化學(xué)基因組學(xué)在抗真菌藥物研究中的應(yīng)用

高路 呂權(quán)真 甄誠(chéng) 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200072；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院軍特藥研究中心，上海 200433)

據(jù)估計(jì)，侵襲性真菌感染每年導(dǎo)致150～200萬(wàn)人死亡，超過(guò)了瘧疾的死亡人數(shù)。侵襲性真菌感染中最常見的致病真菌是白念珠菌，目前主要的抗真菌藥物有三類：氮唑類、多烯類及棘白菌素類。多烯類由于具有較大的腎毒性，制約了其在臨床上的應(yīng)用[1]。氮唑類和棘白菌素類藥物容易產(chǎn)生耐藥性。從20世紀(jì)90年代以來(lái)，許多潛在的靶點(diǎn)陸續(xù)被研究發(fā)現(xiàn)，但卻沒有產(chǎn)出能用于臨床的具有新作用機(jī)制的候選藥物[2]。

新的抗真菌藥物研發(fā)相對(duì)困難，主要原因是由于真菌與人類基因組具有高度同源性，且特異的靶點(diǎn)和通路的數(shù)量有限[3]。此外，傳統(tǒng)的抗感染藥物發(fā)現(xiàn)方式也遇到困難。Payne等[2]調(diào)查了葛蘭素史克一項(xiàng)通過(guò)高通量篩選驗(yàn)證67種藥物靶標(biāo)的研究，發(fā)現(xiàn)這一途徑的主要問(wèn)題在于無(wú)法確保所確定的靶點(diǎn)能否接觸到藥物并能夠被藥物抑制，成功率很低。另一方面，化學(xué)生物學(xué)由于與探針的親和力降低等原因，很難檢測(cè)到結(jié)合蛋白。

化學(xué)基因組學(xué)是一門由組合化學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)合在一起形成的融合性技術(shù)，借助高通量篩選手段，能夠在活細(xì)胞的全基因組水平上發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物的作用靶點(diǎn)，也可以利用構(gòu)建的基因表達(dá)調(diào)控菌株篩選作用于特定靶點(diǎn)的先導(dǎo)物?；瘜W(xué)基因組學(xué)已成為研究靶點(diǎn)和基因結(jié)構(gòu)功能的有效策略，為人們進(jìn)一步研究相關(guān)藥物提供了支持。

1 化學(xué)基因組學(xué)的技術(shù)發(fā)展

化學(xué)基因組學(xué)(chemogenomics/chemical genomics)的本質(zhì)是使用小分子化合物在活細(xì)胞上，利用全基因組掃描的方法去探測(cè)復(fù)雜的、以前未知的基因組靶標(biāo)和路徑。全基因組掃描的方法分為二種，一是宏基因組學(xué)(metagenomics)方法，二是GRACE或HIP菌庫(kù)方法。

1.1 宏基因組學(xué)方法

該方法通過(guò)直接從樣品中提取全部微生物的DNA，利用深度基因組測(cè)序研究樣品中所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。其研究路線是利用同源重組的方法將目標(biāo)基因的單個(gè)開放閱讀框(ORF)進(jìn)行重組替換，利用基因缺失突變菌株唯一的barcode序列對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，將數(shù)千個(gè)突變菌株混合培養(yǎng)，在化合物處理?xiàng)l件下競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，理論上對(duì)化合物生長(zhǎng)抑制最敏感的菌株即含有其單個(gè)等位基因被替換的靶基因。據(jù)此，可以研究一種化合物在同一培養(yǎng)皿樣本中對(duì)全部基因組基因的影響，通過(guò)深度測(cè)序，可以比較每個(gè)barcode序列的相對(duì)豐度來(lái)反映化合物與真菌細(xì)胞基因的相互作用。一般先篩選出有抑制真菌生長(zhǎng)繁殖活性先導(dǎo)物，然后利用含有barcode序列的突變菌株庫(kù)篩選出先導(dǎo)物的可能作用靶點(diǎn)，最后利用HIP和HEP菌株驗(yàn)證先導(dǎo)物的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步還要在分子水平上確證先導(dǎo)物與靶蛋白的相互作用及對(duì)靶蛋白功能的影響[4-5]。

