脂肪酸酰胺水解酶在不同癌癥中的表達(dá)及其與預(yù)后和免疫微環(huán)境的關(guān)系

馬寒素 陳韻 劉玉琛 曾樂立 許宇智 方爍 陳昱 潘逸航

中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心（廣東深圳 518107）

癌癥是全球范圍內(nèi)人類死亡的第二大原因，晚期、轉(zhuǎn)移型及復(fù)發(fā)型癌癥的藥物敏感及耐藥問題使得癌癥治療成功率非常低［1-3］，亟需運(yùn)用預(yù)后標(biāo)志物進(jìn)行精細(xì)的分子分型并開發(fā)整合治療方案以實(shí)現(xiàn)癌癥的精準(zhǔn)治療。因此，深入挖掘更加精準(zhǔn)、有效的臨床分子分型和預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。泛癌分析是指通過對各種類型癌癥中轉(zhuǎn)錄本表達(dá)、蛋白表達(dá)、基因變異、基因拷貝數(shù)變化以及甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾變化展開多組學(xué)分析，旨在闡明癌癥的共同特征、探索異質(zhì)性的產(chǎn)生機(jī)制不同癌癥中發(fā)生發(fā)展及構(gòu)建分子分型體系［4-5］，對全面了解癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及指導(dǎo)臨床治療具有重要的作用和意義。

FAAH 基因編碼的脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）是一類能夠水解生物活性信號分子脂肪酸酰胺（FAAs），進(jìn)而終止信號傳導(dǎo)的膜結(jié)合型絲氨酸水解酶［6］。該酶屬于絲氨酸水解酶家族，參與調(diào)節(jié)多種內(nèi)源性大麻素與各種疾病相關(guān)的功能，包括疼痛、炎癥、神經(jīng)退行性變、抑郁、焦慮等因素［6］。目前，關(guān)于FAAH 的研究主要集中于應(yīng)用FAAH 抑制劑如URB597、JZL195、JNJ-1661010、PF-04457845 等提高人體內(nèi)內(nèi)源性大麻素水平以治療疼痛、炎癥和情緒障礙等多種疾?。?-10］。盡管FAAH 的抑制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是FAAH 基因在癌癥中的表達(dá)、作用、生存預(yù)后相關(guān)性及免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)等方面能尚不明確。

