硫醚類香料對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌的抑制作用

張 珂，周倩倩，畢景然，3，郝洪順，侯紅漫，3，張公亮，3*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034 2 大連工業(yè)大學(xué)紡織與材料工程學(xué)院 遼寧大連 116034 3 遼寧省水產(chǎn)品加工質(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧大連 116034）

近年來，由微生物引起的食物中毒越來越多，引起人們對(duì)食品安全問題的高度重視。一直以來都在使用抗生素治療食源性食物中毒，使細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，作用效果明顯降低[1]。亟需利用天然物質(zhì)來預(yù)防和控制食源性致病菌的污染和傳播。含硫香料是一種天然食品添加劑，常見于十字花科植物，具有食用安全、閾值低、特征性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有抗癌、抗菌等活性。硫醚類香料是含硫香料的一種，常見于蔥屬植物，化學(xué)通式為R-S-R。大蒜是一種公認(rèn)的功能性食品，攝入大蒜被證實(shí)可通過降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)等改善人類健康，且大蒜中的一些成分具有抗血栓、預(yù)防心血管疾病、抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化等作用[2-3]。大蒜不僅可作為食物，還具有多種活性成分，得到廣泛應(yīng)用[4-5]。大蒜油的蒸餾產(chǎn)物中含有多種硫醚類化合物，如二烯丙基硫醚（DAS）、烯丙基三硫醚（DATS）、二烯丙基二硫醚（DADS）等[4，6-7]。

沙門氏菌（Salmonella）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是兩種典型的革蘭氏陰性食源性致病菌。沙門氏菌常見于肉類，也存在于新鮮的水果蔬菜中，甚至可在土壤、糞便、水等環(huán)境中存活很久，它所引起的食物中毒在微生物性食物中毒中占很大比例[8-11]。副溶血性弧菌中等嗜鹽，主要呈弧狀、短棒狀等，常見于水產(chǎn)品及沿海環(huán)境中，與海鮮有關(guān)的細(xì)菌性腸胃炎主要是由副溶血弧菌直接或交叉污染引起的[12-13]。tdh 基因是副溶血性弧菌重要的毒力基因之一，它編碼耐熱性溶血毒素（TDH），從而溶解紅細(xì)胞，產(chǎn)生神奈川現(xiàn)象，是判斷副溶血性弧菌是否具有致病性的依據(jù)，可使菌體具有耐熱性并引起腹瀉等一系列癥狀[14-15]。鑒于此，有必要采取各種措施來減少沙門氏菌和副溶血性弧菌的污染。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，肉桂醛、香榧?xì)ぞ鸵约岸錀蠲匪氐忍烊晃镔|(zhì)可以抑制沙門氏菌和副溶血性弧菌[16-17]，異硫氰酸酯類香料也對(duì)這兩種菌有一定抑制作用[18]，異硫氰酸芐酯（BITC）可以通過對(duì)毒力基因的調(diào)控來抑制這兩種菌的毒性[19-20]。目前尚無(wú)硫醚類香料對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌抑菌作用的研究。

本研究根據(jù)GB 2760-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)，從中選取較常見的10種硫醚類香料，從抑菌活性、最小抑菌濃度、生長(zhǎng)曲線等多個(gè)方面分別研究它們對(duì)于沙門氏菌以及副溶血性弧菌兩種食源性致病菌的抑菌作用，并通過對(duì)比它們對(duì)這兩種菌抑制作用的不同，探討硫醚類香料結(jié)構(gòu)對(duì)其的抑菌效果，從而篩選抑菌效果最好的香料。通過qRT-PCR 試驗(yàn)，研究硫醚類香料作用下，副溶血性弧菌tdh 毒力基因的表達(dá)量差異，為天然含硫香料應(yīng)用于食源性致病菌的防治以及作為食品用抑菌劑提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 硫醚類香料

選出10 種硫醚類香料（表1），均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

表1 10 種硫醚類香料的名稱及結(jié)構(gòu)Table 1 Name and structure of 10 kinds of sulfide flavors

1.2 菌種及試劑

鼠傷寒沙門氏菌株（Salmonella，ATCC 14028），副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CGMCC 1.1614），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

