。

? 材料與方法

?材料

供試材料為‘海大2號(hào)’干苞型菠蘿蜜品種果實(shí)，采自廉江市石頭嶺鎮(zhèn)某農(nóng)戶果園。在果實(shí)盛花期掛牌，花后約150?d采收。果實(shí)采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，選擇成熟度和大小一致、無病蟲傷的果實(shí)，分為3組，分別進(jìn)行1000?mg/L ETH溶液浸泡和0.5?mg/L 1-MCP熏蒸處理，具體操作參照王俊寧等的方法，以未經(jīng)處理的果實(shí)為對(duì)照（CK）。處理后將3組材料均放在22℃、90%的相對(duì)濕度條件下自然成熟。因不同處理果實(shí)成熟進(jìn)程不同，采用不同間隔時(shí)間取樣：對(duì)照（CK）每天取樣;ETH處理每0.5 d取樣;1-MCP處理在第0、4、8、10、12、14、16天取樣。每次取3～5個(gè)果，將果肉分離出來并切成小塊，混勻，液氮速凍后，存于?80℃超低溫冰箱中備用。

方法

1.2.1 ?果肉硬度測(cè)定? 每個(gè)果任取10個(gè)果苞，用刀片從側(cè)面劃開，去除種子，用FTC TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀（美國）進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)果苞測(cè)定2次，取平均值。質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定的條件：Test Speed：60?mm/s，Trigger Force：0.5?N，探頭選擇：直徑5?mm。

1.2.2? 果膠的提取和測(cè)定? 果膠的提?。喝??g菠蘿蜜果肉，加5?mL 80%乙醇煮20 min，冷卻后8000 r/min離心10 min，棄上清，然后使用20?mL 80%乙醇和丙酮分別重新離心洗2遍，得到粗細(xì)胞壁，然后在45℃干燥，稱重即得細(xì)胞壁物質(zhì)含量。稱取烘干的細(xì)胞壁物質(zhì)50?mg，按以下步驟依次提取不同成分：用10 mL 50 mmo1/L的乙酸鈉（pH 6.5）提取得到WSP;用10?mL 50 mmol/L EDTA和乙酸鈉（pH 6.5）提取離心得到ISP;用10 mL 50?mmo1/L的NaCO（含2?mmol/L EDTA）提取得到CSP。果膠的測(cè)定：采用咔唑比色法，以每克新鮮組織中含有半乳糖醛酸的毫克數(shù)來表示（mg/g）。

1.2.3? 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄? 采用Plant Kit超快型植物RNA提取試劑盒（華越洋）提取菠蘿蜜果肉總RNA。以提取的RNA為模板，采用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2.4? PCR引物設(shè)計(jì)及合成? ～基因的全長(zhǎng)cDNA引物采用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。

1.2.5? PG基因的cDNA克隆與表達(dá)分析 ?以‘海大2號(hào)’菠蘿蜜果實(shí)的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的片段經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化后，陽性克隆檢測(cè)測(cè)序，得到～基因的全長(zhǎng)序列。

選用為內(nèi)參基因，根據(jù)～ 基因的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)熒光定量引物（表2）。qPCR擴(kuò)增程序如下：94℃，1 min;94℃，5?s，55℃，30?s，72℃，30?s，39個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6? 生物信息學(xué)分析? 使用在線軟件ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)菠蘿蜜PG編碼蛋白的基本理化性質(zhì);用在線軟件SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1. softberry.com/berry.phtml）進(jìn)行其亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);用NetPhos 3.1 Server和DictyOGlyc 1.1 Server軟件進(jìn)行NAC編碼蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè);用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)PG編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);運(yùn)用在線軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page）構(gòu)建其蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;在TAIR數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥PG蛋白全長(zhǎng)序列;用軟件Clustalx和GENEDOC進(jìn)行不同物種PG氨基酸多重匹配分析;在軟件MEGA7.0上使用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用Pfam 34.0（http：//pfam.xfam. org/）數(shù)據(jù)庫分析菠蘿蜜PG蛋白保守區(qū)域，利用MEME軟件分析其保守基序。

