擬松材線蟲G蛋白α亞基Bmu-gpa-1表達特性及功能*

馬 芮 劉文義 余紅仕 周立峰 胡加付

(浙江農(nóng)林大學 杭州 311300)

擬松材線蟲(Bursaphelenchusmucronatus)是一種松樹寄生線蟲，與外來物種松材線蟲(B.xylophilus)同屬于松材線蟲病害系統(tǒng)，已在國內(nèi)外造成嚴重的生態(tài)損失及經(jīng)濟損失(湯勤等， 1989； 張治宇等， 2004； 湯堅等， 2008； Sultanaetal., 2013)。過去對擬松材線蟲病害沒有引起足夠的重視，但近年來越來越多的研究報告顯示擬松材線蟲也具有較高的致病性(陳鳳毛等， 2010； 周立峰， 2017； 薛美靜等， 2019)。高效頻繁的交配行為是擬松材線蟲和松材線蟲快速繁殖及病蟲害發(fā)生的基礎，研究其交配繁殖機制有著深遠的意義(徐紅梅等， 2017； Liuetal., 2019)。迄今為止，國內(nèi)外關于擬松材線蟲的研究多側重于與松材線蟲的比較鑒定，而關于擬松材線蟲交配繁殖學的研究較少，特別是關于擬松材線蟲交配繁殖分子機制的研究。本課題組前期對擬松材線蟲進行轉錄組測序，在擬松材線蟲轉錄組數(shù)據(jù)中挖掘到了21個與線蟲交配繁殖有關的G蛋白α亞基(Gα)家族成員，轉錄組結果顯示Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲交配前后表達差異顯著，且表達模式具有雌、雄蟲差異性，這為筆者探究擬松材線蟲的交配繁殖分子機制提供了依據(jù)。

G蛋白，即鳥苷酸結合蛋白，由α、β和γ這3個亞基構成，是一類重要的信號轉導蛋白，普遍存在于真核生物細胞中(周寶宏，1989)。G蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)聯(lián)系胞內(nèi)信號通路的關鍵蛋白，在線蟲的生長發(fā)育、運動取食、交配繁殖等方面發(fā)揮著重要作用( Tall, 2002； Reynoldsetal., 2004)。模式生物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中共有21個Gα、2個Gβ及2個Gγ(Cuppenetal., 2003； Jansenetal., 1999)，其中Gα是激活G蛋白信號傳導的關鍵亞基，是主要的受體接觸位點及GTP結合位點。當化學信號激活GPCRs后，GPCRs會誘導G蛋白的α亞基與β、γ亞基，導致GDP解離，最終結合GTP并激活下游效應蛋白，參與線蟲的各種生理活動(Mendeletal., 1996； Yoshidaetal., 2012)。

在秀麗隱桿線蟲中，整個gpa基因家族均參與線蟲的化學感應系統(tǒng)，除gpa-12外其余的gpa基因都在化學感應神經(jīng)元上集中表達。研究發(fā)現(xiàn)，多個gpa基因可以在同一個神經(jīng)元中共表達，比如gpa-2、gpa-3、gpa-5、gpa-6、gpa-13及odr-3基因在AWC神經(jīng)元中表達，可以負向調控線蟲的感知系統(tǒng)。另外，同一個基因也可在多個神經(jīng)元上表達，比如gpa-3基因可以在ASE、AWA神經(jīng)元和ADL神經(jīng)元上表達；gpa-1基因可以在ADL、ASH、ASI、ASJ、PHA、PHB神經(jīng)元及雄蟲尾部的特定p.c.s.神經(jīng)元中表達，調節(jié)線蟲對于氯化鈉、異戊醇和乙醇等化學物質的趨向躲避行為以及雄性線蟲的交配行為(Afsharetal., 2004)。研究發(fā)現(xiàn)過量表達雄性秀麗隱桿線蟲的gpa-1基因，其性功能急劇下降，出現(xiàn)尾部翻轉異常、交合刺插入困難等現(xiàn)象，但干擾沉默該基因卻未發(fā)現(xiàn)異常(Jansenetal., 1999； Lansetal., 2004)。