宏基因組學(xué)方法依賴于轉(zhuǎn)座子的高效突變系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行全基因組的基因標(biāo)記[6]。Li等選用PB轉(zhuǎn)座子(從卷葉蛾中分離所得)，其優(yōu)勢(shì)在于，當(dāng)轉(zhuǎn)座子跳出供體位點(diǎn)時(shí)，不會(huì)留下任何痕跡，這樣就克服了傳統(tǒng)的二倍體白念珠菌中引入隨機(jī)突變的局限性。利用這個(gè)系統(tǒng)，他們構(gòu)建了一個(gè)覆蓋4791種基因的插入突變文庫(kù)。這個(gè)文庫(kù)的優(yōu)勢(shì)在于，PB轉(zhuǎn)座可以發(fā)生在各種基因元件中，因此插入突變體選擇多樣；其次PB轉(zhuǎn)座高頻且隨機(jī)，因此轉(zhuǎn)座子的分布基本均勻；再者，每個(gè)細(xì)胞只能發(fā)生一次PB轉(zhuǎn)座，因此很容易驗(yàn)證插入PB轉(zhuǎn)座子后的表型變化與突變基因的關(guān)系。還有文獻(xiàn)基于這項(xiàng)技術(shù)，開發(fā)了一套使用玉米轉(zhuǎn)座元件激活劑(Ac)/解離(Ds)的相關(guān)技術(shù)，在白念珠菌[7]中構(gòu)建全基因組插入突變文庫(kù)，該系統(tǒng)已與機(jī)器學(xué)習(xí)分析方法[8]一起用于預(yù)測(cè)基因功能的重要性。

這項(xiàng)技術(shù)可以應(yīng)用在多個(gè)方面，使全基因組基因功能快速喪失突變能夠顯著提高可用于研究白念珠菌的基因組信息的數(shù)量和質(zhì)量。其次PB插入也可以發(fā)生在基因間隔區(qū)，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列中的插入可能會(huì)改變鄰近基因的表達(dá)，這對(duì)揭示必需基因的功能特別有用。PB轉(zhuǎn)座子可以方便地添加可調(diào)控啟動(dòng)子構(gòu)建條件表達(dá)文庫(kù)。該系統(tǒng)還可用于其他單倍體念珠菌的基因敲除，如耳念珠菌[9]，從這種多重耐藥病原體的單倍體基因敲除文庫(kù)研究中獲得了大量的基因功能信息。

1.2 GRACE菌庫(kù)

Roemer[10]開發(fā)了一種劃時(shí)代的大規(guī)模白念珠菌必需基因鑒定方法，被稱為GRACE(gene replacement and conditional expression，基因替換和條件表達(dá))。GRACE菌株的構(gòu)建包括兩個(gè)連續(xù)操作[11-12](見圖1)，先是通過(guò)同源重組插入His3，從而敲除一個(gè)基因拷貝，爾后引入Tet啟動(dòng)子，使另一個(gè)基因拷貝被置于可調(diào)控啟動(dòng)子的控制之下。

圖1 GRACE(基因替換和條件表達(dá))菌株構(gòu)建方法[10]Fig.1 The GRACE method (gene replacement and conditional expression) of target validation[10]

第一步：利用PCR產(chǎn)生的含有HIS3可選標(biāo)記的中斷盒，轉(zhuǎn)化野生型白念珠菌起始菌株CaSS1，構(gòu)建雜合子菌株，其兩側(cè)帶有適當(dāng)?shù)耐葱蛄?，以精確替換目標(biāo)基因的一個(gè)等位基因。第二步：用PCR產(chǎn)生的四環(huán)素啟動(dòng)子替換盒轉(zhuǎn)化帶HIS3條碼的雜合子菌株，該盒含有可在白念珠菌表達(dá)的SAT-1顯性可選擇標(biāo)記。

