基于拉曼光譜的雞蛋新鮮度檢測(cè)及分類方法

譚航彬,姜 麗,金尚忠,2,徐 睿,李伊凡,于自珍,蔣彩鈴

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 光學(xué)與電子科技學(xué)院,浙江 杭州 310018;2.中國(guó)計(jì)量大學(xué)光學(xué)與電子科技學(xué)院 浙江省現(xiàn)代計(jì)量測(cè)試技術(shù)及儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018)

雞蛋作為人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚氖澄?其營(yíng)養(yǎng)豐富,價(jià)格低廉,深受廣大人民群眾的喜愛。根據(jù)2020—2021年中國(guó)雞蛋市場(chǎng)年度報(bào)告,2021年中國(guó)雞蛋產(chǎn)量為1 890萬(wàn)噸,同比增長(zhǎng)1.48%。然而,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,雞蛋非常容易腐敗變質(zhì)。變質(zhì)雞蛋不僅降低了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且給消費(fèi)者帶來(lái)了物質(zhì)和經(jīng)濟(jì)上的損失[1]。因此,在雞蛋的加工、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中對(duì)變質(zhì)蛋進(jìn)行檢測(cè),可以降低雞蛋的加工成本和運(yùn)輸成本,降低人們購(gòu)買變質(zhì)蛋的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來(lái),由于科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的方法被用來(lái)檢測(cè)雞蛋的新鮮度。Dong等提出利用光纖探針采集雞蛋赤道區(qū)近紅外光譜,利用PLSR建立預(yù)測(cè)模型評(píng)價(jià)雞蛋新鮮度[2-3]。基于拉曼散射原理的拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)由于具有快捷、靈敏、無(wú)損等特點(diǎn),也被用于食品質(zhì)量領(lǐng)域的檢測(cè)研究[4]。Liu等提出了Raman光譜法,利用蛋殼表皮的拉曼光譜和雞蛋新鮮度參數(shù)建立預(yù)測(cè)模型來(lái)評(píng)價(jià)雞蛋質(zhì)量[5]。Akbarzadeh等開發(fā)了一種基于波導(dǎo)和網(wǎng)絡(luò)分析儀的微波光譜法,用于無(wú)損預(yù)測(cè)幾種雞蛋新鮮度指標(biāo)[6]。Yao等提出了一種基于VIS-NIR-HSI實(shí)現(xiàn)雞蛋哈夫單位分類的方案[7]。Freni等人利用脈沖熱模擬反射提出了一種基于主動(dòng)熱成像的雞蛋新鮮度評(píng)價(jià)方法[8]。這些方法雖然可以無(wú)損檢測(cè)蛋殼,但會(huì)受到蛋殼的影響。殼上附著的雜質(zhì)和微生物可能會(huì)影響殼蛋的檢測(cè)光譜,從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

本文以雞蛋作為研究對(duì)象,利用拉曼光譜儀采集0～40 d的雞蛋蛋黃和蛋清拉曼光譜,并通過(guò)PCA-LDA和OPLS-LDA模型進(jìn)行分類,證明了拉曼光譜分析對(duì)雞蛋新鮮度分類鑒別的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

同一種類的新鮮雞蛋120枚(購(gòu)買自正大蛋業(yè)有限公司,每一枚雞蛋上都印有雞蛋的生產(chǎn)日期2021年6月15日)。

在檢測(cè)雞蛋的物理指標(biāo)過(guò)程中,主要用到了以下儀器和材料:超聲波清洗儀、超聲波清洗劑、無(wú)菌培養(yǎng)皿、剪刀、無(wú)水乙醇、游標(biāo)卡尺。

在拉曼光譜檢測(cè)的過(guò)程中,主要用到了產(chǎn)于法國(guó)公司Horiba的顯微共聚焦拉曼光譜儀,其型號(hào)是LabBAM HR Evolution。

2 雞蛋新鮮度檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)將120枚新鮮雞蛋統(tǒng)一放在常溫、無(wú)光照、濕度合適的環(huán)境保存,每天取3枚雞蛋進(jìn)行新鮮度物理指標(biāo)和拉曼光譜的檢測(cè),持續(xù)檢測(cè)40 d。在本實(shí)驗(yàn)中,為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,我們每次對(duì)實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行消毒清潔。首先用超聲波清洗儀超聲10 min,然后再用無(wú)水乙醇超聲清洗10 min,最后將實(shí)驗(yàn)器材放到干燥箱中干燥。

2.1 雞蛋新鮮度物理指標(biāo)檢測(cè)