為了探究擬松材線蟲種內(nèi)交配繁殖機制，本文對擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因進行了功能分析。通過生物信息學分析，概括其與其他種屬線蟲的親緣關系，明確進化地位； 利用原位雜交、轉錄組測序分析及實時熒光定量PCR技術研究該基因的表達特性，確定其在線蟲交配前后及不同性別上的表達差異性； 采用RNA干擾技術對Bmu-gpa-1的生物學功能進行研究，明確其在線蟲交配行為及繁殖力上的作用，這即可為進一步探究G蛋白信號轉導在線蟲中的功能提供參考，也可為揭示2種線蟲的種間競爭機理提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲培養(yǎng)

供試擬松材線蟲由安徽省南陵市罹病馬尾松中分離獲得，25 ℃避光條件下在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌苔上培養(yǎng)。用貝爾曼漏斗法收集大量懷卵雌蟲，使其避光產(chǎn)卵1 h，可獲得同步胚胎，孵育29 h后可獲得同步2齡(J2)幼蟲。將同步J2幼蟲接入灰葡萄孢中，25 ℃培養(yǎng)35、62、82 h，即可獲得同步生長的3齡(J3)幼蟲、4齡(J4)幼蟲及成蟲。收集同步J4蟲，根據(jù)性別形態(tài)差異挑選雌、雄蟲，分別飼養(yǎng)至成蟲，即可獲得未交配的雌、雄成蟲。

1.2 Bmu-gpa-1基因克隆與序列分析

使用TRIZOL法提取擬松材線蟲總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara)將擬松材線蟲總RNA反轉錄為cDNA。PCR擴增引物為Bmu-gpa-1-NF: 5′-GGCGTATCA ATGACTCTA-3′，Bmu-gpa-1-NR:5′-TTGTATCCATG ACCGAAT-3′，擴增體系及條件參照Zhou等(2020)前期報道。將PCR 擴增產(chǎn)物克隆在pGEM?-TEasy載體上，送往北京擎科生物有限公司測序。根據(jù)測序結果利用NCBI保守域數(shù)據(jù)庫確定其保守結構域，使用DNAMAN8軟件進行氨基酸序列比對，通過 MEGA 7.0鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在SWISS MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)網(wǎng)站上預測編碼蛋白的三級結構，并利用ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質分子量、親水性及穩(wěn)定性。

1.3 Bmu-gpa-1表達模式研究

利用熒光定量PCR(RT-qPCR)技術分析Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲不同發(fā)育時期的表達水平，利用原位雜交技術在mRNA水平上研究該基因在線蟲不同發(fā)育時期的表達部位，明確其時空表達特性。RT-qPCR引物為Bmu-gpa-1-qF:5′-TAAAAC GGCCAAAAAGCGCA-3′，Bmu-gpa-1-qR:5′-TCTCTT TATTGCGACGGGCA-3′，內(nèi)參基因選擇18S及TUB(周立峰， 2017)，具體步驟參照Zhou等(2020)前期報道。

1.4 Bmu-gpa-1生物學功能分析

1.4.1 dsRNA合成及RNAi浸泡試驗 使用MEGAscript ?試劑盒進行體外轉錄反應合成dsRNA。引物為Bmu-gpa-1-iF： 5′-TAATACGACTC ACTATAGGGAGAGGCGTATCAATGACTCTA-3′，Bmu-gpa-1-iR： 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTGT ATCCATGACCGAAT-3′。將5 μL的擬松材線蟲混懸液放入15 μL的Bmu-gpa-1-dsRNA干擾液中黑暗浸泡處理30 h，再將2批等量的線蟲分別轉移至15 μL的gfp-dsRNA干擾液和15 μL不含有dsRNA的緩沖液中黑暗浸泡處理30 h，作為對照組。每組均含有3 μL的M9 Buffer，干擾液中的dsRNA終濃度為0.5 μg·μL-1，最后用ddH20定容(陳莎妮等， 2021)。