他們?cè)诙纷欤夷蛔髀暤攸c(diǎn)豆子，我的眉毛是揚(yáng)起來(lái)的，嘴角是含著笑的。我知道，陸茂本司大愣子他們，羨慕死我了。他們要是知道我跟別呦呦有一腿，都能沖上來(lái)打我。

GRACE菌優(yōu)勢(shì)在于，因?yàn)槭艿秸{(diào)控，而使靶蛋白的表達(dá)大幅減少，這樣便大幅增加了該菌株對(duì)靶向該調(diào)控蛋白的先導(dǎo)物生長(zhǎng)抑制的敏感性，能夠在含有數(shù)千個(gè)靶標(biāo)集合中識(shí)別出先導(dǎo)物的特異性作用靶點(diǎn)。

Roemer等建立了一個(gè)“白念珠菌靶標(biāo)散點(diǎn)圖”，來(lái)顯示白念珠菌基因BLAST比對(duì)釀酒酵母基因和人類基因之間的相似性，并顯示于GRACE基因集(見圖2)，以便于對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行優(yōu)先排序。在這個(gè)靶標(biāo)圖中確定篩選藥物靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，一是該基因不僅對(duì)病原體的生長(zhǎng)至關(guān)重要，且受到抑制后會(huì)導(dǎo)致病原體的實(shí)際死亡，通過(guò)這種方式，必需靶點(diǎn)可以被歸類為“殺滅性靶點(diǎn)”，而影響細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂的靶點(diǎn)被命名為“靜態(tài)靶點(diǎn)”，從抗真菌活性來(lái)看，作用于殺滅性靶點(diǎn)的藥物要顯著優(yōu)于作用靜態(tài)靶點(diǎn)的藥物。二是該基因?qū)Σ≡w的生長(zhǎng)存活至關(guān)重要，但對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞影響不大或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒有同源基因，這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)在一定程度上決定了作用于該靶點(diǎn)藥物的安全性。

利用GRACE菌庫(kù)篩選到白念珠菌567個(gè)關(guān)鍵基因，BLAST分析這567個(gè)關(guān)鍵基因與釀酒酵母基因和人類基因之間的相似性(見圖2)，可以看出與釀酒酵母有高度保守性的基因和對(duì)人類沒有或顯示出較低保守性的基因(見圖2左上角)是潛在的抗真菌藥物靶點(diǎn)，與釀酒酵母基因和人類基因都顯示出較低保守性的靶點(diǎn)在圖2的左下角，作用于此類靶點(diǎn)的化合物可能只對(duì)白念珠菌有特異性作用。作為參照，幾個(gè)已知的藥物靶點(diǎn)顯示在圖2的左上部，包括ERG11、ERG1、FKS1，它們分別是抗真菌治療藥物氮唑類、特比萘芬、棘白菌素類的作用靶點(diǎn)。

圖2 白念珠菌與釀酒酵母和人類基因的相似性散點(diǎn)圖[10]Fig.2 Similarity scatter map of 567 key genes of Candida albicans with Saccharomyces cerevisiae and human genes by BLAST analysis[10]

散點(diǎn)圖顯示了白念珠菌567個(gè)基本基因在與釀酒酵母和人類進(jìn)行同源性比較時(shí)所占據(jù)的空間位置?？v坐標(biāo)表示與釀酒酵母中基因的相似性，橫坐標(biāo)表示與人類基因的相似性。

