真菌菌群在炎癥性腸病中的作用研究進(jìn)展

楊卓 楊歡 于繼凱 周云 岳劍 李淑霞

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是消化道的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病，多年來IBD與腸道菌群的關(guān)系備受關(guān)注[1-2]，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[3]。IBD的發(fā)病機(jī)制是遺傳易感性、環(huán)境影響和腸道屏障受損等多因素之間相互作用的結(jié)果[4-5]。目前，隨著宏基因組、18SrRNA和真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)擴(kuò)增子測序技術(shù)的發(fā)展，諸多研究已發(fā)現(xiàn)IBD患者的腸道真菌菌群發(fā)生了變化，但尚不清楚這種變化是IBD發(fā)病的起因還是結(jié)果。Sokol等[6]通過分析IBD患者的糞便樣本，檢測到擔(dān)子菌門和子囊菌門的比值較健康個體上升。最近的真菌測序分析也揭示了IBD患者糞便和炎癥黏膜中念珠菌和馬拉色菌的增加，存在明顯的真菌失調(diào)，證實了真菌菌群和IBD之間存在潛在的聯(lián)系[7]。Ott等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CD患者的平均真菌多樣性更高，而在UC患者的糞便中真菌多樣性較低，表明CD患者的的特定腸道環(huán)境有利于真菌定植。研究表明[9]，CD患者腸道炎癥部位的真菌菌群明顯不同于非炎癥部位,腸道真菌菌群組成的變化可能與黏膜炎癥、疾病活動度有關(guān)。擔(dān)子菌門和子囊菌門之間具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，疾病活動期時擔(dān)子菌門豐度增加，而子囊菌門豐度減少[10]。而在IBD緩解期，子囊菌門和擔(dān)子菌門的豐度比值并無改變[11]。此外，真菌在急性腸道炎癥時對維持腸道細(xì)菌菌群和微生物-宿主的穩(wěn)態(tài)起重要作用，而慢性復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎時,真菌會易位至其他部位,造成新的損害并加重炎癥程度[12]。由此可見，腸道真菌可能在IBD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多方面作用。

1 真菌菌群概述

人類腸道菌群是由細(xì)菌、真菌和病毒等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)[13]。到目前為止，大多數(shù)研究都集中在腸道微生物群中的細(xì)菌部分及其在健康和疾病中的作用，而真菌在宿主內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的關(guān)鍵作用研究較少。胃腸道中含有高度多樣化的真菌，是人類研究最多的真菌生態(tài)位，目前通過對從糞便中提純的DNA中的標(biāo)記基因進(jìn)行ITS擴(kuò)增子測序技術(shù)和全基因組測序，發(fā)現(xiàn)的有66個屬，分成約180個種，在真菌分類群中，子囊菌門(Ascomycota)與擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在真菌群中占主導(dǎo)地位[14]。雖然真菌菌群僅占腸道微生物群落的0.1%左右，但在腸道細(xì)菌組成的動態(tài)平衡和黏膜免疫反應(yīng)中起著決定性的作用，在生態(tài)系統(tǒng)中有著不成比例的意義[15]。在人體腸道中檢測到的腸道真菌類別可以分為常駐和非常駐兩類，它們具有影響重要功能的潛力，有些真菌能夠繞過或穿透表面屏障以及抵御人體免疫系統(tǒng)在腸道內(nèi)生長和定植，繼而感染人類[16]。近幾十年來，由于免疫缺陷患者等易感人群的數(shù)量增加，真菌感染也有所增加，現(xiàn)在已對公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