因此，本研究擬利用TCGA 癌癥數(shù)據(jù)庫聯(lián)合GTEx 正常組織數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組及生存預(yù)后數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，探究FAAH 在人類癌癥中的表達(dá)譜及其與癌癥預(yù)后的關(guān)系。此外，運(yùn)用CIBERSORT 算法和Pearson 相關(guān)性分析FAAH 表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系，為進(jìn)一步明確FAAH 作為預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究使用加州大學(xué)圣克魯茲分校（UCSC）癌癥基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站（https：//tcga.xenahubs.net，2021年9月訪問）獲得了TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中33 種癌癥11 160 例癌癥患者的癌和非癌樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集以及相應(yīng)的臨床病理數(shù)據(jù)，同時(shí)結(jié)合GTEx（Genotype-Tissue Expression）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）生前健康的人體各器官組織尸檢樣本RNA 測序數(shù)據(jù)集。（1）TCGA數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集包括：腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）92 例，膀胱移行細(xì)胞癌（BLCA）412 例，浸潤性乳腺癌（BRCA）1 097例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CESC）307例，膽管癌（CHOL）45 例，結(jié)腸癌（COAD）459 例，彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBC）48 例，食管癌（ESCA）185 例，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）596 例，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）528 例，腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）113 例，腎透明細(xì)胞癌（KIRC）537 例，腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）291 例，急性髓性白血?。↙AML）200例，腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）515 例，肝臟肝細(xì)胞癌（LIHC）377 例，肺腺癌（LUAD）522 例，肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）504 例，間皮瘤（MESO）87 例，卵巢漿液性囊腺癌（OV）587 例，胰腺癌（PAAD）185 例，嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）179 例，前列腺腺癌（PRAD）500 例，直腸腺癌（READ）170 例，肉瘤（SARC）261例，皮膚黑色素瘤（SKCM）470例，胃腺癌（STAD）443 例，睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（TGCT）134 例，甲狀腺癌（THCA）507 例，胸腺瘤（THYM）124 例，子宮內(nèi)膜癌（UCEC）548例，子宮癌肉瘤（UCS）57例，葡萄膜黑素瘤（UVM）80 例。（2）GTEx 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集包括：腎上腺（AdrenalGland）161 例，膀胱（Bladder）13 例，血液（Blood）595 例，血管（Blood-Vessel）753 例，骨髓（BoneMarrow）102 例，腦（Brain）2852 例，乳房（Breast）221 例，子宮頸（CervixUteri）11 例，結(jié)腸（Colon）384 例，食管（Esophagus）805 例，輸卵管（FallopianTube）7，心臟（Heart）493 例，腎臟（Kidney）38例，肝臟（Liver）141例，肺（Lung）762例，肌肉（Muscle）478例，神經(jīng)（Nerve）335例，卵巢（Ovary）112，胰腺（Pancreas）203 例，前列腺（Prostate）122 例，唾液腺（SalivaryGland）71 例，皮膚（Skin）977 例，小腸（SmallIntestine）106 例，脾臟（Spleen）121 例，胃（Stomach）209 例，睪丸（Testis）208 例，甲狀腺（Thyroid）366 例，子宮（Uterus）93 例。本研究僅使用了開放獲取的數(shù)據(jù)，無需獲得倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 FAAH 的泛癌表達(dá)分析 （1）為了比較癌組織和癌旁組織基因的表達(dá)水平，本研究從33 種TCGA 癌癥類型中提取了FAAH 基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R 語言環(huán)境將癌組織、癌旁組織和正常組織RNA 數(shù)據(jù)整合成一個(gè)表達(dá)矩陣。（2）為評估不同腫瘤分期中FAAH 基本表達(dá)水平的變化，對提取到的TCGA 臨床分期StageⅠ、StageⅡ及StageⅢ或StageⅣ患者的FAAH 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.3 FAAH與生存預(yù)后的關(guān)系 以FAAH中位表達(dá)水平將患者分為FAAH 高表達(dá)組和低表達(dá)組［11-12］，利用患者ID 匹配表達(dá)矩陣和臨床生存隨訪信息，比較患者總生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease Free survival，DSS）、無進(jìn)展間期（disease free survival，PFI）和無病間期（progression free survival，DFI）等預(yù)后指標(biāo)的差異。不同類型癌癥FAAH 中位數(shù)表達(dá)水平數(shù)值（Log2TPM）如下：ACC=3.195，BLCA=3.702，BRCA=3.679，CESC=3.013，CHOL=3.803，COAD=4.383，DLBC=1.554，ESCA=2.788，GBM=2.286，HNSC=2.490，KICH=3.058，KIRC=3.549，KIRP=4.094，LAML=3.279，LGG=3.237，LIHC=3.583，LUAD=3.306，LUSC=2.655，MESO=2.017，OV=2.944，PAAD=3.309，PCPG=2.554，PRAD=5.977，READ=4.432，SARC=1.725，SKCM=1.442，STAD=3.021，TGCT=3.055，THCA=3.932，THYM=3.319，UCEC=3.917，UCS=2.77，UVM=2.034。

1.4 FAAH 與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系

1.4.1 FAAH 與腫瘤免疫細(xì)胞的關(guān)系 首先利用CIBERSORT 網(wǎng) 站（https：//cibersort.stanford.edu/）分析TCGA 數(shù)據(jù)庫33 種不同癌癥患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比較FAAH 高、低表達(dá)兩組患者腫瘤組織中免疫細(xì)胞組成的差異，計(jì)算log2FC 并作圖，變化倍數(shù)（FC）=每一種免疫細(xì)胞的低表達(dá)組均值/高表達(dá)組均值。

1.4.2 FAAH 與腫瘤免疫抑制基因的關(guān)系 選取TCGA 數(shù)據(jù)庫33 種癌癥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的47 個(gè)免疫抑制基因，將其與FAAH 基因進(jìn)行相關(guān)性分析，并繪制相關(guān)性熱圖。免疫抑制基因包括：BTLA、CD200、TNFRSF14、NRP1、LAIR1、TNFSF4、CD244、LAG3、ICOS、CD40LG、CTLA4、CD48、CD28、CD200R1、HAVCR2、ADORA2A、CD276、KIR3DL1、CD80、PDCD1、LGALS9、CD160、TNFSF14、IDO2、ICOSLG、TMIGD2、VTCN1、IDO1、PDCD1LG2、HHLA2、TNFSF18、BTNL2、CD70、TNFSF9、TNFRSF8、CD27、TNFRSF25、VSIR、TNFRSF4、CD40、TNFRSF18、TNFSF15、TIGIT、CD274、CD86、CD44 和TNFRSF9。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析均采用R 語言（版本4.0.3）。癌組織與癌旁組織FAAH 的表達(dá)、FAAH 高表達(dá)組和低表達(dá)組免疫細(xì)胞差異比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。不同腫瘤分期癌組織中FAAH 的表達(dá)差異比較用多重t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 曲線和log-rank 檢驗(yàn)。分析基因關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAAH 的泛癌表達(dá)分析 （1）相對于癌旁正常組織樣本，在7 種癌癥中FAAH 顯著高表達(dá)（P＜0.05），包 括BRCA、COAD、LAML、PRAD、READ、THYM 和UCEC；與此相反，在包括ACC、DLBC、ESCA、GBM、KICH、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、PAAD、SKCM、STAD、TGCT 及THCA在內(nèi)的15 種癌組織中，F(xiàn)AAH 基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖1A。（2）TCGA 臨床分期數(shù)據(jù)分析顯示，在BLCA、KICH 和THCA 等癌癥晚期中FAAH 表達(dá)下調(diào)，在STAD 等癌癥晚期中表達(dá)穩(wěn)定（圖1B）。其中，與正常甲狀腺組織相比，THCA早、晚期腫瘤中FAAH 基因表達(dá)依次顯著下調(diào)。

