線性釓沉積大鼠模型使用大環(huán)釓劑后腦內釓沉積的變化研究

王旭聰，李健，張睿，王振華，擺玉財，馬耀興，陳兵

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)增強檢查已成為臨床重要的影像學檢查方法之一。目前最常用于MRI增強檢查的對比劑為釓對比劑(gadolinium-based contrast agent，GBCAs)[1-3]。一直以來，GBCAs被認為是一種相對安全的對比劑。近年來多項人類和動物實驗研究表明，多次重復給予線性GBCAs后，小腦深部核團(deep cerebellar nuclei，DCN)T1WI呈現(xiàn)高信號并出現(xiàn)器官釓沉積[4-9]，給予不同類型的GBCAs后，腦組織中釓沉積存在顯著差異[6-7,10]，注射大環(huán)型GBCAs的大鼠DCN T1WI圖像未見明顯增高信號且腦內釓濃度明顯較低[11]。MR圖像解讀主要依靠不同組織信號強度的對比，常規(guī)MR圖像的信號強度會受到掃描設備和參數(shù)的影響，難以與正常參考值比較。與常規(guī) MRI相比，多對比度的定量磁共振成像MAGIC序列實現(xiàn)了MR圖像從常規(guī)灰階圖到組織定量圖譜的轉變, 一次掃描可以得到純粹的T1及其它弛豫時間定量化數(shù)據(jù)，為臨床提供更多有價值的診斷信息。

目前關于接受線性GBCAs之后再接受大環(huán)型GBCAs的釓沉積報道較少，本研究動物模型為前瞻性評估已建立線性釓沉積模型的大鼠在之后連續(xù)多次使用線性GBCAs(釓雙胺)及大環(huán)型GBCAs(釓特酸葡胺與釓布醇)DCN T1弛豫值的變化，以DCN釓濃度的測定以及小腦HE染色切片為金標準，并與傳統(tǒng)的MRI信號強度比值作比較，探究在已出現(xiàn)線性釓沉積的大鼠中繼續(xù)注射大環(huán)型釓對比劑后大鼠腦內釓沉積的變化。為臨床上已經(jīng)出現(xiàn)腦部線性釓沉積的患者選擇GBCAs提供參考依據(jù)，并且盡可能排除混雜因素，規(guī)范釓沉積的研究。

材料與方法

1.釓沉積大鼠模型的建立

本實驗已通過寧夏醫(yī)科大學實驗動物倫理學要求。選取28只體重為(210±29)g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠(動物生產(chǎn)許可證號SCXK [寧]2009-0001), 在正常條件下進行飼養(yǎng)。在首次注射前及每周注射后對大鼠進行頭部MRI掃描，并測量大鼠DCN T1值及DCN/小腦皮質T1WI信號比值。首先對所有大鼠在全麻下(3%～3.5%異氟烷)進行尾靜脈注射釓雙胺注射液 (GE healthcare)20次(4次/周，共5周；單次劑量均為0.06 mmol/kg)建立線性釓沉積模型，5周后處死5只大鼠進行電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)實驗測定DCN釓濃度，并進行小腦組織蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)組織學分析。將剩下的大鼠隨機分為四組：①釓布醇(大環(huán)型GBCAs)組：注射釓布醇注射液(瑞威爾生物科技有限公司 )；②釓特酸葡胺(大環(huán)型GBCAs)組：注射釓特酸葡胺注射液 (江蘇佳迪顯醫(yī)藥股份有限公司)；③釓雙胺(線性GBCAs)組：注射釓雙胺；④高滲鹽水(對照)組：注射高滲鹽水(1350 mOsm/kg，滲透壓與釓對比劑接近)。注射次數(shù)及劑量與之前相當。最后一次MRI掃描完成后立刻對大鼠安樂死進行ICP-MS實驗測定DCN釓濃度以及HE染色組織學觀察分析(圖1)。

