可控性生物吸收鎳合金藥物洗脫支架對支架內(nèi)再狹窄的作用與安全性分析研究

張雷，李多禹，徐輝

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerosis heart disease，簡稱冠心?。┦侵敢怨跔顒用}狹窄血管的動脈粥樣硬化為特征，導致微血管通道阻塞或部分阻塞，導致局部缺血、缺氧窒息或心肌組織壞死的血管疾?。?-2］。近年來高血壓的發(fā)病人數(shù)逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢［3］。世界范圍內(nèi)，冠心病已成為人類慢性病的主要死因。亞太地區(qū)人群因冠心病死亡的人數(shù)為892 萬［4］。目前，冠心病已經(jīng)成為危害人類生命健康的主要疾病之一，但隨著現(xiàn)代醫(yī)學的不斷進步，自1986 年金屬支架首次置入冠狀動脈以來，經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（PCI）在臨床中得到了極大的推廣和應用，大幅度提高了冠心病患者的生存率［5-6］。但PCI 術(shù)后的并發(fā)癥成為臨床主要關(guān)注的問題，特別是術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生，其發(fā)生機制復雜，一旦形成患者將面臨手術(shù)失敗的風險，而且嚴重加重患者的經(jīng)濟負擔，因此，分析PCI 術(shù)后發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的風險，采取積極有效手段預防其發(fā)生，成為目前臨床研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，PCI 前的血管疾病特征直接影響介入手術(shù)預后，并且某些因素與支架內(nèi)再狹窄（ISR）形成呈正相關(guān)：左冠狀動脈主要口狹窄病變的再狹窄率高于其他類型和分支病變［7］。介入手術(shù)操作、選用支架種類和匹配程度也在ISR 形成中起到關(guān)鍵作用。鎳可以通過多種機制抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。本研究將鍍鎳支架置于新西蘭大白兔的腹主動脈，以不銹鋼金屬裸支架為對照組，以術(shù)后30 d為觀察終點，對比病理切片動脈內(nèi)膜增殖情況以觀察其有效性，檢測細胞凋亡及增殖情況，以探討其作用機制，并對炎癥、損傷、內(nèi)皮化積分進行測定，同時于術(shù)前及術(shù)后30 d 查全血常規(guī)、肝功能、腎功能指標，取重要臟器觀察大體及病理情況以評估系統(tǒng)安全性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取20 只健康的雄性新西蘭大白兔，體重2.5～3.0 kg，4～6 個月齡。實驗動物由北京協(xié)和醫(yī)院動物實驗科提供。隨機分到不銹鋼裸支架（316L 不銹鋼裸支架，哈爾濱工業(yè)大學提供）組（BMS 組）和鍍鎳不銹鋼支架（哈爾濱工業(yè)大學提供）組（Ni-BMS 組），每組10 只，支架植入術(shù)后30 d 為觀察終點。兔子適應性喂養(yǎng)3 d，術(shù)前3 d 開始喂服，術(shù)前動物嚴格禁食12 h，準確測量體重。將支架預裝于球囊上，所有手術(shù)器械消毒后備用。本研究對大白兔的處置符合動物倫理學標準。

