超聲造影定量評估兔肝VX2腫瘤新生血管與CD34、血管內(nèi)皮生長因子的相關(guān)性研究*

程顥，阮驪韜，楊艷秋

（1.西安交通大學附屬陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院，陜西西安 710061；3.青海省第五人民醫(yī)院，青海西寧 810001）

腫瘤新生血管在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后過程中具有關(guān)鍵作用[1]。腫瘤新生血管的生成與血管內(nèi)皮生成因子的釋放密切相關(guān)，如CD34、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等的表達促進新生血管形成，加快腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[2]。在腫瘤患者的長期隨訪與遠期療效評估過程中，組織學方法觀察腫瘤新生血管是有創(chuàng)性的，多次重復測定不切實際。近年來影像學技術(shù)對腫瘤血管形態(tài)和功能的評估進展顯著，通過影像手段反映腫瘤新生血管及瘤內(nèi)微血管灌注情況已成為腫瘤診斷治療的研究熱點。其中超聲造影（contrast-enhanced ultrasound,CEUS）技術(shù)發(fā)展迅速。研究表明CEUS 能夠顯示腫瘤血管灌注變化情況，是一種敏感且可靠的影像學手段[3]。本實驗通過觀察兔肝VX2 腫瘤的進展過程，分析CEUS 定量參數(shù)與CD34 和VEGF 的相關(guān)性，進一步深入探討腫瘤血管生成基礎(chǔ)與CEUS 定量參數(shù)的關(guān)系，為影像學準確地評估肝腫瘤血管生成、預(yù)后及復發(fā)的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LOGIQ E9 超聲診斷儀和ML6-15 高頻探頭購自美國GE 公司，儀器配置低機械指數(shù)反向編碼造影成像技術(shù)（coded phased inversion, CPI）。兔抗兔CD34 多克隆抗體（一抗稀釋濃度為1∶100）、兔抗兔VEGF 多克隆抗體（一抗稀釋濃度為1∶100）、即用型鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex, SABC）免疫組織化學試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物模型復制

選擇健康新西蘭白兔24 只，體重（2.5±0.5）kg，雌雄不限。手術(shù)剝離出荷瘤兔肝VX2 腫瘤，選取腫瘤邊緣生長旺盛的魚肉樣組織，制備成大小約1 mm×1 mm 的腫瘤塊。用3%戊巴比妥鈉（劑量30 mg/kg）經(jīng)耳緣靜脈麻醉接種兔后，在超聲引導下，用穿刺針經(jīng)皮經(jīng)肝將腫瘤塊接種于兔肝左葉深部位置，完成兔肝VX2 腫瘤模型復制。術(shù)后正常飼養(yǎng)，預(yù)防感染。共復制24 只兔肝VX2 腫瘤模型，腫瘤種植成功后正常飼養(yǎng)14 d，選取24 個腫瘤灶進行觀察。

1.3 CEUS與定量分析

VX2 腫瘤植入14 d 后1 進行CEUS 檢查。啟用CPI 技術(shù)，Small Parts 造影模式。常規(guī)掃查選定兔肝腫瘤的最大中心切面行CEUS 檢查，將觀察目標放置于屏幕中央，局部放大圖像。使用5 號頭皮針建立耳緣靜脈通道，制備SonoVue 微泡混懸液，經(jīng)耳緣靜脈團注射1 mL 混懸液后，隨即快速注射2 mL 生理鹽水沖洗靜脈通路。團注對比劑同時啟動系統(tǒng)內(nèi)存儲計時器，實時、動態(tài)觀察選定的肝腫瘤顯影情況2 min，所有影像資料存盤。對存盤圖像進行CEUS 定量參數(shù)分析。

利用CEUS 定量分析軟件，選取感興趣區(qū)域（ROI）進行動態(tài)量化分析，選取腫瘤實質(zhì)內(nèi)或壞死周邊顯著增強的病灶區(qū)域，避開腫瘤內(nèi)壞死液化的無增強區(qū)。選取周圍肝組織時避開肝內(nèi)大血管走行。儀器自動擬合出時間-強度曲線，軟件自動計算并顯示腫瘤組織與周圍正常肝組織曲線增強上升斜率（AS）、對比劑強度、達峰時間（TTP）及曲線下面積（AUC）等CEUS 定量參數(shù)。同一腫瘤及周圍組織選擇不同感興趣區(qū)域重復測取3 次，取其平均值。