圖1 FAAH 在不同癌癥和分期中的表達(dá)水平Fig.1 FAAH expression profiles in different cancers and stages

2.2 FAAH 與生存預(yù)后的關(guān)系 （1）與FAAH 低表達(dá)組相比，在KIRP、KIRC、LUAD、THYM、STAD 和UCEC 等癌癥中FAAH 高表達(dá)組OS 更長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），STAD 和KIRC 結(jié)果見圖2A。（2）在KIRP、KIRC、LUAD、STAD（P=0.020）和UCEC（P= 0.001）等癌癥中，F(xiàn)AAH 高表達(dá)組DSS 優(yōu)于FAAH 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），STAD 和KIRC 結(jié)果見圖2B。（3）在STAD、KIRC、LUAD 和KICH 等癌癥中，F(xiàn)AAH 高表達(dá)組比低表達(dá)組比PFI 更長，預(yù)后更好（P＜0.05），STAD 和KIRC結(jié)果見圖2C。（4）在STAD 中，F(xiàn)AAH 高表達(dá)組DFI優(yōu)于低表達(dá)組（P=0.008），見圖2D。

圖2 胃腺癌STAD 和腎透明細(xì)胞癌KIRC 中FAAH 表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Relationship between FAAH expression and survival time in gastric adenocarcinoma STAD and renal clear cell carcinoma KIRC

2.3 FAAH 與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系

2.3.1 FAAH與腫瘤免疫細(xì)胞的關(guān)系 （1）在KIRC中，F(xiàn)AAH 高表達(dá)組和低表達(dá)組CD8+T 細(xì)胞（Tcells CD8）、CD4 記憶T 細(xì)胞激活（T cells CD4 memoryactivated）、濾泡輔助性T細(xì)胞（T cell follicular helper）、γδT 細(xì)胞（T cells gamma delta）、NK 靜息細(xì)胞（NK cells resting）、NK 激活細(xì)胞（NK cell sactivated）、單核細(xì)胞（monocytes）、M0 巨噬細(xì)胞（macrophages M0）、靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞（dendritic cells resting）、肥大細(xì)胞靜息（mast cells resting）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，CD4 記憶T 細(xì)胞激活、γδT 細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞在FAAH 低表達(dá)組中聚集顯著增多；NK 靜息細(xì)胞和靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞等聚集顯著下降（圖3A）。（2）在STAD 中，F(xiàn)AAH 高表達(dá)組和低表達(dá)組的CD4 記憶T 細(xì)胞激活、NK 激活細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞靜息差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，F(xiàn)AAH低表達(dá)組單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞靜息富集顯著上調(diào)；CD4 記憶T 細(xì)胞激活、NK 激活細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞富集顯著減少（圖3B）。

圖3 KIRC 和STAD 中FAAH 與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系Fig.3 Relationship between FAAH and tumor-infiltrating immune cells in KIRC and STAD

2.3.2 FAAH 與腫瘤免疫抑制基因的關(guān)系 在BLCA、BRCA、COAD、LGG、LIHC、LUAD 和STAD等多種腫瘤中，F(xiàn)AAH 的表達(dá)與TIGIT、BTLA、CD 244、ICOS、CD 40、CD 48、CD 28、CD 200R1、TMIGD 2 和PDCD 1 等基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖4）。

圖4 FAAH 與腫瘤免疫抑制基因的相關(guān)性Fig.4 Correlation between FAAH and tumor immunosuppressive genes

3 討論

本研究對FAAH 在各種癌癥中與預(yù)后相關(guān)性及其與免疫微環(huán)境調(diào)控的關(guān)系進(jìn)行了探討。首先，在表達(dá)水平上的分析發(fā)現(xiàn)FAAH 在癌癥中廣泛存在表達(dá)改變，并且在胰腺癌（PAAD）、肺腺癌（LUAD）、胃腺癌（STAD）等多種癌癥中的表達(dá)普遍下調(diào)。在分期差異表達(dá)分析中，膀胱移行細(xì)胞癌（BLCA）、KICH、THCA 和STAD 等少數(shù)腫瘤的分期與FAAH 的表達(dá)存在緊密聯(lián)系。在這些腫瘤的