1.2 模型制備 實驗兔子經(jīng)耳緣靜脈進行麻醉，將25% 濃度的烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司）以4 ml/kg 的劑量緩慢靜脈推注。于右側(cè)大腿部位備皮，以彎剪剪去手術(shù)視野的毛，聚維酮碘消毒后鋪無菌巾及孔巾，以巾鉗固定，在股動脈搏動明顯處上方，沿其走行，將皮膚切開，鈍性分離皮下組織、肌肉，剝離股動脈鞘，以更好的暴露股動脈，于其下穿3 條線備用，一條線用于結(jié)扎遠端股動脈，由于剝離時可能導致股動脈痙攣，給予溫熱鹽水紗布熱敷，并于股動脈給予1%利多卡因（中國大冢制藥有限公司）局部浸潤，對局部血管運動神經(jīng)的阻斷可使血管擴張，以利于插管。應用21G 橈動脈穿刺針直視下穿刺股動脈，成功后，撥出針芯，沿穿刺針送入導絲，拔出針鞘，沿導絲送入5F 橈動脈鞘，進入2～3 cm，為防止鞘管脫出，應用備用線將其結(jié)扎于鞘管之上股動脈上方固定，將導絲和擴張器拔出，經(jīng)動脈鞘管的三通管抽血后待化驗，之后將肝素以100 μl/kg 的劑量注入，使其肝素化，防止在血管內(nèi)走行器械時出現(xiàn)血栓形成。經(jīng)鞘管送入0.036 cm 導引鋼絲至腹主動脈，經(jīng)動脈鞘三通管注入造影劑，造影確認導絲位于血管真腔內(nèi)，沿導引鋼絲送入球囊導管，將預裝支架的球囊導管沿引導鋼絲送入腹主動脈下段，距髂動脈分叉處約4～5 cm 處，定位后固定導絲、球囊導管，用造影劑充盈壓力泵，加壓至6.81～1.42 MPa（8～14 ATM），持續(xù)20 s，將裝置支架的球囊以1.1～1.2 倍于血管內(nèi)徑的直徑比進行擴張，待支架完全貼壁后，將球囊抽成負壓后撤出，每只兔子均于支架植入15 min 后重復造影，確認管腔通暢，支架貼壁良好，沒有明顯撕裂、管壁夾層、栓塞、支架移位及動脈痙攣，退出導絲，術(shù)后結(jié)扎股動脈，逐層縫合皮下及皮膚組織，于兔的腰椎旁側(cè)的肌肉常規(guī)注射青霉素480 萬U/d，3 d，預防感染。待動物清醒后送回籠中，如于術(shù)后2 d 食欲下降，給予胡蘿卜喂養(yǎng)，食欲改善后繼續(xù)全飼料喂養(yǎng)至30 d。

1.3 標本采集 術(shù)后30 d，將2 組實驗動物以空氣栓塞法處死，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣20～40 ml，迅速剖腹，取出目標血管，包括支架段血管、支架近端25 mm、支架遠端10 mm 段，清除脂肪組織，將5F 橈動脈鞘插入支架近端10～15 mm，用線結(jié)扎固定，將動脈鞘管芯拔出，三通管連于250 ml 生理鹽水輸液器上，將血壓計袖帶綁于生理鹽水袋上，加壓至100～120 mmHg，連續(xù)灌注，沖洗血管，隨著袋中液體減少，適當增加袖帶壓，保持液體流速基本恒定，確認血管通暢、無陳舊性血栓閉塞后，換用裝有4%多聚甲醛的固定液繼續(xù)加壓灌注，持續(xù)10～15 min。然后于支架近端10 mm處用眼科剪子剪斷。將目標血管應用顯微外科刀小心剪成2 個部分，于4%多聚甲醛中固定過夜（不超過24 h），固定好后，為更好觀察組織與細胞關(guān)系，防止由于支架絲抽出后對內(nèi)膜的影響，可將一部分血管行有機玻璃包埋及硬組織切片，后行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色。另一部分血管標本，為避免金屬支架對免疫組化結(jié)果分析的影響，先將血管切成前、中、后3 段，再用顯微外科鑷子小心抽出支架絲，放入塑料包埋盒，行石蠟包埋及切片，切片厚度4 μm，HE 染色，原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡，免疫組化鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法（SABC）檢測細胞增殖指標。