1.3 HIP、HOP和HEP分析

將二倍體真核生物如白念珠菌的某個(gè)基因敲除一個(gè)等位基因，即構(gòu)建成為HIP(haploinsufficiency profiling，單倍體基因產(chǎn)物不足分析)菌株，多個(gè)HIP菌株集合即為HIP菌庫(kù)。HIP菌株更容易被作用于該靶點(diǎn)的藥物引起單倍體功能不全[13]，導(dǎo)致該基因產(chǎn)物不足以維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，從而增加該單倍體菌株對(duì)藥物的敏感性[13-14]，利用HIP菌株的這一特性可以驗(yàn)證化合物的作用靶點(diǎn)，利用HIP菌庫(kù)的這一特性也可以篩查出化合物的作用靶點(diǎn)。單個(gè)等位基因缺失菌株，會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷表型以及缺失基因的DNA豐度降低，因此可以用更少劑量的抑制劑來(lái)抑制缺失藥物靶點(diǎn)單等位基因的雜合子。敏感性的測(cè)量可以通過(guò)觀察藥物靶標(biāo)基因的一個(gè)拷貝缺失的雜合菌株的生長(zhǎng)或健康缺陷(fitness defect,FD)來(lái)實(shí)現(xiàn)[15-16]。

HOP(homozygous profiling，純合缺失菌分析)是指敲除二倍體生物中某個(gè)基因的二個(gè)等位基因，獲得基因缺失菌株純合子。由于基因被完全敲除，在HOP實(shí)驗(yàn)中，如果缺失菌株對(duì)化合物敏感性增加，該化合物可能是靶向抑制與被敲除的基因功能相似或者存在相互作用的基因產(chǎn)物，HOP菌株也常被用于研究真核細(xì)胞中生長(zhǎng)非必需基因的功能[16-17]。該分析方法不能直接找出化合物的作用靶點(diǎn)，但是發(fā)現(xiàn)能與該非必需基因功能相似或存在相互作用的其他基因。將化學(xué)基因組學(xué)與基因組相互作用分析做整合，可以預(yù)測(cè)化合物作用的信號(hào)通路機(jī)制。

HEP(high expression profiling)指的是對(duì)目的基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)分析。不同于對(duì)基因進(jìn)行缺失突變來(lái)研究化合物與基因產(chǎn)物之間的相互作用，而通過(guò)提高某個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量，使細(xì)胞對(duì)靶向該基因產(chǎn)物的活性化合物的抗性增加[14]。這種分析方法可以與HIP和HOP分析形成互補(bǔ)，進(jìn)一步確證化合物的作用靶點(diǎn)。在對(duì)mTOR的研究中就發(fā)現(xiàn)如果其基因過(guò)度表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞對(duì)雷帕霉素和抑制劑LY-83583的敏感性[18]。

1.4 合成遺傳陣列(SGA)

SGA(synthetic genetic array)是一種大規(guī)模研究基因相互作用的自動(dòng)化技術(shù)。當(dāng)不同基因擾動(dòng)的組合導(dǎo)致意想不到的表型(例如合成致死性)時(shí)，就表明組合元件之間發(fā)生了交互作用，若兩個(gè)原本可存活的突變結(jié)合在一起能產(chǎn)生致死或嚴(yán)重功能障礙的雙突變表型，則表明這2個(gè)突變?cè)g發(fā)生了交互作用[19-20]。全基因組SGA分析根據(jù)基因交互作用圖譜相似性生成了芽殖酵母的全部基因互作圖。屬于同一生物途徑的基因往往具有相似的給基因相互作用模式，因此基因相互作用圖譜提供了每個(gè)基因生物學(xué)功能的定量描述。這使得許多基因可以在中等強(qiáng)度的相似性閾值下注釋到一般的生物過(guò)程，如DNA復(fù)制、RNA剪接、蛋白質(zhì)降解和核質(zhì)輸入，或者在較高的強(qiáng)度的相似性閾值下注釋到特定的蛋白質(zhì)復(fù)合體和信號(hào)通路，如蛋白酶體、液泡H+ATPase和蛋白激酶C途徑等。

2 化學(xué)基因組學(xué)在抗真菌藥物研究中的應(yīng)用

2.1 靶向糖基磷脂酰肌醇(GPI)前體生物合成[21]

