白念珠菌對臨床常用抗真菌藥物耐藥機制研究進(jìn)展

張欠欠 封小川 張凱玄 元航

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安 716000；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，延安 716000)

近年來，以白念珠菌感染為主的念珠菌屬引起的侵襲性念珠菌病患者人數(shù)逐年增多，病死率高，成為惡性腫瘤、AIDS及器官移植等疾病致死的直接原因，嚴(yán)重危害全球人類的生命健康。全球念珠菌病的發(fā)病率在過去20年顯著上升，從每10萬人中有2例上升到14例[1]。ARTEMIS DISK全球抗真菌監(jiān)測研究顯示，在巴西，白念珠菌的發(fā)病率約占醫(yī)院真菌感染的80%[2]；在希臘，白念珠菌感染占念珠菌感染的41%[3]。在歐洲，新生兒感染白念珠菌占比為60.2%[4]。Santolaya等[5]研究結(jié)果顯示，在ICU患者念珠菌感染病例中，白念珠菌感染占43.8%。CHIF-NET2009—2017年顯示[6-7],白念珠菌的感染率從44.9%下降到32.9%，雖有所下降，但仍高于其他念珠菌感染。在美國、歐洲以及巴西，念珠菌在醫(yī)院血流感染病原體中分別位列第4、第6和第7位[8]。Aysegul等[9]針對發(fā)展中國家的6年研究顯示，白念珠菌血癥占總念珠菌血癥的48.1%。我國念珠菌血癥在醫(yī)療相關(guān)血流感染的常見原因中排名第四，在重癥監(jiān)護(hù)室重癥感染的病因中排名第一[10]。成年人念珠菌血癥后的死亡率達(dá)到40%～70%，新生兒念珠菌血流感染后的死亡率為20%～34%[8,11]。由于目前治療白念珠菌感染疾病的藥物種類有限，耐藥菌株越來越多地被報道，耐藥性逐漸增強，致使臨床治療白念珠菌感染變得非常棘手。因此，了解白念珠菌的耐藥現(xiàn)狀及真正理解藥物耐藥性產(chǎn)生的分子機制對減少耐藥性的發(fā)生至關(guān)重要。

1 白念珠菌的耐藥現(xiàn)狀

唑類、多烯類、棘白菌素類是臨床治療念珠菌感染常用的抗真菌藥物，但隨著臨床上的廣泛使用，白念珠菌對這些藥物的耐藥性不斷增加。據(jù)美國疾控中心(CDC)統(tǒng)計，念珠菌感染患者的血液樣本中，約有7%對氟康唑有耐藥性[12]。全球SENTRY監(jiān)測顯示，來自31個國家臨床分離的1846株真菌中，白念珠菌對氟康唑的耐藥率11.9%，印度對加爾各答市內(nèi)醫(yī)院中念珠菌耐藥性的調(diào)查結(jié)果顯示，10.7%、21.4%及53.6%的白念珠菌分別對伏立康唑、伊曲康唑和兩性霉素B耐藥[13]。我國白念珠菌對氟康唑耐藥率小于6%、劑量依賴性敏感(SDD)率為4.35%，對伏立康唑耐藥率和中介率均為2.17%[12]。美國2012—2016年間調(diào)查結(jié)果顯示，白念珠菌對棘白素類藥物的耐藥率達(dá)0.9%[14]，加拿大血流感染相關(guān)的念珠菌分離株中，白念珠菌對米卡芬凈的耐藥率為0.1%[15]，亞太地區(qū)白念珠菌對米卡芬凈的耐藥率為2.2%，對阿尼芬凈為2.1%～2.2%[16],澳大利亞分離的念珠菌對卡泊芬凈非敏感率為13.6%[17],明顯高于其他國家和地區(qū)。白念珠菌對多烯類藥物的敏感性高達(dá)95.00%，很少發(fā)生耐藥性，但白念珠菌生物膜形成后，對AmB和制霉菌素的敏感性明顯降低[18]?？梢姡瑹o論國內(nèi)還是國外，白念珠菌耐藥問題都較為嚴(yán)重。

2 白念珠菌耐藥機制的研究

目前發(fā)現(xiàn)的白念珠菌的耐藥機制主要包括藥物靶點的改變、藥物外排泵的過表達(dá)、代謝途徑的改變及適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)的啟動等方面。

