不同炮制方法對白芍中4種單萜糖苷類化合物含量的影響

張 剛，何麗珊，王小平,2*

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系,福建 漳州 363000；2.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 漳州市現(xiàn)代中藥重點實驗室,福建 漳州 363000）

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactifloraPall.)的干燥根,味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效[1].常見的白芍炮制品種有生白芍、醋白芍、酒白芍、炒白芍、土炒白芍和焦白芍[2].生白芍能較大限度地保留白芍水溶性浸出物和醇溶性浸出物含量[3]，斂陰平肝作用較強,常用于肝陽上亢所致的眩暈、頭痛、耳鳴等;酒炙能降低白芍酸寒之性，使白芍更擅于和中緩急、止痛，常用于腹痛，脅肋疼痛[4]；醋炙可緩和白芍藥性，降低毒性[5]，主人肝收斂，可斂血止血、疏肝解郁；炒白芍長于養(yǎng)血和肝,常用于肝旺脾虛之癥;土炒白芍用于肝陽脾虛泄瀉或瀉痢日久，喜按喜溫；焦白芍養(yǎng)血柔肝，緩中止痛、斂陰收汗、治胸腹脅肋疼痛、瀉痢腹痛、自汗盜汗、陰虛發(fā)熱[6-7].

現(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究表明，白芍總苷是白芍及其炮制品的有效部位，主要含芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等一系列單萜糖苷類化合物，為白芍及其炮制品的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[8-9],也是白芍及其炮制品質(zhì)量控制的主要指標(biāo).目前，白芍及其炮制品質(zhì)量控制的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、毛細管電泳法、近紅外光譜法、紫外分光光度計法[10]、超高效液相色譜與四級桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-Trap MS-MS）[11]等，其中HPLC法以操作簡便、分離度和檢測靈敏度高、重現(xiàn)性較好等優(yōu)點，成為目前測定芍藥苷含量使用率最高的方法[12].

本研究采用HPLC法對白芍飲片及其5種炮制品中芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷4種成分含量進行測定，研究不同炮制方法對白芍中主要單萜糖苷類藥效物質(zhì)含量的影響，為白芍及其炮制品質(zhì)量控制提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀(LC-20AD二元泵、SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見檢測器、AQ-C18色譜柱)；XSE205DU電子天平（梅特勒-托利多，上海）；KQ－250DE 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器).

1.2 試劑及藥品

芍藥苷(批號:MUST-19110118)，苯甲酰芍藥苷(批號:MUST-20032310),氧化芍藥苷(批號:MUST-20052801)，芍藥內(nèi)酯苷(批號:MUST-20041601)，以上4 種對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司;乙腈(色譜純，Merck 公司)，磷酸(色譜純，F(xiàn)isher 公司)，甲醇(色譜純，F(xiàn)isher 公司);由普力菲爾精密型超純水機（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）制備超純水，其他試劑均為分析純;白芍購于江西江中中藥飲片有限公司，經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系王小平教授鑒定為毛莨科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)干燥的根.樣本存放于漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院漳州市現(xiàn)代中藥重點實驗室.

1.3 白芍炮制品的制備

白芍飲片購于江西江中中藥飲片有限公司.不同白芍炮制品制備方法如下.

酒白芍:取白芍片100 g,加入黃酒10 g，拌勻,稍悶至酒被吸干后置炒制容器內(nèi),用文火加熱,炒至微黃,取出放涼[1].醋白芍:取白芍片100 g,加米醋20 g，拌勻,稍悶至醋被吸干后置炒制容器內(nèi),用文火加熱,炒干,取出放涼[13].炒白芍:取白芍片置炒制容器內(nèi),用文火加熱,炒至表面微黃色,取出放涼[1].土炒白芍:取20 g 灶心土置炒制容器內(nèi),用中火加熱，炒至土星呈靈動狀態(tài)，加入100 g 白芍片，翻炒至藥物表面掛土粉，并微顯焦黃色時，取出藥物，篩除土粉，放涼[13].焦白芍:取白芍片置炒制容器內(nèi),先用武火后用文火炒至表面黑褐色，內(nèi)深褐色，取出放涼[14].

1.4 溶液的制備

對照品溶液制備:精密稱定對照品芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，分別置于5 mL容量瓶中，用乙腈（30%）和0.1%磷酸水（70%）混合液定容制備濃度分別為0.506 0、0.540 0、0.506 0 和0.552 0 mg·mL-1的對照品儲備液.再分別精密移取上述對照品儲備液，配制芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷混合對照品溶液.

供試品溶液制備:將干燥的生白芍、酒白芍、醋白芍、炒白芍、土炒白芍和焦白芍粉碎，過180 μm（80目）篩.再精密稱定上述6種粉末各1.0 g,分別置于100 mL具塞三角燒瓶中，然后各加入75%的甲醇溶液50 mL后稱重，超聲處理（功率200 W）30 min后取出，放至室溫后用75%的甲醇溶液補足失重.搖勻后用普通中性濾紙過濾，再用0.45 μm濾膜真空抽濾，取抽濾濾液作為供試品溶液.