數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin Lab Origin 2019軟件制作圖表。

?結(jié)果與分析

?不同處理菠蘿蜜果實(shí)硬度的影響

果實(shí)硬度是衡量菠蘿蜜果實(shí)后熟程度的重要

標(biāo)準(zhǔn)，采摘時(shí)果肉質(zhì)地較硬，為（13.78±0.50）kg/cm（圖1）。正常后熟的菠蘿蜜果實(shí)前2?d硬度變化較小，第3～4天果實(shí)快速軟化，之后4?d果實(shí)軟化速率減緩;ETH處理加速了果實(shí)的軟化，并提高了果肉軟化速率，處理后的果肉迅速軟化，第2.5天果肉硬度已接近最低值[（6.91±0.55）kg/cm];1-MCP處理減緩了果實(shí)軟化速率，前9?d果實(shí)硬度僅降低8.49%，為（12.61±0.52）kg/cm，之后開始加速軟化，12?d后果肉硬度降至（4.50±0.12）kg/cm。

?不同處理對(duì)菠蘿蜜果實(shí)、、的影響

如圖2所示，自然成熟的菠蘿蜜果實(shí)WSP含量隨著成熟度的進(jìn)程不斷增加;ETH處理加速了WSP含量的增加，在貯藏0.5?d時(shí)就達(dá)到最大[（6.06±0.07）mg/g]，然后迅速回落，之后變化不大;1-MCP處理之后果實(shí)的WSP含量迅速增加并維持較高的水平，在整個(gè)貯藏期間遠(yuǎn)高于對(duì)照和ETH處理。ISP含量也隨著果實(shí)的成熟不斷增加，ETH和1-MCP處理均增加了貯藏期間果實(shí)的ISP含量。CSP含量在自然成熟的前2?d略有下降，之后開始增加，于貯藏第4天達(dá)到高峰;ETH處理在貯藏第1天下降到最低后開始增加;而1-MCP處理的CSP含量則是在貯藏第10天出現(xiàn)高峰后開始下降。

?菠蘿蜜的克隆和生物信息學(xué)分析

從菠蘿蜜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組庫中，挑選到4個(gè)PG基因的序列，分別命名為，經(jīng)過一系列PCR擴(kuò)增和測(cè)序后，最終獲得它們的全長(zhǎng)cDNA序列，分別為1221、1416、1371、1434 bp。采用生物信息學(xué)在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，基因分別編碼406、471、456、477個(gè)氨基酸，分子量分別為52.27、42.55、51.95、49.00?kDa;在AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4蛋白的氨基酸組成中，甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser）含量最高，其次含量較高的AhePG3/4為亮氨酸（Leu），AhePG1和AhePG2分別為丙氨酸（Ala）和纈氨酸（Val）;AhePG1和AhePG4編碼蛋白屬于穩(wěn)定性的堿性蛋白，AhePG2為不穩(wěn)定的堿性蛋白，而AhePG3為不穩(wěn)定的酸性蛋白;AhePG2、AhePG3、AhePG4為疏水性蛋白，而AhePG1為親水性蛋白（表3）。

利用SoftBerry ProtComp 9.0軟件對(duì)4個(gè)PG蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，AhePG1蛋白定位在胞外上、AhePG3、AhePG4蛋白均定位在質(zhì)膜上的分值最高（共10分：數(shù)值越高表示可信度越大）（表4），說明AhePG1蛋白可能定位于胞外，AhePG3、AhePG4蛋白可能定位于質(zhì)膜上;而AhePG2蛋白定位在胞外、過氧化物酶體、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等部位的分值差異不大，它可能在胞外、過氧化物酶體、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等部位均有分布。

糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，AhePG1、AhePG2、AhePG3蛋白分別在第223、47和230個(gè)氨基酸的位置均有1個(gè)絲氨酸Ser的糖基化位點(diǎn)，而AhePG4蛋白無糖基化位點(diǎn)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4蛋白分別含有46、45、48和47個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種磷酸化位點(diǎn)（表5），其中，絲氨酸被磷酸化的位點(diǎn)數(shù)目多，分布均勻集中，而酪氨酸被磷酸化的位點(diǎn)分布相對(duì)稀少。PHD軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)PG蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲和延伸鏈?zhǔn)撬鼈兊闹饕M分，延伸鏈均勻分布在整條肽鏈，α-螺旋含量較少，且集中在N端（AhePG4除外，它的N端和C端具有α-螺旋）（表5），這一點(diǎn)在其三維結(jié)構(gòu)上得到了印證（圖3）。