圖1 注射和MRI方案結果。釓雙胺每周注射單次劑量0.06 mmol/kg，共4次，共5周。分組后各組注射次數(shù)及劑量與之前相當。

圖2 a)大鼠腦解剖：小腦深部核團(DCN)和齒狀核的定位(選自《大鼠腦立體定位圖譜》第64圖[12])；b)大鼠MRI T1WI圖像：DCN和齒狀核的定位，DCN用于定量分析的ROI定位；c)大鼠SynMRI 圖像：DCN和齒狀核的定位，DCN用于定量分析的ROI定位。圖3 a)大鼠腦解剖：小腦深部核團(DCN)與鄰近小腦皮質的定位(選自《大鼠腦立體定位圖譜》第64圖[12])；b)大鼠MRI T1WI圖像：小腦深部核團(DCN)與鄰近小腦皮質的定位，計算ROI DCN/小腦皮質T1WI信號比值。

2.MRI掃描及圖像分析

大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，選取俯臥位固定于大鼠8通道腦專用線圈(上海辰光醫(yī)療科技有限公司)，采用3.0T MR儀(GE SIGNA Architect)對大鼠腦部進行掃描，行T1WI FSE序列(TR 470 ms，TE 10 ms)、T2WI FSE序列(TR 2500 ms，TE 85 ms)及MAGIC序列橫軸面掃描，各序列采集12層，層厚2 mm，間距0.2 mm，矩陣128×128，F(xiàn)OV 8.0 mm×8.0 mm。所有圖像分析均在盲法和隨機條件下進行，由兩名放射科醫(yī)師(分別從事MRI臨床應用和研究10年和5年)對圖像進行定量分析，采用機器自帶可自動生成偽彩圖的后處理軟件SynMRI(版本100.0.0)進行圖像分析和數(shù)據(jù)測量，在左右兩側DCN實質上勾畫興趣區(qū)(ROI)，見圖2，左右兩側取平均值，記錄T1時間弛豫值；分別在左右兩側DCN及小腦皮質實質上勾畫ROI(圖3)，左右兩側取平均值，計算DCN/小腦皮質T1WI信號比值。

3.DCN釓濃度測定

在異氟醚麻醉下通過放血對大鼠實施安樂死。將大鼠的小腦整塊提取并半切，一半用于ICP-MS定量分析 ，一半用于后續(xù)HE染色切片制作，由質譜分析工作人員測定DCN中釓濃度，結果以每克濕組織重量(組織樣品)的Gd含量(ug/g)表示。

4.組織學檢查

根據(jù)大鼠腦部解剖圖譜，在冰浴中迅速切取包含DCN冠狀切片，由病理科工作人員在37℃恒溫下染色5 min，將染色組織拍照后置于10%甲醛溶液固定1周，切片后HE染色顯微鏡下觀察。

5.統(tǒng)計分析

大鼠DCN T1弛豫時間與DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值分析采用雙方差分析(ANOVA)檢測各組間各時間點的差異。在檢驗正態(tài)分布后，采用Kruskal-Wallis檢驗小腦組織釓濃度的差異。采用Spearman相關系數(shù)評估大鼠DCN T1值與DCN/小腦皮質T1WI信號比值以及DCN中釓濃度的相關性。數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)計學軟件IBM SPSS Statistics 25.0。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

28只大鼠中，2只大鼠(W3、W5)死于麻醉并發(fā)癥， 1只大鼠(W4)死于尾靜脈感染。最終25只大鼠完成了實驗。

1.MRI掃描

在建立線性釓沉積模型初期，在第3周(累積12次注射后)大鼠T1WI圖像顯示DCN區(qū)域出現(xiàn)顯著的高信號，并在之后的第4周與第5周更明顯(圖4)，DCN T1值呈逐漸下降趨勢，DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值逐漸增高。

圖4 前5周注射釓雙胺后大鼠顱腦T1WI圖像，DCN信號在累計12次注射釓雙胺后明顯增高(箭)，并隨著累計注射劑量的增多而呈持續(xù)而顯著的高信號(箭)。 圖5 后5周分組后大鼠顱腦T1WI圖像，釓雙胺組DCN信號進行性增高(箭)，其它組DCN信號未見明顯持續(xù)增高。

分組后釓雙胺組大鼠T1WI圖像顯示DCN信號持續(xù)及進行性增高，DCN T1值繼續(xù)呈逐漸下降趨勢，DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值逐漸增高。其它組大鼠T1WI圖像顯示DCN信號未見明顯持續(xù)增高(圖5)，且DCN T1值未見繼續(xù)下降趨勢，DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值未見繼續(xù)增高(圖6)。