RNA 提取試劑盒、溶菌酶、蛋白酶K、溴化乙錠（EB）等，北京天根生化有限公司；DNA Marker、6×Loading Buffer、5×M-MLV Buffer、RTase MMLV（RNase H-）、RNase Inhibitor、dNTP Mixture等，寶生物工程（大連）有限公司；DEPC Water、50×TAE、RNase-freeWater 等，生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、牛肉膏等，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 儀器及設(shè)備

YC-L 型層析實(shí)驗(yàn)冷柜，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZHJH-C1112C 型超凈工作臺(tái)、ZHWY-100B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；01J2003-04 型高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；MyiQTM2 型熒光定量PCR 儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；UV-1750 型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；202-OAB 型電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；DRP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.4 樣品處理及菌種活化

利用硫醚類香料的原液密度和分子質(zhì)量，求出稀釋所需的無(wú)水乙醇，并稀釋成濃度為5 mol/L的預(yù)混液備用。

于液體培養(yǎng)基中添加適量冷凍保存的菌種，并在37 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h。用上述菌液涂布平板，再次活化培養(yǎng)制成108CFU/mL 的菌懸液，備用。

1.5 抑菌活性的測(cè)定

根據(jù)張公亮等[21]采用的濾紙片法，取100 μL菌懸液涂布平板，平板中央放置直徑10 mm 的圓形濾紙片，滴加用乙醇稀釋好的不同濃度的硫醚類香料，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。陰性對(duì)照滴加同等體積的無(wú)水乙醇，重復(fù)3 次并取平均值。

1.6 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

根據(jù)1.5 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，以二烯丙基二硫醚（DADS）為研究對(duì)象，利用倍比肉湯稀釋法[22]，用乙醇將該香料從5 mol/L 稀釋到0.61 mmol/L，將不同濃度的香料、菌懸液按照一定比例分別加入到試管裝液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)好的液體進(jìn)行涂板培養(yǎng)并觀察，陽(yáng)性（+）表示培養(yǎng)基上有菌生長(zhǎng)，陰性（-）則無(wú)菌生長(zhǎng)。MIC 即為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小含硫香料濃度。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

向液體培養(yǎng)基中加入1 mL 濃度為108CFU/mL 的菌液及不同濃度的DADS，于37 ℃搖床下振蕩培養(yǎng)，每2 h 測(cè)定其600 nm 下的吸光值，并以吸光值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8 細(xì)菌總RNA 的提取及檢測(cè)

根據(jù)天根生化有限公司細(xì)菌總RNA 提取試劑盒的方法[23]，提取經(jīng)不同濃度香料處理12 h 后副溶血性弧菌的總RNA，并用分光光度計(jì)對(duì)RNA濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 qRT-PCR 法測(cè)定DADS 對(duì)副溶血性弧菌毒力基因表達(dá)的影響

目的基因?yàn)閠dh，內(nèi)參基因?yàn)?6S rRNA，引物序列如表2所示，并由生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并以總體系為25 μL 來進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，其中SYBRR Premix Ex TaqTM12.5 μL，引物對(duì)各0.5 μL，DEPC Water 9.5 μL，cDNA 模板2 μL。參數(shù)設(shè)置：95 ℃1 min；95 ℃20 s，62 ℃20 s，于80 ℃處停留15 s，收集熒光信號(hào)，循環(huán)40 次；在60～95 ℃范圍建立熔解曲線。通過2-⊿⊿CT計(jì)算tdh 基因相對(duì)表達(dá)量[24]。

表2 熒光定量PCR 基因引物序列Table 2 The primers for qPCR

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用http：//www.physics.csbsju.edu/stats/t-test.html 在線軟件進(jìn)行student's t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 具有顯著差異性，且P＜0.01 具有極顯著差異性。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫醚類香料對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌的抑菌效果

10 種硫醚類香料，在結(jié)構(gòu)上具備幾個(gè)特點(diǎn)。一部分為對(duì)稱性硫醚類香料，如二丙基二硫醚（DPDS）、二甲基三硫醚（DMTS）、二烯丙基硫醚（DAS）、二烯丙基二硫醚（DADS）和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）等，側(cè)鏈取代基及硫原子個(gè)數(shù)不同。還有一部分含有呋喃環(huán)，如2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）等。其中一些為同分異構(gòu)體，如甲基2-甲基-3-呋喃基二硫醚（MMFDS）、甲基糠基二硫醚（MFDS），化學(xué)式均為C6H8OS2。