晚期（StageⅢ或Ⅳ）中，F(xiàn)AAH 表達(dá)水平顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)AAH 可能參與調(diào)控上述癌癥的進(jìn)展。其次，應(yīng)用Kaplan-Meier 進(jìn)行的生存分析，發(fā)現(xiàn)在KIRC、LUAD、STAD、KIRP 等癌癥中FAAH高表達(dá)的患者預(yù)后更好。該結(jié)果提示，F(xiàn)AAH在這些癌癥中可能充當(dāng)保護(hù)因子的作用。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）是生物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)、控制心血管張力、能量代謝、免疫以及生殖等生理活動(dòng)［13］。然而，ECS 在癌癥當(dāng)中的作用尚未闡明。FAAH 是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的重要組成，主要負(fù)責(zé)水解花生四烯酰乙醇酰胺（arachidonoyl ethanol amide，AEA）。大麻素是當(dāng)前被研究最多的ESC 成分。有研究顯示大麻素及其衍生物能夠緩和化療引起的惡心、嘔吐和疼痛等癌癥相關(guān)癥狀，并且抑制腫瘤惡化［14］。然而，最新的研究表明，AEA 發(fā)揮抗腫瘤免疫抑制的作用，并且血清中高AEA 水平的癌癥患者生存率較差［15］。有研究表明，F(xiàn)AAH 基因缺失或用FAAH 抑制劑處理的小鼠會導(dǎo)致內(nèi)源性AEA 水平的升高［16-17］。XIONG 等［15］最新的研究發(fā)現(xiàn)，大麻素的主要成分Δ9-四氫大麻酚（THC）具有降低PD-1 阻斷的療效，AEA 可以阻礙抗腫瘤免疫，表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（ECS）具有免疫抑制作用。這些結(jié)果都表明，F(xiàn)AAH 作為AEA 的主要水解酶或通過干預(yù)免疫微環(huán)境參與調(diào)控腫瘤進(jìn)程。然而，具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究探明。

在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤不斷進(jìn)化并可能呈現(xiàn)出各種機(jī)制來逃避腫瘤免疫監(jiān)視及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤免疫逃逸的一個(gè)主要機(jī)制就是免疫檢查點(diǎn)通路的參與［18-19］。免疫檢查點(diǎn)（immune check point）是一類由免疫細(xì)胞表達(dá)的免疫抑制分子，能夠調(diào)節(jié)免疫激活程度，對防止自身免疫作用的發(fā)生具有重要作用。免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)和功能異常是很多疾病發(fā)生的重要原因［20-23］。在本研究中，相關(guān)性分析也證明了FAAH表達(dá)水平與癌癥免疫相關(guān)。CIBERSORT 是基于線性支持向量回歸（linear support vector regression）以不同免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣對組織或細(xì)胞RNA 表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積后計(jì)算22 種白細(xì)胞相對比例的工具［24］。本研究利用CIBERSORT 分析發(fā)現(xiàn)，在KIRC 和STAD 中FAAH 表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤程度顯著相關(guān)。腎透明細(xì)胞癌中FAAH 低表達(dá)組中CD4+T 記憶細(xì)胞與γδT 細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），胃腺癌中FAAH 低表達(dá)組浸潤顯著較少的單核細(xì)胞（P＜0.05），這些免疫抑制表現(xiàn)與低表達(dá)組生存預(yù)后較差相一致。此外，F(xiàn)AAH 與40 多個(gè)常見的免疫抑制相關(guān)基因的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在BLCA、BRCA、COAD、LGG、LIHC、LUAD 和STAD等多種腫瘤中，F(xiàn)AAH的表達(dá)與TIGIT、BTLA、CD 244、ICOS、CD 40、CD 48、CD 28、CD 200R1、TMIGD 2 和PDCD 1 等基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在低表達(dá)預(yù)后較差的腎透明細(xì)胞癌、胃腺癌中，F(xiàn)AAH 低表達(dá)組與包含免疫檢查點(diǎn)基因在內(nèi)的多個(gè)免疫抑制相關(guān)基因的表達(dá)升高相關(guān)，提示FAAH 可能通過影響免疫抑制基因表達(dá)來調(diào)控免疫微環(huán)境形成，這方面內(nèi)容需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。腫瘤微環(huán)境的抑制性變化及異質(zhì)性對腫瘤發(fā)生發(fā)展、療效差別及耐藥性有巨大影響［25-29］。這提示，F(xiàn)AAH 可能通過調(diào)節(jié)特異性免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)腫瘤的免疫模式。

綜上所述，本研究表明FAAH 在多種腫瘤中差異表達(dá)并與預(yù)后顯著相關(guān)，可作為包括膀胱移行細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、肺腺癌及胃腺癌在內(nèi)的多種惡性癌癥的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物，并與免疫浸潤有關(guān)，可作為癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。