Mann等建立了一個(gè)白念珠菌生長(zhǎng)適應(yīng)性試驗(yàn)平臺(tái)，用于篩選合成或天然產(chǎn)物，鑒定作用于特異性靶標(biāo)的抑制劑[10,22-23]。該平臺(tái)是基于HIP的原理，包含了5 400個(gè)雜合菌株，覆蓋近90%的白念珠菌基因組，每個(gè)雜合菌株具有兩條特殊的分子條形碼?；旌瞎才囵B(yǎng)這些雜合菌株，然后對(duì)所有條形碼進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光標(biāo)記、微陣列雜交和分析，這樣可以確定經(jīng)過(guò)藥物處理后對(duì)比模擬處理的每個(gè)菌株的相對(duì)豐度，通過(guò)觀察化合物作用后菌株的生長(zhǎng)適應(yīng)性改變，篩查化合物作用的靶點(diǎn)基因。他們最終篩選出影響GPI前體生物合成的化合物G884和G365(見圖3)，白念珠菌GWT1雜合子(編碼參與GPI前體合成的酶)對(duì)其表現(xiàn)出超敏反應(yīng)，提示這兩種化合物的作用靶點(diǎn)可能是GWT1。

圖3 預(yù)測(cè)抑制劑靶向的GPI前體生物合成的酶促步驟[21]Fig.3 Chemical genomics-based antifungal drug discovery: Targeting glycosylphosphatidylinositol (GPI) precursor biosynthesis[21]

GPI負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，將GPI連接到蛋白質(zhì)的C末端的酰胺基上，GPI修飾的蛋白質(zhì)錨定在真菌細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上，對(duì)真菌的菌絲形成、生長(zhǎng)繁殖、黏附、毒力等過(guò)程均產(chǎn)生重要影響。GPI雖然在真核生物中具有保守性，但真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間存在巨大的功能重要性差異，因此是一個(gè)比較合適的藥物靶點(diǎn)。

G884、G365、G642在Gwt1編碼參與早期GPI前體合成的GlcN-PI酰基轉(zhuǎn)移酶時(shí)發(fā)揮作用，參與阻斷GlcNAc-PI的生物合成。而M743通過(guò)阻斷Mcd4介導(dǎo)的GPI前體的MAN1的EtNP轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)抑制GPI生物合成。

除了上述工作，他們還鑒定了M743(亦稱YW3548)及其半合成類似物M720，證明其通過(guò)阻斷Mcd4介導(dǎo)的GPI前體的Man1的EtNP轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)抑制GPI的生物功能。同樣，Mcd4雜合子對(duì)M743和M720具有極其高的特異性超敏反應(yīng)，證明了Mcd4可以是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。

在進(jìn)一步的研究中，使用這些化合物作為探針，證明Mcd4和Gwt1的抑制可以廣泛阻止真菌病原體的生長(zhǎng)，并促進(jìn)病原識(shí)別相關(guān)模式分子的暴露，有利于宿主對(duì)真菌細(xì)胞的免疫識(shí)別。此外Gwt1和Mcd4抑制劑聯(lián)用也觀察到了很強(qiáng)的協(xié)同作用，反映了聯(lián)合GWT1和MCD4的條件突變能展示出合成致命性，證實(shí)GPI錨合成途徑是一個(gè)有希望的抗真菌靶點(diǎn)區(qū)。

2.2 化學(xué)基因組學(xué)預(yù)測(cè)小分子的作用機(jī)制

基于“關(guān)聯(lián)推定”方法，對(duì)未知作用機(jī)制的化合物可以通過(guò)與已知機(jī)制化合物的作用特征相似性進(jìn)行預(yù)測(cè)[24-25]。傳統(tǒng)的化合物機(jī)制研究是通過(guò)使基因功能失活，之后進(jìn)行基因篩查。Lee等[26]使用酵母基因組HIP和HOP化學(xué)基因組平臺(tái)[15-16,27]篩選3 250種化合物，表征細(xì)胞在受到小分子擾動(dòng)后產(chǎn)生的特征性反應(yīng)，即對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行全基因組分析，發(fā)現(xiàn)化合物導(dǎo)致的每個(gè)菌株的適應(yīng)性缺陷，篩選出化合物對(duì)應(yīng)的敏感性升高的缺失基因株[26]。按照這種方法，他們識(shí)別出了317種化合物，這些化合物可以擾亂121個(gè)必需基因的功能，這些化合物被命名為“化學(xué)-基因探針”，與之相互作用的基因靶點(diǎn)被稱為“HIP hit”，這些化合物探針若影響到酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的同源蛋白，還可以推測(cè)這些未知化合物在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的可能功能。利用基因缺失菌株的生長(zhǎng)適應(yīng)性缺陷分析，他們成功地在HIP分析中鎖定陽(yáng)性對(duì)照化合物氟康唑的作用靶標(biāo)Erg11，在HOP分析中識(shí)別出與ERG11功能相關(guān)的直接通路(如，甾醇生物合成)和間接通路(如，鐵離子穩(wěn)態(tài))。

