左卡尼汀通過(guò)TGF-β1/Smad通路對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝的影響

程艷艷，周艷萍，曹仁智

（北大醫(yī)療魯中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東臨淄 255499）

尿毒癥（Uremia）是慢性腎衰竭的終末階段，水電解質(zhì)紊亂和代謝性酸中毒合為其主要特征，同時(shí)伴有鈣缺乏癥和磷過(guò)多等癥狀[1]。腹膜透析（peritoneal dialysis, PD）為治療終末期腎臟病的主要腎臟替代療法之一，具有持續(xù)清除廢物、對(duì)患者活動(dòng)影響較小、治療成本較低等優(yōu)點(diǎn)[2]。然而，持續(xù)暴露于機(jī)械應(yīng)力、葡萄糖透析液及導(dǎo)管并發(fā)癥等可導(dǎo)致腹膜炎癥和損傷，從而導(dǎo)致進(jìn)行性血管生成和腹膜纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致超濾衰竭。左旋肉毒堿，又稱(chēng)左旋肉堿，主要分布在心臟和骨骼肌中，可用于促進(jìn)體內(nèi)脂質(zhì)代謝，提高氧化分解能力，增強(qiáng)細(xì)胞活力，改善機(jī)體組織功能障礙。尿毒癥在腹膜透析過(guò)程中造成左旋肉堿損失，一定程度地促進(jìn)了超濾失敗的發(fā)生。研究[3]顯示，通過(guò)外源性補(bǔ)充左卡尼汀和左旋肉堿，可以改善腹膜透析患者機(jī)體的炎癥和營(yíng)養(yǎng)狀況，有助于改善腹膜透析的效果，然而其分子機(jī)制尚不清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）是慢性腎臟病的標(biāo)志物。研究[4]發(fā)現(xiàn)，Sma 和Mad相關(guān)蛋白（Sma and Mad-related protein, Smad）是TGF-β1下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，下調(diào)Smad 可以預(yù)防腎病小鼠腎衰竭[5]。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠尿毒癥腹膜透析模型，擬探討左卡尼汀對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠的腎臟損傷是否具有保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只SPF 級(jí)健康成年雄性SD 大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2018-0004]，體重（200±20）g。所有大鼠均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自由飲用食水，研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及藥物

兔源一抗TGF-β1、二抗羊抗、Smad3、p-Smad3和GAPDH 均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，血肌酐和血尿素氮酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海明秀生物技術(shù)有限公司，DAB 顯色試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，大鼠甲狀旁腺激素ELISA 試劑盒購(gòu)自上海濟(jì)寧酶有限公司。左卡尼汀口服液（規(guī)格：10 mL∶1 g）購(gòu)自東北制藥集團(tuán)公司沈陽(yáng)第一制藥廠，低鈣腹膜透析液2 000 mL（含1.5%葡萄糖）購(gòu)自廣州百特醫(yī)療用品有限公司。

1.3 模型復(fù)制方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，將大鼠麻醉，備皮并消毒左腎手術(shù)部位皮膚，切開(kāi)1.5 cm 切口，剝離周?chē)闹窘M織，結(jié)扎上1/3 腎臟，切除1/3 腎臟并止血。采用相同的方法切除下1/3 腎臟，直至無(wú)出血，復(fù)原剩余左腎，縫合肌層和皮膚，采用青霉素消毒。7 d 后，采用相同方法進(jìn)行右腎全腎切除術(shù)。2 d 后，斷尾取血，檢測(cè)血肌酐，當(dāng)血肌酐水平超過(guò)2 倍正常值，表明尿毒癥模型復(fù)制成功。尿毒癥大鼠模型復(fù)制成功后，將腹膜透析管插入腹腔并注入2 mL 1.5%低鈣腹膜透析液，1 次/d，直到尿毒癥腹膜透析管通暢，表明尿毒癥腹膜透析大鼠模型復(fù)制成功。將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和左卡尼汀組，另將切開(kāi)并剝離脂肪組織但不結(jié)扎腎臟，行腹腔插腹膜透析管處理的大鼠作為假手術(shù)組（對(duì)照組），每組10 只。模型組和對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1 mL/d；左卡尼汀組腹腔注射左卡尼汀40 mg/kg，1 次/d，持續(xù)6 周。然后切取實(shí)驗(yàn)所需的組織。