圖6 a、b)建立線性釓沉積模型前5周大鼠DCN T1值隨累積注射次數(shù)增加呈逐漸下降趨勢；b)建立線性釓沉積模型前5周大鼠DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值隨累積注射次數(shù)的增加逐漸增高；c)不同分組大鼠DCN T1值隨累積注射次數(shù)的變化情況，釓雙胺組大鼠繼續(xù)呈逐漸下降趨勢，其它組大鼠DCN T1值未見繼續(xù)下降趨勢；d)不同分組大鼠DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值隨累積注射次數(shù)的變化情況，釓雙胺組逐漸增高，其他組未見繼續(xù)增高。

大鼠DCN T1值與DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值呈顯著負相關(r=0.89，P<0.01)。

2.DCN釓濃度測定

釓雙胺組大鼠DCN組織中每克組織釓濃度顯著高于其它各組(表1)，P<0.05。DCN T1值與DCN組織釓濃度呈顯著負相關(r=0.87，P<0.05)。

表1 大鼠DCN末次MRI掃描數(shù)據(jù)與DCN濃度比較

3.組織學觀察

第5周處死的大鼠、釓雙胺組、釓特酸葡胺組、釓布醇組、高滲鹽水組大鼠DCN區(qū)域HE染色切片顯示絕大多數(shù)神經(jīng)元結構和形態(tài)亦未見明顯異常(圖7、8)。

圖7 大鼠小腦DCN 區(qū)域大多數(shù)神經(jīng)元結構和形態(tài)亦未見明顯異常(HE，×200)。a)第5周處死的大鼠；b)釓雙胺組；c)釓特酸葡胺組；d)釓布醇組；e)高滲鹽水組。 圖8 a)健康大鼠含DCN橫軸位層面的HE染色切片全面觀；b)對應DCN部位放大顯示(×200)。

討 論

在MRI增強檢查中，GBCAs的使用在疾病診斷中具有重要的作用。GBCAs根據(jù)結構可分為尾部帶有Gd3+離子的線性類及配體內含Gd3+離子的大環(huán)類。大環(huán)型GBCAs釓布醇及釓特酸葡胺其內的Gd3+被包裹在環(huán)狀結構其中，線性GBCAs釓雙胺中的Gd3+在其尾部未有其它結構包繞。尾部帶有Gd3+離子的線性類GBCAs更易釋放Gd3+離子。齒狀核中的金屬成分豐富，這些金屬有機化合物與釓劑的交換通過金屬間的跨金屬現(xiàn)象發(fā)生，從而釋放出游離的Gd3+離子，引起釓劑在齒狀核區(qū)域中沉積，從而顯示為該區(qū)域的低T1弛豫值。在臨床常規(guī)GBCAs用量為0.1 mmol/kg(0.2 mL/kg)，人體內GBCAs排泄半衰期約為1.2～2 h，GBCAs在健康大鼠的排泄半衰期約0.3 h，明顯短于人類GBCAs排泄半衰期(1.2～2 h)，在本次研究中，每周注射4次(間隔24 h)在10周內共給藥40次，可減少組織暴露，并支持較短的給藥時間間隔。根據(jù)FDA關于動物相對于人體的藥物劑量換算方案，本次研究大鼠單次GBCAs注射劑量為0.06 mmol/kg，符合劑量標準。

GBCAs是一種滲透負荷較低的高滲溶液，但在臨床劑量下生理后果可以忽略不計(除非GBCAs在注射時外滲)，因此本次研究設定高滲鹽水組以評估高滲本身是否對MRI信號有任何影響。在后期大鼠分組后5周內GBCAs及高滲鹽水注射期間，筆者觀察到釓特酸葡胺組與釓布醇組(大環(huán)型GBCAs)大鼠以及高滲鹽水組大鼠在后期DCN T1值均有持續(xù)的上升，但高滲鹽水組大鼠上升更快，筆者推測首先GBCAs在人體代謝中隨著時間會自然排出部分，其次釓特酸葡胺與釓布醇(大環(huán)型GBCAs)的使用也可能使DCN區(qū)域T1值降低，但這種降低程度被人體自然代謝所掩蓋，因而顯示釓特酸葡胺與釓布醇(大環(huán)型GBCAs)組大鼠DCN T1值緩慢上升趨勢。