1.4 檢測指標 大體病理：肉眼可見管腔通暢，腔內(nèi)無血栓形成，支架貼壁良好，于支架表面可見呈半透明樣的內(nèi)膜，無明顯增厚。于德國LEICA 共覽顯微鏡25 倍鏡下，選取有機玻璃包埋后經(jīng)HE 染色的切片，拍攝數(shù)碼相片，并于圖片上加標尺，選用Image-Pro-Plus 6.0 圖像分析軟件校正標尺后，可將測量的像素值轉(zhuǎn)換為實際的幾何數(shù)值。對于校正標尺定標后測量來說，不同放大倍數(shù)要分別應用對應設(shè)定的標尺，否則會引起測量值錯誤。確定標尺后測量及計算內(nèi)、外彈力膜圍繞面積，管腔面積，陽性細胞數(shù)及全部有參考價值（area of interest）區(qū)域內(nèi)的全部細胞數(shù)。管腔各圍繞面積狹窄百分比測定：管腔面積、內(nèi)彈力板（IEL）面積、外彈力板圍繞面積（EEL）、新生內(nèi)膜面積=IEL 圍繞面積-管腔面積、面積狹窄百分比（%）=（新生內(nèi)膜面積/IEL 圍繞面積）×100%；損傷積分：0 分=內(nèi)彈力板完整，1 分=內(nèi)彈力板斷裂，2 分=內(nèi)彈力板和中膜斷裂，3 分=外彈力板斷裂。炎癥積分［8］：0 分=無炎癥細胞，1 分=散在炎癥細胞，2 分=25%～50%血管周徑內(nèi)的支架點被炎癥細胞包繞50%，3 分=25%～50%血管周徑內(nèi)的支架點被炎癥細胞完全包繞。內(nèi)皮化積分：0 分=無內(nèi)皮再生，1 分=小于25% 的管腔面可見新生內(nèi)皮覆蓋，2 分=25%～75%的管腔面可見新生內(nèi)皮覆蓋，3 分=大于75%的管腔被內(nèi)皮覆蓋；中膜細胞增殖細胞核抗原（PCNA）免疫組化結(jié)果觀測指標：采用SABC 法檢測血管內(nèi)膜、PCNA 免疫組織化學表達以確切的細胞核棕黃色或棕褐色定位陽性。隨機選擇5 個視野，求平均值。增殖細胞陽性指數(shù)（PI）=陽性細胞核數(shù)/單位面積全部細胞數(shù)。應用圖形分析軟件行半定量分析，校準標尺，測量單位面積內(nèi)陽性細胞數(shù)及全部細胞數(shù)，增殖細胞陽性指數(shù)（PI）=陽性細胞核數(shù)/單位面積全部細胞數(shù)。TUNEL細胞凋亡檢測結(jié)果觀測指標：顯微鏡下觀察到細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為凋亡陽性細胞，隨機選取5 個視野測定，計數(shù)其中陽性細胞核數(shù)，求均數(shù)。凋亡細胞陽性指數(shù)（AI）=陽性細胞核數(shù)/單位面積全部細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

實驗動物情況：在實驗中有2 只兔子死亡，其中1 只在導絲行進中遇阻力后旋轉(zhuǎn)導絲并向前推送，此時未感阻力，造影提示導絲位于血管真腔，但見造影劑向血管外彌散，提示可能為導絲穿透血管壁。另一只死于麻醉過度、呼吸抑制。補充2 只實驗動物，至觀察終點時間內(nèi)20 只實驗動物全部存活，全程未發(fā)現(xiàn)急性及亞急性血栓形成情況。

2.1 支架血管壁各圍繞面積及狹窄百分比比較Ni-BMS 組術(shù)后28 d 的管腔面積大于BMS 組（P＜0.05），Ni-BMS 組新生內(nèi)膜面積小于BMS 組（P＜0.05），Ni-BMS 組面積狹窄百分比小于BMS 組（P＜0.05）。見表1。

表1 Ni-BMS 組與BMS 組實驗動物血管壁各圍繞面積及狹窄百分比比較（± s）

表1 Ni-BMS 組與BMS 組實驗動物血管壁各圍繞面積及狹窄百分比比較（± s）

注：Ni-BMS 為鍍鎳不銹鋼支架，BMS 為不銹鋼裸支架

組別Ni-BMS 組BMS 組P 值面積狹窄百分比（%）15.88±7.58 27.91±2.75＜0.01動物數(shù)10 10管腔面積（mm2）2.92±0.24 2.52±0.18＜0.01內(nèi)彈力板面積（mm2）3.49±0.17 3.48±0.17 0.939外彈力板面積（mm2）4.34±0.16 4.35±0.17 0.904新生內(nèi)膜面積（mm2）0.56±0.30 0.97±0.09 0.001

2.2 3 種積分測量比較 Ni-BMS 組與BMS 組的損傷積分、炎癥積分及內(nèi)皮化積分差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 Ni-BMS 組與BMS 組實驗動物3 種積分的比較（分，± s，n=10）

表2 Ni-BMS 組與BMS 組實驗動物3 種積分的比較（分，± s，n=10）

注：Ni-BMS 為鍍鎳不銹鋼支架，BMS 為不銹鋼裸支架

組別Ni-BMS 組BMS 組P 值內(nèi)皮化積分2.80±0.42 3.00±0.00＞0.05炎癥積分1.10±0.32 1.20±0.42＞0.05損傷積分1.70±0.67 1.80±0.63＞0.05