1.4 免疫組織化學染色

24 只兔肝VX2 腫瘤模型進行CEUS 檢查后立即處死荷瘤兔，制作腫瘤標本并進行免疫組織化學染色。所有標本用10 %甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、染色，并采用SABC 法進行免疫組織化學染色，判定CD34 和VEGF 的表達水平。

1.4.1 CD34 的檢測腫瘤細胞染色呈棕黃色為CD34 陽性細胞,在低倍光鏡下隨機選取熱點，然后轉(zhuǎn)換到400 倍鏡下隨機選取5 個熱點視野計數(shù)陽性細胞，計算每個視野中陽性細胞占總細胞數(shù)的百分率，將其平均值作為CD34 陽性細胞的表達率。CD34 陽性細胞表達分為：0%～30%為弱陽性，>30%～70%為陽性，>70%～100%為強陽性。

1.4.2 VEGF 的檢測腫瘤細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色顆粒為陽性細胞。隨機選取5 個熱點視野，高倍鏡下計算每個視野中陽性細胞占總細胞數(shù)的百分率，將其平均值作為VEGF 陽性細胞的表達率。VEGF 陽性細胞表達率分級：0%～25%為Ⅰ級，> 25%～50%為Ⅱ級，> 50%～75%為Ⅲ級，>75%～100%為Ⅳ級。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝腫瘤與周圍正常肝組織CEUS參數(shù)比較

兔肝VX2 腫瘤的對比劑強度、AS、TTP、AUC與周圍正常肝組織比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對比劑強度、AS 及AUC 均明顯大于周圍正常肝組織，TTP 明顯短于周圍正常肝組織。本實驗兔肝VX2 腫瘤CEUS 直觀表現(xiàn)均呈“速升速降”特點，腫瘤在動脈相呈整體顯著增強，瘤內(nèi)出現(xiàn)液化壞死者表現(xiàn)為不均勻增強或環(huán)狀增強，壞死灶無增強。造影時間-強度曲線表現(xiàn)為動脈相上升支陡直，快速達峰，靜脈相迅速下降。見表1和圖1。

表1 兔肝VX2腫瘤與周圍正常肝組織CEUS參數(shù)的比較 （n=24，±s）

表1 兔肝VX2腫瘤與周圍正常肝組織CEUS參數(shù)的比較 （n=24，±s）

組別兔肝VX2腫瘤周圍正常肝組織t 值P 值對比劑強度15.30±4.36 10.28±5.12-5.912 0.000 AS 0.68±0.43 0.36±0.21-2.321 0.000 TTP 12.86±4.93 19.82±4.42 6.285 0.000 AUC 757.70±242.73 953±265.16 7.441 0.000

圖1 兔肝VX2腫瘤與正常肝組織CEUS時間-強度曲線

2.2 免疫組織化學檢查結(jié)果

兔VX2 腫瘤CD34 與VEGF 表達均為陽性（見圖2A、B），其中弱陽性5 個，陽性16 個，強陽性3 個。CD34 陽性表達的平均值為（56.12±6.72），VEGF 陽性表達率的平均值為（61±24）%。VEGF 陽性細胞表達率Ⅰ級：0%～25%陽性細胞的腫瘤5個；Ⅱ級：>25%～50%陽性細胞的腫瘤6 個；Ⅲ級：> 50%～75%陽性細胞的腫瘤10 個；Ⅳ級：> 75%～100%陽性細胞的腫瘤3 個。見表2。

圖2 兔肝VX2腫瘤CD34和VEGF的表達（SABC染色×400）

表2 兔VX2腫瘤CD34與VEGF陽性表達結(jié)果

2.3 CEUS定量指標與CD34、VEGF的相關(guān)性

CEUS 各定量指標中，TTP 與CD34、VEGF 呈負相關(guān)（r=-0.843 和-0.692，均P=0.000）；對比劑強度與CD34、VEGF 呈正相關(guān)（r=0.386 和0.365，均P=0.042）；AS 與CD34、VEGF 呈正相關(guān)（r=0.497 和0.631，均P=0.005）；AUC 與CD34、VEGF 呈正相關(guān)（r=0.425 和0.485，均P=0.016）。