2.1 對唑類藥物的耐藥機制

藥物靶點的改變 白念珠菌中唑類藥物靶酶基因ERG11的突變或過表達(dá)可使靶酶維持活性而產(chǎn)生耐藥。報道顯示，ERG11基因突變已發(fā)現(xiàn)有140個錯義突變，并證實Y123F、K143R、F449V和G464S等多個突變位點與白念珠菌對氟康唑耐藥有關(guān)[19]。ERG11的點突變，特別是發(fā)生在105-165、266-287、405-488氨基酸之間的3個“熱點”區(qū)域[20]，可以降低念珠菌對唑類藥物的敏感性。白念珠菌耐藥菌株中ERG11的過表達(dá)主要是由Upc2p的功能獲得性突變?nèi)鏕648D、G648S、A643T、A643V、Y642F、G304R、A646V、W478C等導(dǎo)致[21]。研究報道，ERG3是ERG11的上游基因，ERG3功能失活可導(dǎo)致白念珠菌對唑類藥物的耐藥[22]。白念珠菌與ERG3中的五種錯義突變(A168V、S191P、G261E、T329S和A353T)和另外兩種無義突變(Y325*和Y190*)相關(guān)，導(dǎo)致功能喪失[23]，雖然該耐藥機制較為罕見，但在臨床菌株中已觀察到此現(xiàn)象。

藥物外排泵的過表達(dá) 白念珠菌中藥物外排泵有2類：ABC轉(zhuǎn)運蛋白(CaCdr1和CaCdr2)和 MFS轉(zhuǎn)運蛋白(CaMdr1)。調(diào)控CaCDR1和CaCDR2表達(dá)的CaTAC1以及調(diào)控CaMDR1表達(dá)的CaMRR1發(fā)生突變使得藥物外排泵過表達(dá)從而導(dǎo)致白念珠菌對唑類藥物耐藥[24]。ABC轉(zhuǎn)運體借助核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與ATP結(jié)合獲取能量完成外排，其中CaCdr1是唑類耐藥的主要決定因素，臨床分離物中Cdr1的缺失可使唑類耐藥降低4～8倍。最近的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運蛋白CaCdr6/Roa1的缺失使得TOR信號通路過度激活抑制了藥物的攝入，從而導(dǎo)致白念珠菌對唑類藥物的耐藥[25]。有研究還發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運蛋白 CaMlt1通過液泡攝取機制來調(diào)控白念珠菌對唑類藥物的耐藥[26]。另外，介體復(fù)合物在Tac1介導(dǎo)的唑類耐藥中起著重要作用，Tac1功能獲得突變體中介體尾模塊的缺失減少了CDR1的轉(zhuǎn)錄，從而增加了對氟康唑的敏感性[27]。MFS轉(zhuǎn)運體依靠電化學(xué)梯度擴散完成外排，在白念珠菌95個MFS轉(zhuǎn)運蛋白中，僅Mdr1參與了白念珠菌對唑類藥物的耐藥[20]。白念珠菌Swi/Snf染色質(zhì)重塑復(fù)合物被認(rèn)為是Mrr1的主要共激活因子，在功能菌株的Mrr1獲得中，Swi/Snf復(fù)合物的催化亞基SNF2的缺失導(dǎo)致Mdr1激活和對氟康唑耐藥的急劇降低[28]。

應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié) 熱休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)能夠通過calcium-calcineurin、MAPK以及Ras1-cAMP-PKA信號通路來調(diào)控白念珠菌對唑類藥物的耐藥[29]。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90的底物蛋白和Hsp90翻譯后修飾過程可以作為上游調(diào)控因子緩解耐藥性，甾醇C-22脫氫酶ERG5和磷脂酰肌醇-4激酶(PI4K)STT4能夠參與調(diào)控 Hsp90[30]。此外，金屬離子應(yīng)激能夠影響白念珠菌對唑類藥物的敏感性。有研究報道[31-32]，鐵離子的缺乏能夠?qū)е翪aERG11表達(dá)下調(diào)和ERG3上調(diào)，從而提高菌株對唑類藥物的敏感性，鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白Ftr1、Ftr2和Ftr11參與鐵離子介導(dǎo)的藥物敏感性。有研究還發(fā)現(xiàn)，CaUpc2和熱休克因子1(heat shock factor 1,Hsf1)參與鐵離子介導(dǎo)的藥物敏感性[33-34]。白念珠菌對唑類藥物的耐藥還與生物膜的生成有關(guān)。研究顯示，白念珠菌生物膜產(chǎn)生過程中，CaERG25和CaERG11的表達(dá)水平增高，從而導(dǎo)致其對唑類藥物的耐藥[31]。