共生細(xì)菌雖然對宿主健康和免疫調(diào)節(jié)具有影響，但也不足以調(diào)節(jié)腸道菌群的所有功能，腸道共生真菌與細(xì)菌相互之間有著密切聯(lián)系，存在相互影響的可能性[17]。長期服用廣譜抗生素的個體中酵母的過度生長反映了共生細(xì)菌在腸道真菌定植中的調(diào)節(jié)作用。腸道真菌菌群似乎比細(xì)菌菌群更不穩(wěn)定，較細(xì)菌而言顯得多變[18]。二者的豐度似乎呈負(fù)相關(guān)，腸道中真菌的增多通常是細(xì)菌菌群失調(diào)的跡象，而細(xì)菌菌群的破壞是真菌過度生長的前提[19]。特定細(xì)菌的存在可能會降低真菌的存活率和定植能力，間接改變真菌基因組對宿主的作用，細(xì)菌代謝產(chǎn)物如丙酸也可以自然控制人體腸道內(nèi)真菌的致病性和宿主細(xì)胞的損傷[20-21]。而真菌可以抑制細(xì)菌的毒力，真菌菌群感應(yīng)分子法尼醇也會影響細(xì)菌的基因調(diào)控，并能顯著改變細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄譜[22]。證實了腸道細(xì)菌與真菌之間除了共生關(guān)系外，也存在競爭作用。因此，了解IBD患者中真菌和細(xì)菌之間的確切跨域相關(guān)性可能會改善這類患者的治療策略[23]。

2 真菌菌群的免疫機(jī)制

目前特定真菌的研究還都聚焦于白念珠菌(Candidaalbicans)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)上，免疫系統(tǒng)如何識別真菌的入侵或定植還未完全了解[24]。研究表明[25]，共生真菌可以激活與上皮屏障完整性相關(guān)的宿主保護(hù)性免疫通路，也可以引發(fā)與IBD相關(guān)的炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞可識別真菌細(xì)胞壁上的β-葡聚糖等多種復(fù)合物，繼而激活機(jī)體先天和獲得性免疫反應(yīng)，抑制腸道真菌菌群的過度繁殖或外來病原菌的定植作用。在該免疫應(yīng)答過程中, 吞噬細(xì)胞表達(dá)并激活宿主細(xì)胞表面的C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLRs)的家族成員Dectin-1、Dectin-2和Mincle，以及具有次要作用的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和Nod樣受體(NOD-like receptors，NLRs)等模式識別受體 (pattern recognition receptor，PRR)，從而對病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)識別及信號傳導(dǎo)，并通過胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase-associated recruitment domain 9，CARD9)和核因子-κB(NF-κB)誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子應(yīng)答先天性免疫，還可誘導(dǎo)樹突細(xì)胞釋放輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)和Th1應(yīng)答獲得性免疫，從而啟動免疫功能參與真菌的免疫識別[26]。作為真菌關(guān)鍵模式識別受體的dectin-1缺失被認(rèn)為與IBD相關(guān)，Dectin-1誘導(dǎo)產(chǎn)生Th17，通過CARD9激活胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生作用[27]。此外，定量PCR和流式細(xì)胞分析證實，編碼真菌CLRs的轉(zhuǎn)錄子在CX3CR1+單核巨噬細(xì)胞(MNPs)顯著高表達(dá)，CX3CR1+MNPs對于啟動抗真菌CLRs激活下游的信號級聯(lián)至關(guān)重要[34]。由此可見，Dectin-1、CARD9、IL-17信號途徑、CX3CR1+MNPs等均可能作為IBD真菌菌群失調(diào)的驅(qū)動因素,參與調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定(見圖1)。

圖1 圖1 PAMPs被PRR識別后，通過SYK方式誘導(dǎo)下游CARD9激活NF-κB通路促進(jìn)IL-6和IL-10等細(xì)胞因子的分泌來維持Th17/Treg平衡，而啟動免疫功能參與真菌的免疫識別Fig.1 After PAMPs are recognized by PRR, SYK induces downstream CARD9 to activate the NF-κB pathway to promote the secretion of IL-6 and IL-10 cytokines to maintain the Th17/Treg balance, and to initiate immune function to participate in the immune recognition of fungi