2.3 細胞增殖、凋亡情況比較 BMS 組的PI（29.25 ± 1.37）大于Ni-BMS 組（18.42 ± 1.46），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）、Ni-BMS 組的AI（54.38± 10.52）大于BMS 組（25.12 ± 3.45），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 血液化驗指標比較 血常規(guī)：紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)2 組比較未見明顯差異（P＞0.05），肝功能：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶2 組比較未見明顯差異（P＞0.05），腎功能：肌酐值在2 組間比較未見明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表3 Ni-BMS 組與BMS 組實驗動物血液指標比較（± s，n=10）

表3 Ni-BMS 組與BMS 組實驗動物血液指標比較（± s，n=10）

注：Ni-BMS 鍍鎳不銹鋼支架，BMS 為不銹鋼裸支架

項目紅細胞（×1012/L）白細胞（×109/L）血小板（×109/L）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L）谷草轉(zhuǎn)氨酶（U/L）肌酐（μmol/L）時間（d）0 30 0 30 0 30 0 30 0 30 0 30 P 值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05 Ni-BMS 組5.59±0.59 5.57±0.57 7.06±1.68 7.18±1.36 272.92±26.51 275.06±22.34 58.98±10.68 59.33±11.86 54.50±10.81 54.51±11.48 99.65±15.43 98.68±15.38 BMS 組5.50±0.59 5.47±0.67 7.59±1.39 7.63±1.47 271.69±24.10 272.00±24.73 59.59±11.07 59.49±11.22 57.71±12.08 57.38±12.29 97.44±12.07 96.87±12.83

2.5 病理觀察結(jié)果 病理觀察2 組支架均未見到亞急性血栓形成、邊緣效應、支架表面被覆半透明樣內(nèi)膜，管腔通暢，支架張開良好。所有實驗動物處死后迅速取出重要臟器，肉眼見心臟、肺臟、肝臟、腎臟大體形態(tài)正常，病理組織學觀察各個臟器均未見變性、壞死及炎癥反應。

3 討論

冠狀動脈支架是指在管腔內(nèi)通過球囊擴張形成的支架，放置在冠狀動脈病變段，以達到支撐點處血管狹窄和閉塞，減少血管壁良好的彈性腫脹，重塑身體的最終目的，并長期保持更順暢的流動。一些內(nèi)支架在預防再狹窄方面也有明顯的作用［9］.生物醫(yī)用金屬由于其良好的生物功能和加工后的優(yōu)異性能，成為最早用于支架的材料［10］。裸金屬支架是治療冠狀動脈狹窄的有效方法。對于病位位于中、遠端和交叉口的其他病理微血管的患者，或易發(fā)生血管再狹窄、嚴重骨化、老年和心功能差的女性患者，藥物治療的安全性較低。然而，裸金屬支架往往會引起頸動脈支架處的炎癥反應，甚至非常嚴重的瘢痕增生相關(guān)組織炎癥，導致動脈再次狹窄，再狹窄率高達30%［11］。

與裸金屬支架相比，藥物洗脫支架能顯著降低支架置入后的再狹窄率，是目前治療高血壓病的技術(shù)手段之一［12］。Hong 等［13］的相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，藥物洗脫支架不僅可以大大降低血管再狹窄的發(fā)生概率，而且不會增加死亡、潛在風險，可以安全有效地應用于急性心肌缺血基底節(jié)區(qū)的治療。藥物洗脫支架支架對冠狀動脈和動脈血管疾病的長期病變也有良好的臨床效果。Kaltoft 等［14］的5 年隨訪研究結(jié)果顯示，ST 段抬高型心絞痛患者藥物洗脫支架相關(guān)治療繼發(fā)心臟不良事件的并發(fā)癥發(fā)生率顯著高于裸金屬支架，另一項研究成果對接受口服藥物翻轉(zhuǎn)固定器和裸純金屬支架治療的女性慢性心肌動脈阻塞患者進行了1 年的長期隨訪，結(jié)果表明，口服藥物翻轉(zhuǎn)支架應用的技術(shù)理想效果明顯優(yōu)于裸金屬支架，可顯著降低再狹窄率，靶區(qū)血液循環(huán)修復率提高61%，靶血管內(nèi)血液循環(huán)修復率提高62%，不良事件和心臟并發(fā)癥的發(fā)生率降低了59%，靶動脈疾病發(fā)生率降低53%［15］。國外有研究表明，從2000 年到2004 年，藥物洗脫固定器的應用比例從0% 上升到54%，再狹窄導致的靶病變血運重建率從9.5%下降到5.5%［16］。