2.2 對多烯類藥物的耐藥機制

念珠菌對多烯類藥物耐藥性的產(chǎn)生是通過降低藥物對膜的結(jié)合親和力或從膜中消耗麥角甾醇的酶的改變介導(dǎo)的。研究顯示[24，35]，白念珠菌ERG2、ERG3、ERG5或ERG11發(fā)生突變能夠?qū)е戮陮mB耐藥。AmB耐藥念珠菌分離株的適應(yīng)性和存活率嚴(yán)重依賴于Hsp90的表達(dá)和功能。因此，在白念珠菌耐藥菌株中抑制Hsp90的藥理學(xué)作用可以消除AmB抵抗。白念珠菌在接觸AmB后具有補償性抗氧化反應(yīng)，與AmB耐藥念珠菌的研究表明，活性氧(ROS)積累顯著減少，蛋白質(zhì)碳酸化減少，線粒體基礎(chǔ)呼吸減少，過氧化氫酶的產(chǎn)量也有顯著的增加[36]。另外,Rlm和Smil等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可調(diào)控念珠菌生物膜基質(zhì)主要成分β-葡聚糖的產(chǎn)生量，導(dǎo)致念珠菌對藥物耐藥[37]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，生物膜阻礙了抗菌藥物的滲透。然而，目前已知生物膜基質(zhì)網(wǎng)孔較抗菌藥物大得多，并且大多數(shù)抗菌藥物與生物膜基質(zhì)成分沒有發(fā)生相互作用[38]。因此,生物膜導(dǎo)致念珠菌發(fā)生耐藥觀點仍然尚待驗證。

2.3 對棘白菌素類藥物的耐藥機制

葡聚糖合酶既是棘白菌素藥物的靶標(biāo)也是耐藥位點[39]。1,3-β-葡聚糖合成酶編碼基因FKS1的突變能夠?qū)е掳啄钪榫鷮姿仡愃幬锬退帲c此相關(guān)的突變主要為S645P和S645F，且在易感菌株該區(qū)域突變情況下，對應(yīng)菌株耐壓性升高，導(dǎo)致棘白菌素類藥物的抗菌效果顯著降低[40-41]。白念珠菌除FKS1基因與棘白菌素耐藥相關(guān)外，還表達(dá)了FKS2和FKS3，最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KS2和FKS3作為FKS1表達(dá)的負(fù)調(diào)控子，當(dāng)白念珠菌中缺失FKS2和FKS3后，F(xiàn)KS1表達(dá)明顯上調(diào)進(jìn)而影響其對棘白素類藥物的敏感性[42]。同時，對臨床分離得到的白念珠菌耐藥株的檢測發(fā)現(xiàn)，Ser645發(fā)生突變的頻率最高，目前已發(fā)現(xiàn)3種突變,即S645P、S645F和S645Y，當(dāng)易感菌株中該區(qū)域發(fā)生突變，菌株會產(chǎn)生耐藥性[43]。白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子Cas5是影響真菌對棘白菌素耐受性的細(xì)胞因子，Cas5的純合缺失可降低FKS1介導(dǎo)的棘白細(xì)胞的耐藥性[44]。此外，鎂離子的缺乏造成白念珠菌中組氨酸激酶基因NIK1的突變，進(jìn)而抑制Hog1的激活提高菌株對卡泊芬凈的敏感性[31-32]。

2.4 對氟胞嘧啶的耐藥機制

對白念珠菌的基因組學(xué)研究證實，5-FC的耐藥性是由特殊菌株的隱性基因決定的，其中以FUR1基因突變最為常見。編碼UPRTase的FUR1基因在301位點突變,降低了5-FC轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物的能力，以及編碼胞嘧啶脫氨酶的FCA1基因發(fā)生突變可能導(dǎo)致藥物攝入減少，均可影響有毒化合物的代謝和在胞內(nèi)的聚集而導(dǎo)致耐藥等[39]。此外，胞嘧啶滲透酶、胞嘧啶脫氨酶功能缺陷或胸苷酸合酶活性改變也可能產(chǎn)生耐藥。

3 小 結(jié)

綜上所述，白念珠菌耐藥情況日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響著人類健康，盡管抗真菌藥物不斷發(fā)展，但新型藥物難以較快應(yīng)用于臨床。因此，在臨床工作中應(yīng)及早進(jìn)行藥敏試驗并根據(jù)結(jié)果調(diào)整藥物，最大限度地減少耐藥菌株的產(chǎn)生。另外，應(yīng)深入研究其耐藥機制，積極尋找新的藥物靶點以抑制耐藥率的上升，提高現(xiàn)有抗真菌藥物的療效。但白念珠菌的耐藥機制復(fù)雜，目前仍有許多機制了解不清，有待進(jìn)一步研究。