1.4.2Bmu-gpa-1干擾效率檢測 提取對照組、處理組線蟲的RNA，反轉錄為cDNA，應用RT-qPCR技術檢測各個發(fā)育階段擬松材線蟲的RNAi效率，每次重復4組，共3次。

1.4.3 交配行為測定 收集未交配的同步雌、雄蟲，按照對照組(1條正常雌蟲+1條正常雄蟲)、雌蟲組(1條干擾后雌蟲+1條正常雄蟲)、雄蟲組(1條正常雌蟲+1條干擾后雄蟲)設置不同試驗組，每次試驗重復8組，共3次。觀察記錄每組線蟲在交配高峰期(8 h)內(nèi)的交配時長及交配次數(shù)，24 h后進行胚胎計數(shù)。計算每組線蟲的交配率(交配組數(shù)/試驗總組數(shù))、平均交配次數(shù)(交配總次數(shù)/交配組數(shù))、平均交配時長(交配總時長/交配組數(shù))、有效交配率(產(chǎn)卵組數(shù)/交配組數(shù))、平均產(chǎn)卵量(產(chǎn)卵總量/有效交配組數(shù))等參數(shù)，用以評估每組線蟲的交配能力及繁殖能力(趙雙修， 2016； 徐紅梅等， 2017)。本研究中，正確交配行為定義為： 雄蟲的交合刺準確插入雌蟲的陰戶，持續(xù)時長不低于1 min。有效交配行為定義為： 擬松材線蟲正確交配，并產(chǎn)下后代(趙雙修， 2016)。

2 結果與分析

2.1 Bmu-gpa-1基因的克隆與序列

擬松材線蟲Bmu-gpa-1全長1 780 bp，其中CDS為1 065 bp，編碼354個氨基酸。ExPASy-ProtParam tool預測基因編碼蛋白的分子式為C1822H2918N492O536S17，具有親水性，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index,Ⅱ)為47.4，是一類不穩(wěn)定蛋白。NCBI Conserved Domains預測其主要功能區(qū)為G1-5box、SwitchⅠ-Ⅱregions，它們是GTP結合位點、Gβγ和下游效應器的結合位點，在各種生理活動中起調節(jié)的作用，如圖1A所示。在SWISS MODEL上預測其編碼蛋白的三級結構，結構圖如圖1中D1、D2所示。結果顯示該基因編碼蛋白結構與典型的異三聚體G蛋白晶體結構1got.1最為相似，GMQE為0.74，QMEAN為0.70±0.05，蛋白序列一致性為44.06%，這表明預測結果可信度較高，蛋白模型匹配度較好，該基因編碼蛋白屬于G蛋白家族(Lambrightetal., 1996)。利用 DNAMAN軟件將Bmu-gpa-1基因所編碼的氨基酸序列與Bursaphelenchusxylophilus(CAD5232120.1)、Caenorhabditiselegans(NP_505840.1)、Caenorhabditisbriggsae(XP_002636462.1)、Strongyloidesstercoralis(AAK54043.1)、Strongyloidesratti(XP_024503395.1)、Loaloa(XP_003135770.1)、Brugiamalayi(CDP98783.1)及Brugiatimori(VDO30356.1)的氨基酸序列進行多重序列比對。結果如圖1B所示，Bmu-gpa-1基因的氨基酸序列與不同物種的gpa-1基因的氨基酸序列具有較高的保守性。利用MEGA軟件，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。該進化樹包含Bursaphelenchus、Strongyloides、Brugia等屬，涉及了13個物種。結果如圖1C所示： 擬松材線蟲Bmu-gpa-1與其他線蟲的gpa-1氨基酸序列聚類在一起，與另一個Gα基因egl-30氨基酸序列區(qū)別開來，表明Bmu-gpa-1基因與其他物種的gpa-1基因歸屬于同一個基因家族，區(qū)別于其他Gα基因。其中，Bmu-gpa-1基因與松材線蟲gpa-1基因、秀麗隱桿線蟲gpa-1基因親緣關系較近，這為Bmu-gpa-1基因的生物學研究提供了參考。