3 真菌菌群與炎癥性腸病

3.1 念珠菌

念珠菌(Candida)隸屬子囊菌門，通常存在于正常人的口腔、腸道及陰道，白念珠菌是其中最為常見的致病菌，占念珠菌感染的75%，在IBD患者腸道內(nèi)，白念珠菌的檢出率高達(dá)97.1%[28]。由于缺氧和營養(yǎng)受限,念珠菌在消化道中的代謝活性很低，被認(rèn)為是機(jī)會致病性真菌[29]。當(dāng)機(jī)體免疫功能降低，它便會大量繁殖并從酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相，侵入細(xì)胞引起疾病[30]。Liguori等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在CD患者的糞便和黏膜中，真菌菌群豐度和多樣性均明顯升高，其中念珠菌屬的比例大幅增高。Limon等[32]研究顯示，在IBD患者中念珠菌的定植增加，可以放大IBD炎癥過程，延遲炎癥病變的愈合。Dectin-1和β-葡聚糖之間的相互作用在念珠菌的應(yīng)答中起著重要作用，Dectin-1基因缺陷小鼠由于念珠菌的過度生長而加重UC病程。最近的一項研究表明[33]，Dectin-1基因的多態(tài)性與UC患者疾病嚴(yán)重程度的增加有關(guān)，Dectin-1在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠模型中具有調(diào)節(jié)炎癥嚴(yán)重程度的中心作用，Dectin-1缺乏增加了小鼠對白念珠菌感染的易感性，可能的機(jī)制是通過增加腸的通透性和調(diào)節(jié)宿主嘌呤代謝而加重UC炎癥。

研究顯示[34]，編碼CX3CR1的基因中的SNPs與CD患者的抗真菌IgG反應(yīng)密切相關(guān)，CX3CR1+MNPs在腸道抗真菌免疫中起關(guān)鍵作用，80%以上的CX3CR1+MNPs能有效識別和應(yīng)答念珠菌，并以脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)依賴的方式表達(dá)抗真菌受體并激活抗真菌反應(yīng)，以預(yù)防UC，并且在產(chǎn)生白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)的Th17細(xì)胞的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。而在CD患者中，發(fā)現(xiàn)了編碼CX3CR1基因的錯義突變，并發(fā)現(xiàn)該突變與抗真菌反應(yīng)受損有關(guān)[35]。此外，白念珠菌的腸道定植誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和IL-22，這些Th17細(xì)胞將免疫系統(tǒng)與腸道組織緊密結(jié)合在一起，控制小鼠和人類體內(nèi)特定的共生細(xì)菌和真菌[36]。盡管IL-17可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞表達(dá)防御素，從而在抵抗病原菌侵襲中發(fā)揮了重要作用[37]。但高水平的IL-17在多種細(xì)胞因子協(xié)同作用下可募集炎癥細(xì)胞，促進(jìn)吞噬細(xì)胞分化，從而擴(kuò)大組織局部病理損傷[38-39]?？梢?，IL-17在具有保護(hù)性免疫效應(yīng)的同時更具有強(qiáng)大的潛在致炎效應(yīng)。因此，對IL-17水平的影響可能是念珠菌定植增強(qiáng)炎癥的能力的基礎(chǔ)[40]。白念珠菌可能通過誘導(dǎo)真菌抗原反應(yīng)性Th17細(xì)胞的分化，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-17和IL-22的分泌來增加IBD的風(fēng)險，從而在IBD患者的腸道中起致病作用[41]。