2.3 發(fā)現(xiàn)F901318抑制二氫乳清酸脫氫酶

F901318的作用機(jī)制由Oliver等[28]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)901318是基于體外活性篩選發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)效抗煙曲霉活性的化合物，目前正處于臨床開發(fā)階段，擬用于治療侵襲性曲霉病。首先，Oliver等體外篩選了抗曲霉的化合物庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了有一類化合物具有良好的抗曲霉活性，但對(duì)念珠菌和隱球菌無(wú)效，這類化合物基于體外活性的經(jīng)典構(gòu)效關(guān)系設(shè)計(jì)，倍命名為F3系列化合物，其中藥效最好的化合物為F901318(olorofilm)。他們將構(gòu)巢曲霉基因高表達(dá)文庫(kù)用F901318處理，對(duì)獲得的抗性克隆提取DNA，對(duì)基因組插入片段測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了pyrE基因，該基因編碼二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證F901318與DHODH的相互作用，他們分別構(gòu)建了pyrE的高表達(dá)質(zhì)粒和pyrE破壞質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染構(gòu)巢曲霉，發(fā)現(xiàn)含有pyrE高表達(dá)質(zhì)粒的菌株表現(xiàn)出對(duì)化合物的抵抗，而含有pyrE被破壞質(zhì)粒的菌株對(duì)化合物的敏感性與野生型相似，從而在基因組水平上證實(shí)編碼F901318的靶點(diǎn)是DHODH。

DHODH催化嘧啶合成途徑中的關(guān)鍵步驟，使二氫甲酸轉(zhuǎn)化為甲酸，免疫抑制劑來(lái)氟米特能抑制人的DHODH，而F90318能選擇性抑制曲霉的DHODH，對(duì)人的DHODH的抑制活性較弱。之后通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)也驗(yàn)證了F901318干擾了嘧啶的生物合成。此外還發(fā)現(xiàn)，如果靶向干擾嘧啶合成，煙曲霉、白念珠菌等的毒力均減弱，這也為我們提供了一個(gè)全新的抗真菌策略。

2.4 利用高分辨化學(xué)基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)麥角靈(NGx04)的靶點(diǎn)為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sec14p

新生假單胞菌的毒力主要依賴其分泌機(jī)制，其發(fā)揮毒力所需的大多為胞外因子。目前已發(fā)現(xiàn)三種sec蛋白即Sec4p、Sec6p和Sec14p，都與毒力必需因子的分泌有關(guān)，而Sec14還是真菌生長(zhǎng)的必需基因[29]，因此有可能成為新的抗真菌靶點(diǎn)[30]。

Filipuzzi等[31]采用了化學(xué)基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)了Sec14p抑制劑NGx04，即利用Sec14的HIP釀酒酵母菌株篩選了4 000多個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)只有NGx04表現(xiàn)超敏。進(jìn)一步利用HIP釀酒酵母菌庫(kù)篩選NGx04的敏感或耐受基因，發(fā)現(xiàn)KES1(反向調(diào)節(jié)Sec14p分泌依賴的蛋白質(zhì))HIP菌對(duì)NGx04適應(yīng)性最強(qiáng)，而Sec14的HIP菌株對(duì)NGx04最敏感。NGx04的HOP分析發(fā)現(xiàn)編碼磷脂酶D的調(diào)節(jié)亞基(SRF1)和催化亞基(SPO14)的基因純合缺失菌和編碼肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的itr1基因純合缺失菌對(duì)NGx04敏感，而磷脂酶D是Sec14p的底物。上述結(jié)果表明表明NGx04是在磷脂酰肌醇和Sec14p水平上干擾真菌細(xì)胞的活性。采取飽和突變篩選方法[32]，將誘導(dǎo)的Sec14p變異株種植到含有NGx04的培養(yǎng)基上，分離出編碼Sec14p的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)共產(chǎn)生四種突變，且后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明這四個(gè)突變都可以引起菌株對(duì)NGx04的耐藥性，從而進(jìn)一步支持Sec14p是NGx04的靶點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)了NGx04的活性相關(guān)位點(diǎn)。