2.2 Bmu-gpa-1基因的時空表達特性

擬松材線蟲轉錄組測序分析及RT-qPCR結果如圖2A、2B所示： 2組結果相一致，均表明Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲J2及J3的表達量最高，與其他齡期相比差異顯著(P<0.05)，J4及成蟲期表達量最低，且雄蟲的基因表達水平顯著高于雌蟲，基因表達模式具有雌、雄蟲差異性。這說明Bmu-gpa-1基因可能在擬松材線蟲J2、J3時期發(fā)揮著重要的作用； 在時間上，隨著線蟲的發(fā)育，基因表達水平由低到高再到低變化。

原位雜交結果如圖3所示，具體表達特性為： 隨著胚胎發(fā)育，表達部位由散點至全胚胎變化(圖A-D)，J2時期全身表達(圖E)、在J3時期的腸道、體壁肌肉及生殖原基處表達(圖F)、在J4雌、雄蟲的性腺表達(圖G、H)。在成蟲期，雌、雄差異表達： 雌蟲只在陰戶部位表達(圖I)，雄蟲在交合刺及尾部表達(圖J)。這說明Bmu-gpa-1在擬松材線蟲各個發(fā)育階段均有表達，且隨著線蟲的發(fā)育，基因表達部位從局部到全身再到局部變化，在成蟲期雌、雄差異表達。由此筆者推測，在線蟲的發(fā)育初期多部位表達的Bmu-gpa-1可能與線蟲早期的生長發(fā)育有關，而在線蟲的發(fā)育后期集中于性腺及尾部表達的Bmu-gpa-1可能與線蟲后期的生殖發(fā)育有關，參與調控擬松材線蟲的交配繁殖行為。

圖1 Bmu-gpa-1生物信息學分析Fig. 1 Bioinformatics analysis of Bmu-gpa-1A: Bmu-gpa-1保守結構域； B： Bmu-gpa-1基因序列比對； C： Bmu-gpa-1系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自檢次數(shù)為1 000次，分支數(shù)字表示支持率； D1、D2： Bmu-gpa-1蛋白質空間結構。A： The conservative domain of Bmu-gpa-1 B: The sequence alignment of Bmu-gpa-1; C: Phylogenetic analysis of Bmu-gpa-1. The phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining method with 1 000 self-checks, and the branch number indicated the support rate; D1，D2: The protein structure of Bmu-gpa-1.

圖2 Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲不同發(fā)育階段的表達水平Fig. 2 Expression level of Bmu-gpa-1 in different stages of B. mucronatusA： 轉錄組分析； B： 實時熒光定量PCR測量； Embryo： 胚胎期； J2： 2齡時期； J3： 3齡時期； F-J4： 雌蟲4齡時期； M-J4： 雄蟲4齡時期； V-F-A： 未交配雌蟲成蟲期； V-M-A： 未交配雄蟲成蟲期； M-F-A： 已交配雌蟲成蟲期； M-M-A： 已交配雄蟲成蟲期。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A: Transcriptome analysis; B: RT-qPCR; Embryo: Embryonic stage; J2: The second stage of juvenile; J3: The third stage of juvenile; F-J4: The fourth stage of female juvenile; M-J4: The fourth stage of male juvenile; V-F-A: The adult stage of virgin female; V-M-A: The adult stage of virgin male; M-F-A: The adult stage of mated female; M-M-A: The adult stage of mated male. Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

2.3 Bmu-gpa-1生物學功能

2.3.1Bmu-gpa-1基因的RNA干擾效率分析 與對照組擬松材線蟲(試驗體系不含有dsRNA)相比，另一對照組(試驗體系含有gfpdsRNA)線蟲的Bmu-gpa-1基因表達略有下降，但差異不顯著，而處理組(試驗體系含有Bmu-gpa-1dsRNA)的擬松材線蟲各齡期Bmu-gpa-1基因表達量均顯著降低，表達水平均減少50%以上(圖4)，表明經(jīng)RNAi處理后，擬松材線蟲各齡期的Bmu-gpa-1基因表達水平受到顯著抑制。