近年來，一些研究表明，在體內(nèi)鎳離子可以引起多種不同的問題，例如癌癥、過敏及炎癥反應［17-19］。對于植入含鎳冠狀動脈支架患者來說，鎳離子過敏可能和血管內(nèi)再狹窄存在一定關(guān)聯(lián)［20-21］。同時研究發(fā)現(xiàn)金屬離子引起的細胞死亡主要方式是凋亡，存在濃度及時間依賴性［22-23］。目前經(jīng)常使用的支架金屬基質(zhì)包括316L 不銹鋼、鎳鈦合金、鈷鉻合金以及近年來研究較多的可降解鐵、鎂合金，在體內(nèi)的環(huán)境中都存在某種程度的金屬腐蝕現(xiàn)象。316L 不銹鋼支架約含有10%～14% 的鎳，鎳鈦合金含有50% 左右的鎳，由于出現(xiàn)某種程度的腐蝕，鎳離子會析出。在一些研究中發(fā)現(xiàn)鎳可以抑制細胞增殖、促進凋亡。Shih 等［24］研究表明采用以鎳鈦諾絲作為媒介會加速電化學腐蝕，展現(xiàn)出細胞毒性作用，同時改變細胞的形態(tài)，鎳離子濃度在9×10-6及以上時出現(xiàn)了顯著性生長抑制。一些體外研究研究表明增加鎳離子濃度當接近29×10-6時可以介導人類氣道上皮細胞的凋亡反應［25-26］。Shiao 等［27］首次報告了鎳離子在倉鼠卵巢細胞上誘導的細胞凋亡。之后Kim 等［28］研究采用相同濃度的鎳離子孵育T 型雜交瘤細胞觀察到快速的誘導細胞凋亡。Fuqin Guan 等［29］的研究表明鎳離子誘導的細胞凋亡作用呈現(xiàn)時間及濃度依賴性，細胞凋亡率與測得細胞活力數(shù)據(jù)一致，鎳離子的作用大多數(shù)是誘導細胞的凋亡。

本研究中，BMS 組炎癥積分與Ni-BMS 組差異無統(tǒng)計學意義，提示2 種支架在置入人體后所引起的炎癥反應相當。支架置入人體后表面內(nèi)皮化對血管的愈合十分重要，表面內(nèi)皮化可以抑制血管平滑肌細胞的增生及遷移。目前，藥物支架存在的問題之一為內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮化延遲，部分患者易出現(xiàn)晚期血栓形成。本研究將內(nèi)皮化積分作為測定指標，發(fā)現(xiàn)2 組內(nèi)皮化積分差異無統(tǒng)計學意義，提示鍍鎳支架可以完成早期的內(nèi)皮化。本研究還發(fā)現(xiàn)，Ni-BMS 組管腔面積大于BMS 組，新生內(nèi)膜面積、面積狹窄百分比小于BMS 組，提示鍍鎳支架在置人后的短期內(nèi)與金屬裸支架相比，具有抑制血管內(nèi)膜增殖的作用。本研究使用的鍍鎳支架觀察期內(nèi)未見血栓形成，未見邊緣效應、內(nèi)膜出血及動脈瘤，支架表面愈合良好，提示鍍鎳支架具有良好的局部安全性及生物相容性。

綜上所述，本研究首次采用目前廣泛應用的316L 不銹鋼作為金屬基質(zhì)，將金屬鎳電鍍于其表面制成新型鍍鎳不銹鋼支架，以316L 不銹鋼金屬裸支架作為對照組，比較探討鍍鎳支架的有效性及安全性，同時以免疫組化PCNA 探討細胞增殖情況，應用TUNEL 方法比較細胞凋亡情況，以初步探討鍍鎳不銹鋼支架通過抑制平滑肌細胞增殖，促進其凋亡抑制內(nèi)膜增生，預防再狹窄的發(fā)生機制。鍍鎳支架表面光滑，全身系統(tǒng)安全性良好，具有較好的生物相容性，同時這種支架無藥物失效期，無控制藥物釋放的聚合物涂層，可以減少再狹窄的發(fā)生。