3 討 論

自1990年代以來(lái)，基因組學(xué)的發(fā)展加速了藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)通常是在疾病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，改變病理性靶蛋白的活性為新藥的發(fā)現(xiàn)提供了合理的基礎(chǔ)。而以靶點(diǎn)為中心藥物研發(fā)策略，其成功率正迅速下降，而篩選成本卻在增加。這主要是因?yàn)樵摬呗噪m然明確了化合物的作用機(jī)制，但該化合物是否有好的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，能否在體內(nèi)病變部位達(dá)到有效濃度，能否進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)到達(dá)靶點(diǎn)所在亞結(jié)構(gòu)并抑制其活性，這一系列問(wèn)題都可能是導(dǎo)致化合物走向失敗的原因?；瘜W(xué)基因組學(xué)提供了一種在活細(xì)胞上研究有效化合物作用靶點(diǎn)的有效策略。

創(chuàng)新性抗真菌藥物的研發(fā)常采用由先導(dǎo)物到靶點(diǎn)的研究策略，一是因?yàn)榛谡婢?xì)胞生長(zhǎng)抑制或殺滅的篩選方法相比那些基于靶分子的篩選方法既高效且可靠；二是因?yàn)檎婢械鞍坠δ艿难芯窟h(yuǎn)不如哺乳動(dòng)物細(xì)胞那樣透徹；三是因?yàn)榇嬖谏鲜鲆幌盗袑?dǎo)致失敗的隱患。因此抗真菌藥物研發(fā)目前常用的策略是，先大規(guī)模篩選獲得有較好抗真菌活性的化合物，再利用化學(xué)基因組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)化合物的作用靶點(diǎn)，然后在分子水平上驗(yàn)證化合物和靶蛋白的相互作用，為化合物的進(jìn)一步優(yōu)化改造提供指導(dǎo)信息，期間穿插著對(duì)重點(diǎn)目標(biāo)化合物的成藥性評(píng)價(jià)。該策略的不足是在研發(fā)早期對(duì)化合物的優(yōu)化改造相對(duì)是盲目的。

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)基因組學(xué)研究也在向著更加快捷的方向發(fā)展。過(guò)去常采用構(gòu)建覆蓋幾乎全基因組的HIP菌庫(kù)或GRACE菌庫(kù)的策略，用于篩查有效抗真菌化合物的敏感基因或耐受基因，然后進(jìn)一步采用HIP菌株和HEP菌株驗(yàn)證化合物與靶基因的相互作用。這樣做的缺點(diǎn)是針對(duì)每一個(gè)化合物都要測(cè)試幾千個(gè)HIP或GRACE菌株，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。現(xiàn)在嘗試?yán)酶咝мD(zhuǎn)座子攜帶特異性標(biāo)簽來(lái)破壞目的基因的單個(gè)拷貝，實(shí)現(xiàn)每個(gè)克隆破壞1個(gè)目的基因，將數(shù)萬(wàn)個(gè)克隆混合起來(lái)培養(yǎng)，通過(guò)比較加藥處理與不加藥處理混合菌群的DNA深度測(cè)序結(jié)果，可以了解每個(gè)單拷貝破壞基因菌株的生長(zhǎng)豐度，以此篩選出對(duì)化合物敏感或耐受的基因，為抗真菌化合物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供可靠線索。