圖3 Bmu-gpa-1原位雜交Fig. 3 In-situ hybridization of Bmu-gpa-1處理組: A. 囊胚期胚胎； B. 原腸期胚胎； C. 蠕蟲期胚胎； D. 1齡幼蟲； E. 2齡幼蟲； F. 3齡幼蟲； G. 4齡雌蟲； H. 4齡雄蟲； I. 雌性成蟲； J. 雄性成蟲； K. 雄性成蟲交合部位。對照組. L. 原腸期胚胎； M. 雄性成蟲； m. 食道球； v. 陰戶； sp. 交合刺； an. 肛門。Treatment: A. Blastosphere; B. Gastrulae; C. Worm embryo; D. The first stage of juvenile; E. The second stage of juvenile; F. The third stage of juvenile; G. The fourth stage of female juvenile; H. The fourth stage of male juvenile; I. The female adult; J. The male adult; K. The copulative site of male adult. Control. L. Gastrulae; M. The male adult; m. Metacorpus; v. Vulva; sp. Spicules; an. Anus.

圖4 利用熒光定量PCR分析RNAi效率Fig. 4 The RNAi efficiency quantified by RT-qPCREmbryo： 胚胎期； J2： 2齡時期； J3： 3齡時期； J4： 4齡時期； Adult： 成蟲期。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Embryo: Embryo; J2: The second stage of juvenile; J3: The third stage of juvenile; J4: The fourth stage of juvenile; Adult: The adult stage. Different lowercase letters mean significant difference at 0. 05 level.

2.3.2Bmu-gpa-1基因對擬松材線蟲交配繁殖行為的影響 按照方法1.4.3進行試驗，交配行為測定結果如表1所示： 對照組中，68.75%的擬松材線蟲在8 h內(nèi)完成交配，每組平均交配1.05次，平均交配時長為22.14 min，其中83.45%的交配行為是有效交配行為，平均每組雌蟲產(chǎn)14.28顆卵。干擾雄蟲組中，82.29%的線蟲存在交配行為，每組平均交配1.47次，平均交配時長持續(xù)約15.19 min，但只有59.54%的交配行為屬于有效交配行為，且平均每組雌蟲產(chǎn)卵8.07顆。與對照組相比，干擾雄蟲組的線蟲交配次數(shù)顯著增加，交配時長顯著縮短，且繁殖力明顯下降，但干擾雌蟲組的線蟲卻無顯著變化。推測Bmu-gpa-1基因可以調控擬松材線蟲雄蟲的交配行為，干擾該基因可使雄蟲興奮程度提高，表現(xiàn)出頻繁快速低效的交配行為模式。

3 討論

通過對擬松材線蟲的轉錄組數(shù)據(jù)分析，篩選出線蟲交配前后差異表達的Bmu-gpa-1基因，且該基因表達具有雌、雄蟲差異性。通過生物信息學分析，筆者明確了Bmu-gpa-1基因屬于G蛋白α亞基家族，與其他線蟲的Gα具有較高的同源性，且擁有相同的代表性結構位點。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示擬松材線蟲gpa-1基因與松材線蟲gpa-1基因位于同一分支，且與秀麗隱桿線蟲gpa-1基因關系較為緊密，這為筆者研究擬松材線蟲gpa-1基因提供了參考，也為后續(xù)研究擬松材線蟲和松材線蟲種間競爭分子機制提供了理論支持。