1.4 取材

給藥前后稱(chēng)重。給藥結(jié)束，各組大鼠均禁食但自由飲水1 d，麻醉下取尾靜脈血，常溫3 000 r/min離心，取血清，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)結(jié)束后切取剩余腎臟組織，分離腎皮質(zhì)，置于-80℃液氮，備用。

1.5 血生化指標(biāo)檢測(cè)

嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中肌酐、尿素氮、甲狀旁腺激素、鈣、磷水平。

1.6 腎臟組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白檢測(cè)

采用蛋白提取試劑盒提取儲(chǔ)藏于-80℃液氮的大鼠腎臟組織的總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒法測(cè)定總蛋白濃度，采用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉密封2 h，添加一抗TGF-β1、Smad3、p-Smad3，一抗的工作濃度均為1∶5 000，在4℃下孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h，采用DAB 試劑顯色，并用蛋白凝膠成像儀進(jìn)行拍照和定量分析。以GAPDH 為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠模型復(fù)制前后體重的比較

模型復(fù)制前，3 組大鼠體重比較，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥結(jié)束后，3 組大鼠體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組大鼠體重較對(duì)照組減輕（P<0.05），左卡尼汀組大鼠體重較模型組增加（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠模型復(fù)制前后體重的比較（g，±s）

表1 3組大鼠模型復(fù)制前后體重的比較（g，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組左卡尼汀組F 值P 值給藥后384.24±15.83 287.13±13.67①321.83±12.73①②121.178 0.000模型復(fù)制前203.14±12.87 206.21±13.41 204.18±13.06 0.142 0.868

2.2 3組大鼠給藥后血肌酐、尿素氮水平的比較

給藥結(jié)束后，3 組大鼠的血肌酐、尿素氮比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組大鼠血肌酐和尿素氮水平較對(duì)照組升高（P<0.05），左卡尼汀組大鼠血肌酐和尿素氮水平較模型組降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠給藥后血肌酐、尿素氮水平的比較（μmol/L，±s）

表2 3組大鼠給藥后血肌酐、尿素氮水平的比較（μmol/L，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組左卡尼汀組F 值P 值血尿素氮7.28±3.61 18.13±4.72①12.46±2.96①②20.047 0.000血肌酐27.14±5.83 68.31±9.72①43.27±5.86①②79.301 0.000

2.3 3 組大鼠給藥后血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平的比較

給藥結(jié)束后，3 組大鼠的血甲狀旁腺激素、鈣、磷比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組大鼠血甲狀旁腺激素、磷水平較對(duì)照組升高（P<0.05），血鈣水平降低（P<0.05），左卡尼汀組血甲狀旁腺激素、磷水平較模型組降低（P<0.05），血鈣水平較模型組升高（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠給藥后血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平的比較（±s）

表3 3組大鼠給藥后血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平的比較（±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別鈣/（nmol/L）磷/（nmol/L）對(duì)照組模型組左卡尼汀組F 值P 值甲狀旁腺激素/（ng/L）324.16±66.82 483.17±72.09①403.11±70.82①②12.920 0.000 1.48±0.26 2.96±0.33①2.23±0.28①②64.453 0.000 2.73±0.37 1.72±0.24①2.16±0.31①②26.473 0.000

2.4 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

給藥結(jié)束后，3 組大鼠TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P<0.05），左卡尼汀組TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組下降（P<0.05）。3 組大鼠Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4和圖1。

圖1 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路的蛋白表達(dá)

表4 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表4 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組左卡尼汀組F 值P 值p-Smad3 0.26±0.06 0.48±0.12①0.37±0.09①②13.908 0.000 TGF-β1 0.31±0.07 0.62±0.14①0.42±0.11①②20.246 0.000 Smad3 1.06±0.25 1.02±0.18 0.97±0.24①②0.400 0.674

3 討論

現(xiàn)有治療條件下，終末期腎臟疾病患者必須依靠腎臟替代療法才能生存[6]。在腹膜透析、血液透析及腎臟移植這3 種主要的替代療法中，腹膜透析具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響較小、對(duì)殘余腎功能的保護(hù)更好等優(yōu)點(diǎn)，因而成為終末期腎臟病患者的首選腎臟替代療法[6]。然而，近期研究顯示，隨著腹膜透析時(shí)間的推移，腹膜纖維化引起的超濾衰竭發(fā)生率逐漸增加，找到減少尿毒癥患者腹膜透析并發(fā)癥并保護(hù)腎臟功能的治療藥物或干預(yù)手段尤為迫切且重要[7]。