5 mol/L 的各硫醚類香料對(duì)兩種菌的抑制效果見表3?？梢钥闯?，甲基丙基二硫醚（MPDS）、二丙基二硫醚（DPDS）、二甲基三硫醚（DMTS）、二烯丙基硫醚（DAS）、二烯丙基二硫醚（DADS）、2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）、糠基異丙基硫醚（FIPS）、甲基2-甲基-3-呋喃基二硫醚（MMFDS）、甲基糠基二硫醚（MFDS）和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）這10 種硫醚類香料對(duì)副溶血性弧菌都有不同的抑制效果，而二甲基三硫醚（DMTS）、甲基2- 甲基-3- 呋喃基二硫醚（MMFDS）、二丙基二硫醚（DPDS）、2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）和對(duì)沙門氏菌不具備抑菌能力。副溶血性弧菌比沙門氏菌對(duì)上述硫醚類香料更加敏感。

表3 硫醚類香料對(duì)供試菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effect of sulfide flavors on the tested bacteria

2.2 硫醚類香料對(duì)沙門氏菌的抑制作用

圖1為5 種對(duì)沙門氏菌有抑菌效果的硫醚類香料的抑菌圈結(jié)果，包括MPDS、DADS、DAS、MFDS 和FIPS，它們的抑制作用大小為DADS＞MFDS＞（MPDS≈DAS≈FIPS）。其中DADS 的抑菌圈直徑最大，為（1.54±0.04）cm，即抑菌效果最好，其次是直徑為（1.36±0.08）cm 的MFDS，而剩下的3 種硫化物MPDS、DAS 和FIPS 抑菌圈直徑幾乎相同。DADS 的抑菌活性比MPDS、DAS 顯著增高（P＜0.05），DADS 與MPDS 相比，多了兩個(gè)烯丙基，DADS 與DAS 相比，多了一個(gè)硫原子，可見硫醚類香料對(duì)沙門氏菌抑菌作用受到硫原子個(gè)數(shù)和烯丙基的影響。且含有呋喃基的對(duì)稱性硫醚類香料，如BMFDS 對(duì)沙門氏菌沒有抑制效果。

圖1 硫醚類香料對(duì)沙門氏菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of thioether spices on Salmonella

2.3 硫醚類香料對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用

圖2為10 種對(duì)副溶血性弧菌有抑菌效果的硫醚類香料的抑菌圈。與沙門氏菌相比，有抑菌效果的香料種類更多，且抑菌效果各不相同，其中，DADS、DAS、DPDS、MFDS、FIPS 和BMFDS 對(duì)副溶血性弧菌有很好的抑制作用。與沙門氏菌結(jié)果一致，DADS 抑制效果最強(qiáng)（P＜0.05），抑菌圈直徑達(dá)到了（4.49±0.32）cm。與2.2 節(jié)的結(jié)果相比，硫醚類香料對(duì)副溶血性弧菌比對(duì)沙門氏菌的抑制效果更顯著。DADS 與DPDS 相比，-S-S-側(cè)鏈兩邊多了雙鍵，變?yōu)橄┍ADS 的抑菌活性最好，這說明雙鍵的存在增強(qiáng)了抑制效果。當(dāng)同分異構(gòu)體的MMFDS 和MFDS 兩者進(jìn)行分析時(shí)，MFDS 的抑菌能力顯著強(qiáng)于MMFDS，反映出側(cè)鏈為糠基抑菌作用強(qiáng)于側(cè)鏈為呋喃基。

圖2 硫醚類香料對(duì)副溶血性弧菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of thioether spices on V.parahaemolyticus

2.4 二烯丙基二硫醚對(duì)兩種菌的MIC

表4為對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌抑菌作用都最強(qiáng)的二烯丙基二硫醚（DADS）對(duì)這兩種菌的最小抑菌濃度。從表4可以看出，當(dāng)DADS 濃度大于19.5 mmol/L 時(shí)，對(duì)兩種菌都有很好的抑制作用，且沙門氏菌對(duì)DADS 的敏感程度低于副溶血性弧菌。DADS 對(duì)沙門氏菌的MIC 為19.5 mmol/L，對(duì)副溶血性弧菌的MIC 為4.88 mmol/L。