1.5 色譜條件

Shimadzu GL InertSustain AQ-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相:0.1%磷酸水(A)-乙腈(C)；梯度洗脫程序:0～5 min(C 為10%～16%)，5～20 min(C 為16%～16%)，20～35 min(C 為16%～20%)，35～45 min(C 為20%～24%)，45～60 min(C 為24%～48%);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL;檢測波長:230 nm（芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷）和258 nm（氧化芍藥苷）.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察與分析

2.1.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用75%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，參考1.5色譜條件分別進樣，以對照品溶液峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，進行回歸分析.結(jié)果見表1.在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，說明回歸方程線關(guān)系良好.

表1 4種單萜糖苷類對照品化合物的回歸方程

2.1.2 精密度試驗 按1.5 色譜條件對同一濃度對照品混合溶液連續(xù)重復(fù)進樣6 次，每次進樣量為10 μL，記錄峰面積.結(jié)果芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.72%、0.51%、0.43%和0.54%，4 種成分峰面積的RSD 均小于1.80%，表明儀器精密度良好.

2.1.3 重復(fù)性試驗 精密稱定1.0 g 白芍粉末6 份，按1.4 制備6 份平行樣，按1.5 色譜條件進行檢測.記錄峰面積，計算白芍粉末中芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量分別為30.548、0.635、0.198 和4.153 mg·g-1，RSD 分別為1.41%、1.12%、1.06%和1.24%，4 種成分含量測定的RSD 值均小于1.50%，表明該方法具有良好的重復(fù)性.

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱定1.0 g白芍粉末，按1.4制備供試品溶液，按1.5色譜條件，在第0、12、24、36和48 h 進行檢測.結(jié)果芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷面積的RSD 分別為2.24%、1.81%、1.67%和1.77%，4種成分峰面積的RSD值均小于3.00%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的炒白芍粉末6份，分別加入樣品含量相當(dāng)?shù)?種對照品溶液，按照1.4進行提取和制備，依據(jù)1.5色譜條件進行測定，計算結(jié)果如表2.芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷平均加樣回收率分別為99.67%、96.13%、94.25%和99.00%，RSD 分別為0.29%、4.80%、2.61%和1.07%，平均回收率和RSD值均在藥典規(guī)定的可接受范圍內(nèi).

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 圖譜分析

從圖1 可知，炮制方法對樣品中4種單萜糖苷類化合物的含量影響有顯著差異.對照品（S7）與待測品HPLC（S1～S6）圖譜均可見芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷色譜峰，說明白芍生品及上述5 種炮制品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷均有相對較豐富的含量；而苯甲酰芍藥苷和氧化芍藥苷色譜峰在土炒白芍（S5）和焦炒白芍（S6）HPLC圖譜中不明顯，表明這2種成分含量較少，經(jīng)過土炒和焦炒后損失較大.

圖1 混合對照品和6種白芍樣品的高效液相色譜圖

2.3 定量分析

從表3可以看出，不同炮制方法對4種單萜糖苷類化合物的含量影響差別較大，其中酒炙、醋炙和清炒影響較小，4 種單萜糖苷類化合物含量變化不大.而經(jīng)過土炒和焦炒后上述4 種化合物含量都有不同程度的減少，芍藥內(nèi)酯苷含量減少了四分之一，氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量不足生品中含量的三分之一，芍藥苷含量則不足生品中含量的四分之一.

表3 不同白芍炮制品測量結(jié)果

3 小結(jié)

中藥炮制是依照中醫(yī)辨證施治用藥的需要和藥物自身性質(zhì)、以增強藥物療效、改變藥物性能、減除毒性或副作用等為目的所采取的制藥技術(shù).明代御醫(yī)陳嘉謨在《本草蒙筌》中記載：“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失……酒制升提，姜制發(fā)散.入鹽走腎臟，用醋注肝經(jīng)，乳制滋潤回枯，助生陰血，蜜制甘緩難化”[15].不同中藥炮制品療效的差別主要源于炮制過程中其化學(xué)組成的變化，比較和研究中藥炮制前后和不同炮制品主要成分的變化，對研究中藥炮制作用和原理具有重要的意義.

本研究中，白芍、炒白芍、酒白芍和醋白芍中芍藥苷的含量均在2.8%以上，遠大于2020 年版《中華人民共和國藥典》中對生白芍、炒白芍和酒白芍中芍藥苷的含量均不得低于1.2%的要求.上述4種白芍炮制品中豐富的白芍總苷含量，使其在心血管疾病治療[16-17]、抗抑郁[18]、保肝[19]、鎮(zhèn)痛、抗炎、腸胃道疾病治療[20]、抗腫瘤[21-22]和抗氧化[23]等方面均有廣泛的應(yīng)用前景.隨著炮制溫度的升高，土炒和焦炒炮制品中芍藥苷含量急劇減少，尤其是焦白芍中，芍藥苷含量不足白芍生品中含量的10%，說明芍藥苷對炮制溫度敏感，隨溫度升高含量降低，這與前人的研究一致[24].高溫焦炒使焦白芍具有“斂血止血”的功效[25]，但本研究尚不能確定焦白芍中止血活性物質(zhì)，根究中藥炮制“炒炭存性”的標(biāo)準(zhǔn)要求[26]，需要進一步開展研究工作，以明確白芍焦炒前后可能存在的止血活性成分的變化規(guī)律，為揭示焦白芍發(fā)揮斂血止血功效的炮制機制提供參考.