3.2 馬拉色菌

馬拉色菌(Malassezia)隸屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，由于它們依賴脂質(zhì)來生長，所以主要生長在產(chǎn)生油性分泌物的皮脂腺中，是皮膚微生物群中的主要真菌成員[42]。然而，隨著測序方法的發(fā)展，馬拉色菌也已被鑒定為腸道的常駐真菌[43]。盡管以前的研究大多認(rèn)為這種存在是短暫的，對宿主沒有影響。但最近的研究顯示[44-45]，IBD患者在急性發(fā)作期的馬拉色菌數(shù)量較高，腸道黏膜中發(fā)現(xiàn)的限制馬拉色菌(M.restricta)可能以CARD9依賴的方式加重腸道炎癥，CARD9多態(tài)性有利于限制馬拉色菌定植，CARD9基因座的遺傳缺陷也被認(rèn)為與IBD的嚴(yán)重程度有關(guān)，說明CARD9相關(guān)信號通路對于機(jī)體感知限制馬拉色菌起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[46-47]，銜接分子CARD9為IBD的相關(guān)基因，作為CLRs的關(guān)鍵下游信號分子，主要是通過Dectin-2和Mincle參與對馬拉色菌的免疫應(yīng)答。CARD9或Dectin-2的缺失降低了炎性細(xì)胞因子TNF和IL-6的分泌水平，從而加重結(jié)腸炎[49]。因此，CARD9的缺失不僅可能導(dǎo)致對真菌病原體的易感性[49]，還可能增加IBD的發(fā)病風(fēng)險[50]。此外，CARD9缺乏也會影響腸道真菌的免疫調(diào)節(jié)，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)生[51-52]。

3.3 酵母菌

釀酒酵母是是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，廣泛存在于人體的不同部位。目前，腸道中的抗釀酒酵母抗體(ASCA)已被用作識別大多數(shù)CD患者的重要血清學(xué)標(biāo)志物，有力地支持了釀酒酵母菌在IBD中的作用[53]?；诙縋CR的糞便樣本中釀酒酵母菌的檢測發(fā)現(xiàn)，IBD活動期患者糞便中的釀酒酵母多于疾病緩解期患者，說明釀酒酵母能影響IBD活動度[6]。研究表明[54]，在IBD受試者的糞便樣本中，釀酒酵母菌和白念珠菌的豐度之間呈負(fù)相關(guān)，釀酒酵母菌與白念珠菌的定植和黏附存在競爭，并通過抑制白念珠菌中可溶性天冬氨酸蛋白酶的表達(dá)，或阻止白念珠菌轉(zhuǎn)化為侵襲性菌絲形式，提示它們在IBD發(fā)生過程中存在一定的競爭關(guān)系。

此外，布拉酵母菌(Saccharomycesboulardii)作為一種益生真菌，主要通過通過分泌細(xì)菌素、上調(diào)防御素等增加宿主的免疫功能以及限制樹突狀細(xì)胞向炎癥部位移動來減輕腸道局部炎癥，已被用于緩解腸道炎癥的輔助治療[55-56]。布拉酵母菌對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的抗炎作用，提示該酵母通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控microRNAs的表達(dá)水平發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明[57-58]，布拉酵母菌可上調(diào)腸道分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)水平，來維持Th1/Th2和Th17/Treg平衡，促進(jìn)IL-6和IL-10等細(xì)胞因子的分泌，從而限制IBD病理性炎癥反應(yīng)。其次，用布拉酵母菌進(jìn)行的治療也可部分緩解缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和HIF-2α的水平，從而改善DSS誘發(fā)的UC[59]。

4 結(jié) 論

綜上所述，真菌菌群在炎癥性腸病中扮演著不可缺少的角色，真菌菌群的重建可能為炎癥性腸病提供新的治療途徑。要開發(fā)微生物的治療劑，就需要識別腸道菌群中有助于預(yù)防疾病的特定真菌以及任何菌株特定的靶點(diǎn)。因此，未來的研究應(yīng)嘗試從定量和功能兩個方面表征更多真菌菌群的組成，在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中擴(kuò)大真菌和其他微生物的參考基因組，嘗試挖掘其他真菌的致病機(jī)制或治療潛能，以評估它如何影響腸道炎癥的轉(zhuǎn)歸和治療反應(yīng)。還應(yīng)改變目前對人類微生物群的“細(xì)菌中心”觀點(diǎn)，并在細(xì)菌-真菌相互作用或腸道真菌與IBD患者的免疫反應(yīng)方面進(jìn)一步探索。此外，了解導(dǎo)致IBD發(fā)病的機(jī)制對于發(fā)現(xiàn)新的治療策略以提高患者的治療水平至關(guān)重要，需要更多的基礎(chǔ)研究來為這一微生物組新領(lǐng)域的治療方法提供信息，以促進(jìn)人類腸道健康。