表4 二烯丙基二硫醚對(duì)供試菌的MICTable 4 Minimum concentration of diallyl disulfide on tested bacteria

2.5 二烯丙基二硫醚對(duì)兩種菌生長(zhǎng)曲線的影響

測(cè)定二烯丙基二硫醚（DADS）對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線的影響。如圖3所示，空白組的沙門氏菌生長(zhǎng)曲線呈S 型，而在MIC 濃度的DADS 作用下OD 值沒有明顯改變，即細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)。當(dāng)添加的DADS 濃度為1/2 MIC 時(shí)，很大一部分細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)，且延滯期較長(zhǎng)。1/4 MIC 濃度下細(xì)菌與空白組差距很小，但仍有一部分細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制。綜上，沙門氏菌的生長(zhǎng)受DADS 的影響呈現(xiàn)出濃度依賴性。

圖3 DADS 對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線影響Fig.3 Effect of diallyl disulfide on the growth curve of Salmonella

如圖4所示，與沙門氏菌生長(zhǎng)曲線圖結(jié)果一致，與空白組相比，MIC 濃度的DADS 作用下，副溶血性弧菌的生長(zhǎng)完全被抑制，當(dāng)DADS 濃度為1/2 MIC 時(shí)，大部分菌的生長(zhǎng)被抑制，當(dāng)濃度逐漸

圖4 DADS 對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線影響Fig.4 Effect of diallyl disulfide on the growth curve of V.parahaemolyticus

2.6 二烯丙基二硫醚對(duì)副溶血性弧菌tdh 毒力基因表達(dá)的影響

選取對(duì)副溶血性弧菌有明顯抑菌效果的DADS，分析經(jīng)不同濃度DADS 作用后tdh 毒力基減小為1/4 MIC 時(shí)，菌的生長(zhǎng)與空白組差異較小，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。因的表達(dá)量差異。結(jié)果如圖5所示，不同濃度DADS 處理過的副溶血性弧菌中tdh 的表達(dá)量不同，隨著DADS 濃度的增加，tdh 毒力基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，與DADS 濃度呈負(fù)相關(guān)。與空白組相比，1/64 MIC 濃度的DADS 作用后tdh 基因表達(dá)量有所降低，但無(wú)顯著性差異。而DADS 濃度以二倍遞增，當(dāng)副溶血性弧菌被這些亞抑制濃度的DADS 作用后，毒力基因tdh 的表達(dá)量變化差異都極顯著，且當(dāng)DADS 濃度為1/4MIC 時(shí)，tdh 毒力基因下調(diào)了4.4 倍。由此可知，二烯丙基二硫醚對(duì)副溶血性弧菌tdh 毒力基因的作用效果呈劑量依賴性。

圖5 二烯丙基二硫醚對(duì)副溶血性弧菌tdh 基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of DADS on expression of tdh gene in V.parahaemolyticus

3 結(jié)論

1）在10 種硫醚類香料中，5 種對(duì)沙門氏菌有很強(qiáng)的作用效果，全部10 種對(duì)副溶血性弧菌有很強(qiáng)的作用效果，證明沙門氏菌對(duì)硫醚類香料的敏感程度低于副溶血性弧菌。其中二烯丙基二硫醚（DADS）對(duì)兩種菌的抑菌作用都最強(qiáng)，表明硫原子個(gè)數(shù)、烯丙基等可以增強(qiáng)硫醚類香料的抑菌作用。

2）DADS 對(duì)沙門氏菌的MIC 為19.5 mmol/L，對(duì)副溶血性弧菌的MIC 為4.88 mmol/L，與上述結(jié)論一致，副溶血性弧菌對(duì)硫醚類香料更加敏感。且這兩種致病菌的生長(zhǎng)受DADS 的影響呈現(xiàn)濃度依賴性。

3）在不同濃度DADS 的作用下，副溶血性弧菌的tdh 基因的表達(dá)量隨DADS 濃度增加而下調(diào)。其中DADS 濃度為1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC 時(shí)，tdh 毒力基因相對(duì)表達(dá)量變化均極顯著，通過抑制毒力基因的表達(dá)，從而抑制副溶血性弧菌的毒性。