3 討論

兔肝VX2 腫瘤的生長特性類似于人類肝細胞癌，其生長演變過程迅速，腫瘤血供豐富，被廣泛用于肝腫瘤影像診斷、介入治療等基礎(chǔ)研究[4-6]。近年來，腫瘤精準治療技術(shù)不斷發(fā)展，對腫瘤療效和預(yù)后的判斷需要更加準確的評估方法。

腫瘤的生長轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成[7]，因此對腫瘤新生血管的評估成為腫瘤研究的熱點。腫瘤血管具有特殊的形態(tài)，血管走形扭曲，粗細不均并會生成較多異常分支，結(jié)構(gòu)特點也不同于正常組織血管，其內(nèi)皮細胞基底膜不完整，沒有平滑肌成分，僅由有孔的內(nèi)皮細胞和片狀基膜結(jié)構(gòu)組成，導致腫瘤血管滲透性增加等，這種異常的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點更加促進惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。因此有研究認為，腫瘤新生血管的定量是一個重要的獨立預(yù)后因素[8]。

惡性腫瘤細胞還會分泌多種血管內(nèi)皮生成因子，如CD34、VEGF、vWF、CD105 等，血管內(nèi)皮生成因子的釋放促進了腫瘤血管的生成。腫瘤新生血管旺盛形成與多種血管內(nèi)皮生成因子的高表達密切相關(guān)。因此在進行腫瘤新生血管計數(shù)時，可采用CD34、VEGF 等內(nèi)皮細胞標志物定量法，但此法具有損傷性且易受取材范圍的影響。一直以來，各種臨床和基礎(chǔ)實驗都致力于找到一種安全有效、操作簡便的技術(shù)用來精確評估腫瘤的生長和新生血管的生成。目前應(yīng)用于臨床和研究的主要有CT 灌注[9]、CEUS[10]等影像學技術(shù)手段。

由于腫瘤血管特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，造成腫瘤的血流灌注量和血容量明顯高于正常組織，超聲對比劑是一種血池顯影劑，CEUS 過程中對比劑能快速進入腫瘤，并且快速廓清[11]。CEUS 通過測定對比劑強度、AS、TTP、AUC 等參數(shù)，反映腫瘤內(nèi)對比劑灌注隨時間變化的特點，能夠比較客觀地評價腫瘤新生血管的生成和功能情況[12]。

本實驗兔肝腫瘤CEUS 時間-強度曲線參數(shù)中，TTP 與CD34 和VEGF 表達具有較好的負相關(guān)性，AS 與CD34 和VEGF 呈正相關(guān)，腫瘤血供越豐富，對比劑的灌注速度越快，對比劑所表示的腫瘤血流信號也更豐富[13]。腫瘤動脈血液供應(yīng)的多寡與新生腫瘤血管形成關(guān)系密切，腫瘤新生血管是以血管生成因子為中介誘導產(chǎn)生，CD34 和VEGF 等血管內(nèi)皮生成因子的高表達與新生血管的旺盛程度密切相關(guān)，因此CEUS 參數(shù)在一定程度上能夠客觀地反映腫瘤血管內(nèi)皮生成因子的表達水平。同時AUC 與CD34 和VEGF 呈正相關(guān)，AUC 是流速、流量及時間三者的全面評估,可較好地反映一定時間內(nèi)局部組織造影增強的累積效應(yīng)，同時受血流速度的影響，與局部血流量呈線性正相關(guān)[14]，因此AUC 能夠綜合反映腫瘤血管床的血流動力學情況[15]，也表明AUC 與腫瘤血管內(nèi)皮生成因子的表達密切相關(guān)。

綜上所述，腫瘤的CEUS 表現(xiàn)與腫瘤新生血管及血管內(nèi)皮生成因子密切相關(guān)，CEUS 時間-強度曲線能夠量化腫瘤血管內(nèi)對比劑流速和流量的變化情況[16]，從而更加客觀地反映出腫瘤新生血管的生成情況及瘤內(nèi)灌注特點，CEUS 定量參數(shù)也能夠客觀反映出腫瘤血管內(nèi)皮生成因子CD34 和VEGF 表達水平。因此，CEUS 定量分析技術(shù)的應(yīng)用實現(xiàn)了由主觀判斷腫瘤強化程度到客觀定量評價腫瘤血流灌注情況的轉(zhuǎn)變。這種無創(chuàng)而實用的影像學技術(shù)在評價腫瘤微血管密度及抗腫瘤血管治療療效等方面具有重要的臨床應(yīng)用價值。