通過NCBI進(jìn)行序列比對(duì)分析，將AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4氨基酸序列與GenBank中登錄的桃、歐洲李、杏、白梨、西洋梨、沙梨、菜豆等氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AhePG1氨基酸序列與GenBank中登錄的桃（AF095577.1、KF976393.1）相似性最高，分別是75.63%、75.54%;AhePG2氨基酸序列與菜豆（XM_ 007162208.1）氨基酸相似性最高，為73.11%;而AhePG3氨基酸序列與葎草（MN971583.1）、菜豆（XM_007154258.1）的氨基酸序列相似性最高，分別為79.71%和75.71%;而AhePG4氨基酸序列與菜豆（XM_007151391.1）的氨基酸序列相似性最高，為70.75%。

對(duì)AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖4），發(fā)現(xiàn)AhePG1包含PG蛋白特有的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ⅰ（SPNTDG）、結(jié)構(gòu)域Ⅱ（GDDC）、結(jié)構(gòu)域Ⅲ（CGPGHGISIGSLG）和結(jié)構(gòu)域Ⅳ（RIK）;AhePG2和AhePG3只包含Ⅰ、Ⅱ 2個(gè)結(jié)構(gòu)域，缺失結(jié)構(gòu)域Ⅲ和結(jié)構(gòu)域Ⅳ;AhePG4包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ3個(gè)結(jié)構(gòu)域，缺失結(jié)構(gòu)域Ⅲ。此外，在AhePG2和AhePG3蛋白保守基序中還存在個(gè)別氨基酸發(fā)生變異，如在AhePG2蛋白中，結(jié)構(gòu)域I的保守基序‘SPNTDG’中的“S”變成“T”;在AhePG3蛋白中，結(jié)構(gòu)域Ⅰ的保守基序‘SPNTDG’中的“N”變成“Y”，“D”變成“L”，結(jié)構(gòu)域Ⅱ的保守基序‘GDDC’中的第一個(gè)“D”變成“Y”。

用MEME工具對(duì)菠蘿蜜AhePG蛋白的保守基序進(jìn)行搜索分析，得到3個(gè)保守基序，分別命名為基序motif 1～motif 3（圖5），分析發(fā)現(xiàn)Motif 1為AhePG蛋白的保守基序，對(duì)應(yīng)‘SPNTDGI’與‘GDDC’，此外Motif 2也具有較高的保守性，可能與菠蘿蜜AhePG蛋白自身以及它們?cè)诓煌M織的特異性有關(guān)。

為了解AhePG的進(jìn)化關(guān)系，使用軟件MEGA7將4個(gè)AhePG基因與66個(gè)擬南芥PG基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，按照置信值大小劃分，所選的PG蛋白質(zhì)可分為6個(gè)組（clade1～clade6），AhePG2、AhePG3和AhePG4處于同一個(gè)分支（clade2）中，而AhePG1單獨(dú)在一個(gè)分支（clade5）。由進(jìn)化樹可知，菠蘿蜜PG基因在擬南芥PG基因中有同源基因，AhePG1與AT3G59850.1，AhePG2與AT3G57790.1，AhePG3與AT3G16850.1，AhePG4與AT2G23900.1（圖6）。

?不同處理對(duì)菠蘿蜜成熟過程中PG基因表達(dá)的影響

如圖7所示，在自然后熟過程中，基因的相對(duì)表達(dá)量在貯藏前2?d變化不大，第3天上升緩慢，之后迅速增加，于第4天開始接近最大（15.16±1.68），并維持高水平表達(dá);ETH處理的基因表達(dá)變化不大;1-MCP處理降低了前8 d中基因的表達(dá)，第8天的表達(dá)量為1.38±0.23，之后開始上升，于第10天達(dá)到最大（12.29±0.86）后開始下降?；蛟诓珊笄? d表達(dá)量有所下降，第3天起開始緩慢上升，第4天達(dá)到最大后開始下降;ETH處理抑制了前期基因表達(dá)的下降，于第1.5天達(dá)到最大后開始下降;1-MCP處理抑制了貯藏前4?d 基因的相對(duì)表達(dá)，隨后其表達(dá)量開始上升，于第10天達(dá)到最大（4.85±1.04）后開始下降?；虻南鄬?duì)表達(dá)量相似，在自然成熟過程中，它們的相對(duì)表達(dá)量在貯藏第1天變化不大，第2天起開始增加，于第4天達(dá)到最大（分別為2.98±0.86、2.08±0.46）后開始下降。ETH處理加快了基因的表達(dá)，于第1.5天達(dá)到最大后（分別為5.38±0.74、5.00±0.69）開始下降。1-MCP處理抑制了基因在貯藏前8 d和基因在貯藏前4 d的相對(duì)表達(dá)量（與第0天比變化不大），但在隨后的成熟過程中，2個(gè)基因的表達(dá)迅速升高，均于第10天達(dá)到最大（分別為14.06±1.57、11.11±1.17）后開始下降，在第12天基本不表達(dá)。