本次研究結果在前5周線性釓沉積造模大鼠中，在第3周MRI掃描圖像上見T1WI DCN顯著高信號，這與既往研究中結果一致[13]；后期分組后線性GBCAs組大鼠DCN信號遠遠高于大環(huán)組及高滲鹽水組，筆者推測從線性GBCAs轉換為大環(huán)型GBCAs的使用后并不會顯著增加釓沉積。當前已有ICP-MS結果表明給予不同類型的GBCAs后，腦組織中釓沉積存在顯著差異[8]，在本次研究ICP-MS定量分析中，釓雙胺組大鼠DCN釓濃度遠遠高于其它各組，與本次MRI掃描測量分析的結果一致。在本次的研究中筆者通過對大鼠DCN區(qū)域HE染色切片分析并未發(fā)現(xiàn)相關的腦部病理學損傷出現(xiàn)，同時DCN釓濃度的測定也提示接受線性GBCAs之后再接受大環(huán)型GBCAs的安全性相對良好。

定量圖譜磁共振成像技術MAGiC序列是基于多個回波多個延遲序列的一種新型MRI集成序列，具有快速掃描、多組成像等特點，通過調整TE、TR及反轉時間參數(shù)可得到任意對比的圖像，以滿足不同臨床診斷需求。在本研究中，筆者采用定量圖譜磁共振成像技術MAGiC序列對大鼠DCN T1值進行量化，并同時采用傳統(tǒng)信號強度比值來與其作對比。結果顯示大鼠DCN T1值與DCN/小腦皮質T1WI信號強度比值呈顯著負相關(r=0.89，P<0.01)，由于釓的順磁性效應，可縮短T1弛豫時間，增高T1信號強度，這與本研究的結果一致，提示定量磁共振成像技術在大鼠DCN釓沉積定量測量中的可行性。目前許多關于釓沉積的報道是比較同時使用不同類型GBCAs后體內釓沉積的差異，而關于接受線性GBCAs之后再接受大環(huán)型GBCAs的相關釓沉積報道較少，本研究前瞻性評估已建立線性釓沉積模型的大鼠在之后連續(xù)多次使用不同類型GBCAs后DCN T1值的變化，與傳統(tǒng)的MRI信號強度比值作比較顯示顯著相關性，提示定量磁共振成像技術在大鼠DCN釓沉積定量測量中的可行性及良好應用價值。

本研究還存在一些局限性：①與臨床患者所接受GBCAs的劑量相比，本研究中的大鼠受到了更高、更頻繁的劑量。在臨床患者所接受GBCAs的劑量及常見次數(shù)下，從線性GBCAs轉換為大環(huán)型GBCAs靜脈注射后微量元素釓的檢測水平預計會大大降低，而且使用通常的人體劑量可能會低于大多數(shù)分析儀器的檢測限度。還需要進一步研究更低的劑量和更少的使用GBCAs。②雖然在大鼠腦內釓沉積與神經(jīng)組織病理損傷似乎沒有關系，但之后的生理意義和最終的臨床意義是未知的。國內外至今仍然沒有明確的證據(jù)證明GBCAs腦內沉積現(xiàn)象能夠引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者其他系統(tǒng)的損傷，但是由于GBCAs可以分布在羊水、乳汁中，并且能夠透過胎盤，以及釓沉積量與接受GBCAs劑量相關等危險因素存在，仍需要大量研究探索組織中的GBCAs沉積潛在的危害。

綜上所述，本研究結果表明，在已出現(xiàn)線性釓沉積的大鼠中，繼續(xù)使用大環(huán)型GBCAs釓特酸葡胺及釓布醇相對一直使用線性GBCAs腦內釓沉積較少，相對較為安全，為臨床上已經(jīng)出現(xiàn)腦內線性釓沉積的患者選擇GBCAs提供參考依據(jù)。