左旋肉堿作為氧化脂肪酸的必需物質(zhì)，分布于心臟和骨骼肌中，健康成人可以自身合成20 g 左右的左旋肉堿。左旋肉堿不僅能促進(jìn)體內(nèi)脂質(zhì)代謝，還能在線(xiàn)粒體中產(chǎn)生短鏈?；龠M(jìn)線(xiàn)粒體基質(zhì)同長(zhǎng)鏈脂肪酸相結(jié)合，提高氧化分解的能力，增強(qiáng)細(xì)胞活力，改善機(jī)體組織功能障礙[8-9]。對(duì)慢性腎功能不全的患者，左旋肉堿的含量會(huì)明顯降低，并且還會(huì)在透析過(guò)程中造成一定程度的損失，透析患者補(bǔ)充左旋肉堿對(duì)改善透析效果具有積極意義[10]。左卡尼汀是從哺乳動(dòng)物中提取的能量代謝產(chǎn)物，屬于維生素樣營(yíng)養(yǎng)素，即商業(yè)化的左旋肉堿。本研究采用左卡尼汀連續(xù)給藥尿毒癥腹膜透析大鼠6 周，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的體重降低，但與模型組比較，左卡尼汀組大鼠體重增加，提示左旋肉堿有助于改善尿毒癥腹膜透析大鼠的體質(zhì)。

肌酐是人體肌酸代謝的產(chǎn)物，血肌酐幾乎全部經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)進(jìn)入原尿，不被腎小管重吸收，肌酐的每日生成量幾乎恒定，因此血肌酐水平為穩(wěn)定值，測(cè)定血肌酐濃度可以反映腎小球的濾過(guò)功能，成為衡量腎功能的重要指標(biāo)[11]。肌酐對(duì)機(jī)體的腎損傷高度敏感，因此可以在腎損傷的早期對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組和左卡尼汀組大鼠血肌酐、尿素氮水平均升高，與模型組比較，左卡尼汀組大鼠血肌酐和尿素氮水平均降低，本研究結(jié)果與申屠偉豐[12]等的報(bào)道一致，提示左卡尼汀可改善腎小球?yàn)V過(guò)作用，降低腹膜透析大鼠血肌酐及尿素氮水平。

在慢性腎臟疾病患者中，隨著腎纖維化的進(jìn)展，腎臟排磷能力的下降，血磷的增加，1，25-（OH）2D3的生成減少，腸道對(duì)鈣吸收下降，進(jìn)而導(dǎo)致甲狀旁腺功能障礙，導(dǎo)致血鈣降低、血磷升高，血鈣、血磷水平異?？烧T發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腎骨病[13-15]。本研究顯示，與模型組比較，左卡尼汀組大鼠血鈣升高，血甲狀旁腺激素、磷水平降低，提示左卡尼汀可改善腎小管功能，促進(jìn)鈣再吸收，強(qiáng)化腎功能促磷代謝，血鈣水平的升高可激活負(fù)反饋機(jī)制，降低甲狀旁腺激素水平。

研究表明，TGF-β1可增強(qiáng)膠原蛋白轉(zhuǎn)換來(lái)刺激單層細(xì)胞修復(fù)，進(jìn)而影響組織修復(fù)過(guò)程[16]。Smad的磷酸化可通過(guò)TGF-β1與膜表面受體的結(jié)合而被激活，激活的Smad 可調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[17]。Smad3 是Smad 家族的成員，并且已證明Smad3 促進(jìn)慢性腎病中的細(xì)胞纖維化[18]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，提示尿毒癥腹膜透析大鼠TGF-β1/Smad 被激活，腎細(xì)胞纖維化程度增強(qiáng)，腎功能顯著降低。給予左卡尼汀干預(yù)后，腎組織的TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，可見(jiàn)左卡尼汀可通過(guò)抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路活化而保護(hù)受損的腎臟。

綜上所述，左卡尼汀可通過(guò)抑制尿毒癥腹膜透析的TGF-β1/Smad 通路活化來(lái)改善腎臟功能，提高血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平，改善鈣磷代謝平衡。