?各指標(biāo)的相關(guān)性分析

用正常成熟的菠蘿蜜果實(shí)的硬度、WSP、ISP、CSP、～基因的表達(dá)水平作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，果肉硬度與3種形態(tài)的果膠——WSP、ISP、CSP均呈負(fù)相關(guān)，其中與WSP的相關(guān)性為?0.895，達(dá)到顯著水平;與～基因的相對(duì)表達(dá)量也呈負(fù)相關(guān)，其中與的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（?0.976）。此外，WSP含量與基因的相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.838，達(dá)到顯著水平（表6）。

?討論

在獼猴桃果實(shí)貯藏過程中，果實(shí)的軟化與果肉中果膠物質(zhì)的降解密切相關(guān)。楊德興等發(fā)現(xiàn)，隨著獼猴桃果實(shí)的成熟軟化，PG酶活性不斷增加，原果膠逐步降解成WSP。在8個(gè)不同品種的秋子梨果實(shí)軟化前后，果肉中的硬度和水溶性果膠含量變化較大，且果肉硬度與水溶性果膠和離子結(jié)合果膠含量間均呈顯著負(fù)相關(guān)，而與共價(jià)結(jié)合態(tài)果膠含量間呈極顯著正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著菠蘿蜜果實(shí)的成熟，果肉硬度快速下降，可溶性果膠和離子型果膠不斷增加，共價(jià)態(tài)果膠有所下降，果實(shí)迅速軟化，且果肉硬度與3種類型的果膠含量均呈負(fù)相關(guān)，其中與水溶性果膠達(dá)到顯著的水平，這與前人的研究有類似的地方，但又有不同，這可能是物種的不同引起的。邵遠(yuǎn)志等發(fā)現(xiàn)，ETH處理可以促進(jìn)番木瓜果實(shí)中原果膠的分解和WSP含量的上升，而1-MCP處理則極顯著延緩了WSP含量的上升。1-MCP處理抑制了庫勒香梨CSP的分解，降低了WSP、ISP的上升程度。ETH處理促進(jìn)了菠蘿蜜WSP和ISP含量的上升，加速了果實(shí)軟化的進(jìn)程，這與邵遠(yuǎn)志等的研究結(jié)果一致;而1-MCP處理抑制了果實(shí)貯藏前期果肉硬度的下降，推遲了果實(shí)的軟化進(jìn)程，但明顯提高了3種果膠的含量，這與楊玉榮的研究結(jié)果不相符。