本研究中，擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因的原位雜交結果與實時熒光定量PCR、轉錄組結果相一致。結果顯示該基因在擬松材線蟲各發(fā)育階段均有表達，發(fā)育初期線蟲全身表達，表達量較高，發(fā)育后期則主要在雌蟲陰戶、雄蟲交合刺及尾部特異性表達，表達水平較低。筆者推測該基因可能與擬松材線蟲的生長、生殖發(fā)育有關： J2、J3是線蟲發(fā)育增長最快、形成生殖原基的時期(葉為民等， 1993)，線蟲大量取食以滿足生長發(fā)育需求，此階段的Bmu-gpa-1基因可能更多地在生長發(fā)育方面發(fā)揮作用，基因表達較高較廣； 而線蟲到了J4及成蟲時期，線蟲體內(nèi)含有較多顆粒營養(yǎng)物質，足以維持正常的生長發(fā)育，雌、雄差異表達的Bmu-gpa-1基因則更多地在線蟲的生殖發(fā)育方面發(fā)揮作用，基因表達相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲的gpa-1基因的表達水平也具有相似的特性，即各齡期廣泛表達，表達水平大致隨著線蟲的發(fā)育而下降，且雄蟲的基因表達水平顯著高于雌雄同體線蟲。在表達部位上，秀麗隱桿線蟲也主要在頭感器及尾感器上的ASI、ASJ、ADL、ASH、 PHA、PHB神經(jīng)元及雄蟲交配必需神經(jīng)元p.c.s.上表達。Jansen(1999)也發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲gpa-1、gpa-7、gpa-13、gpa-15基因也都在雄蟲尾部特定神經(jīng)元特異表達，這與筆者在擬松材線蟲上取得的研究結果極為相似。

表1 交配行為測定結果①Tab.1 Results of mating test

借助于RNAi技術研究該基因的功能，發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲干擾后的雄性成蟲表現(xiàn)出頻繁交配，交配時長縮短及后代數(shù)量減少等交配質量下降特征，但對雌蟲影響較弱。這說明gpa-1基因影響雄蟲的交配行為及繁殖能力。在秀麗隱桿線蟲中，過量表達gpa-1基因可以導致雄蟲性功能急劇下降，雄蟲無法準確定位雌蟲陰戶，交合刺插入困難，但干擾沉默該基因卻未發(fā)現(xiàn)異常的交配行為(Jansenetal., 1999； Lansetal., 2004)。研究發(fā)現(xiàn)，干擾沉默秀麗隱桿線蟲的另一個Gα基因goa-1出現(xiàn)類似情況，goa-1基因被沉默后，雄蟲的交配效率顯著下降，出現(xiàn)運動亢奮、性功能下降、繁殖力降低等現(xiàn)象，Mendel等(1996)認為這可能與該基因所表達的神經(jīng)元、肌肉有關，這些特定神經(jīng)元、肌肉可以影響線蟲的交配繁殖行為。結合該基因表達模式，推測在擬松材線蟲雄蟲交合刺及尾部特異表達的Bmu-gpa-1基因可以調節(jié)雄蟲的交配行為系統(tǒng)，維持正常的交配繁殖機制，保持種群穩(wěn)定。

目前，國內(nèi)外關于線蟲交配繁殖學的研究多集中于交配行為的研究，在其遺傳控制機制方面的研究鮮有報道。本研究通過對擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因的表達特性及生物學功能研究，為線蟲Gα基因的研究提供方法參照及理論參考，也對揭示擬松材線蟲種內(nèi)交配機制具有重要意義。同時，國內(nèi)外關于擬松材線蟲與松材線蟲的種間競爭研究也多集中于繁殖差異性上，進一步與姊妹種松材線蟲的比較，可為兩者種間競爭機制的研究提供依據(jù)，也可為闡明松材線蟲病害機理及調控基礎提供重要突破口。

4 結論

擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因是G蛋白α亞基家族中的一員，在擬松材線蟲各發(fā)育階段均有表達，發(fā)育初期被廣泛表達，表達水平較高，發(fā)育后期出現(xiàn)雌、雄蟲差異表達，表達水平較低。同時，Bmu-gpa-1基因在功能上也具有雌、雄蟲差異性，對雌蟲影響較弱，但可以影響其交配繁殖行為，這為筆者研究線蟲的種內(nèi)交配分子機制提供了基礎，也為擬松材線蟲的病害防治提供了新思路，后續(xù)將繼續(xù)探究Bmu-gpa-1與Bxy-gpa-1的異同及其在種間競爭中發(fā)揮的作用，為進一步揭示擬松材線蟲生態(tài)位喪失及松材線蟲入侵機制奠定基礎。