PG是一個(gè)龐大的基因家族，其蛋白一般具有4個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域（Ⅰ，SPNTDGI;Ⅱ，GDDC;Ⅲ，CGPGHGIS;Ⅳ，RIK），但仍有少部分蛋白只含PG蛋白的部分保守結(jié)構(gòu)域，甚至缺失保守域。如棗上有41個(gè)ZjPG基因，其中只有36個(gè)ZjPG蛋白具有完整的保守結(jié)構(gòu)域;在蘋果的85個(gè)MdPG中，大部分MdPG蛋白都含有完整或趨于完整的保守結(jié)構(gòu)域，有少數(shù)MdPG蛋白存在缺少或缺失現(xiàn)象;又如桃分支E中的13個(gè)PG蛋白只具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ這3個(gè)結(jié)構(gòu)域，都缺少結(jié)構(gòu)域Ⅳ，分支G中的PpaPG82、PpaPG83、PpaPG84不含結(jié)構(gòu)域Ⅰ-Ⅳ。本研究從菠蘿蜜果實(shí)中獲得4個(gè)PG基因、、AhePG3、，編碼406～477個(gè)氨基酸，其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，α-螺旋比例較少且集中在N端，這與‘?dāng)y李’的PsPG蛋白類似。AhePG1蛋白含有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，AhePG2、AhePG3只包有結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ，缺失結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ;AhePG4含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ三個(gè)結(jié)構(gòu)域，缺失結(jié)構(gòu)域III，這與前人的研究結(jié)果相似。此外，在AhePG2、AhePG3蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ-Ⅱ的保守基序中也存在個(gè)別氨基酸的變異，這與蘋果上的研究類似。用MEME工具對(duì)蘋果、冬棗、桃中PG蛋白的保守基序搜索分析發(fā)現(xiàn)，它們分別含有10、8、6個(gè)保守基序（motif 1～motif 10），并且同一物種的不同PG成員所包含的保守基序也不同。本研究在AhePG1～AhePG4蛋白中只搜索到3個(gè)保守基序（motif 1～motif 3），可見，PG蛋白中保守基序的數(shù)量因物種和PG成員的不同而異。

研究發(fā)現(xiàn)，PG基因參與果實(shí)的成熟軟化。獼猴桃中有11個(gè)AcPG基因在軟化果實(shí)中高或中度表達(dá)，其中、和 3個(gè)AcPG基因與PG活性、果膠含量和果實(shí)硬度的特征密切相關(guān)，認(rèn)為它們可能在果實(shí)軟化中發(fā)揮重要作用。代學(xué)慧等發(fā)現(xiàn)，杧果中有4個(gè)PG基因（、、、）隨果實(shí)后熟而表達(dá)量增加且表達(dá)量較高，同時(shí)與杧果果實(shí)軟化、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變松散的變化趨勢(shì)一致，其中和又與已鑒定的在果實(shí)軟化中具有功能活性的基因聚在一起，因此被認(rèn)為最有可能是杧果果實(shí)軟化中的關(guān)鍵PG基因?；蛟诜竟瞎麑?shí)軟化過程起核心作用?！?dāng)y李’PsPG基因在果實(shí)成熟的后期表達(dá)較高，參與果實(shí)后期的軟化。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在果實(shí)成熟前期表達(dá)量低，但在成熟后期高表達(dá)，、、基因雖隨果實(shí)的成熟表達(dá)有所增高，但表達(dá)量總體較低。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，基因與果實(shí)的硬度呈極顯著的負(fù)相關(guān)，與水溶性果膠含量呈極顯著正相關(guān)。可見，可能是菠蘿蜜果實(shí)果膠降解和果實(shí)軟化的關(guān)鍵PG基因，控制著果實(shí)成熟后期的軟化。

與軟化相關(guān)的PG基因表達(dá)受乙烯的調(diào)控。南果梨、、基因和番茄PG基因的表達(dá)量在果實(shí)成熟過程中都隨乙烯生成量的增加而逐漸升高。外源乙烯或ETH處理果實(shí)，可誘導(dǎo)南果梨的、、基因、金冠蘋果基因和獼猴桃基因的表達(dá)量，但在杧果上，有7個(gè)PG基因隨果實(shí)的成熟而表達(dá)量下降，外源ETH處理抑制了獼猴桃、基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，ETH處理降低了基因的表達(dá)量，但略提高了～基因的表達(dá)?？梢?，不同的PG基因，其表達(dá)受乙烯的影響不同。1-MCP作為乙烯受體抑制劑，一般會(huì)抑制PG基因的表達(dá)?！畼椑睢?jīng)1-MCP處理之后，PsPG基因的表達(dá)受到抑制，果實(shí)硬度下降趨勢(shì)減緩。1-MCP處理柿果實(shí)，抑制了基因的表達(dá)上升，延緩了PG酶活性峰。1-MCP處理菠蘿蜜，延緩了4個(gè)AhePG表達(dá)量的增加，但在該處理果實(shí)的后期成熟過程中，卻增加了～ 基因的表達(dá)，對(duì)基因的表達(dá)影響不大。說明，1-MCP處理能延緩菠蘿蜜果實(shí)的成熟，但并不影響果實(shí)后期成熟時(shí)的軟化，～ 基因可能對(duì)其果實(shí)后期的軟化均有作用。

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