雞蛋新鮮度是檢測(cè)和評(píng)價(jià)雞蛋新鮮程度的指標(biāo),主要參數(shù)包括哈夫單位、氣室的大小、蛋白和pH值、蛋黃指數(shù)、以及蛋黃膜的強(qiáng)度,殼的強(qiáng)度和厚度[9-13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雞蛋的哈夫單位、蛋黃指數(shù)、氣室直徑和高度進(jìn)行了檢測(cè)。

2.1.1 哈夫單位的測(cè)定

哈夫單位值HU(Haugh Unit)是美國(guó)農(nóng)業(yè)部蛋品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)和表示蛋品新鮮度的指標(biāo),新鮮蛋哈夫單位在72以上,72以下是不新鮮雞蛋,不可食用。哈夫單位計(jì)算公式:

HU=100×lg(h+7.57-1.7×m0.37)。

(1)

式(1)中:HU是哈夫單位;h是蛋清的高度,mm;m是整個(gè)雞蛋的質(zhì)量,g[14]。

本文對(duì)整個(gè)雞蛋稱量3次取平均值。隨后將雞蛋打破,讓蛋清和蛋黃攤開在水平臺(tái)面上,用游標(biāo)卡尺測(cè)量蛋清高度,取蛋清三處不同的地方測(cè)量其高度取平均值。最后根據(jù)式(1)計(jì)算HU。圖1(a)為0～40 d內(nèi)雞蛋哈夫單位隨時(shí)間的變化關(guān)系。

2.1.2 蛋黃指數(shù)的測(cè)定

蛋黃指數(shù)YI(Yolk Index)是指蛋黃高度與蛋黃直徑的比值,可以用來(lái)表示雞蛋的新鮮度,存放時(shí)間越短(越新鮮)的雞蛋,蛋黃指數(shù)越大,一級(jí)蛋蛋黃指數(shù)≥0.40,二級(jí)蛋蛋黃指數(shù)≥0.36,三級(jí)蛋蛋黃指數(shù)≤0.35。計(jì)算公式為

YI=h/Φ。

(2)

式(2)中:YI是蛋黃指數(shù);h是蛋黃高度,mm;Φ是蛋黃直徑,mm[14]。

本實(shí)驗(yàn)將雞蛋打破,平攤在水平臺(tái)面上,取蛋黃上的三處不同位置分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量其高度,然后取平均值。同時(shí)從三個(gè)不同方向測(cè)量蛋黃的直徑,這三條直徑都經(jīng)過(guò)一個(gè)圓心,然后取平均值,最后根據(jù)式(2)計(jì)算出雞蛋的蛋黃指數(shù)。圖1(b)為0～40 d內(nèi)雞蛋蛋黃指數(shù)隨時(shí)間的變化關(guān)系。

2.1.3 氣室直徑和高度的測(cè)定

在雞蛋的內(nèi)部有一個(gè)蛋殼和雞蛋膜相互脫離的地方,名叫氣室。氣室的大小可以用來(lái)衡量雞蛋的新鮮度。一般通過(guò)檢測(cè)氣室直徑和氣室高度來(lái)分析氣室大小。

本文用剪刀小心的將蛋殼的其余部分剪掉,只保留蛋殼的氣室,然后用游標(biāo)卡尺從三個(gè)方向測(cè)量氣室的直徑和高度,隨后取平均值,得到蛋殼氣室直徑和氣室高度。如圖1(c)(d)為0～40 d內(nèi)雞蛋氣室高度和直徑隨時(shí)間變化關(guān)系。

圖1 雞蛋新鮮度指標(biāo)隨時(shí)間變化關(guān)系圖

2.2 雞蛋拉曼光譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

在檢測(cè)完雞蛋的哈夫單位等新鮮度物理指標(biāo)后,將雞蛋放入事先消毒清潔并且烘干的培養(yǎng)皿中,然后檢測(cè)蛋黃和蛋清的拉曼光譜。

2.2.1 拉曼光譜檢測(cè)

在采集雞蛋的拉曼光譜之前,要先利用單晶硅片對(duì)LabBAM HR Evolution型顯微共聚焦拉曼光譜儀進(jìn)行校準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)中,檢測(cè)雞蛋用的是10×長(zhǎng)焦物鏡,選用了波長(zhǎng)為532 nm的激發(fā)光,600 gr/mm的全息光柵,拉曼光譜的采集范圍設(shè)置在0～1 800 cm-1這個(gè)區(qū)間,積分次數(shù)是5次,積分時(shí)間為10 s。每一組樣品的蛋黃拉曼光譜和蛋清拉曼光譜都在3個(gè)不同樣品點(diǎn)上采集,對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理后用于分類分析。

2.2.2 光譜的預(yù)處理

為了最大限度地確保光譜信息的可靠性,減少干擾因素對(duì)分析結(jié)果的影響。在本實(shí)驗(yàn)中采用LabSpec軟件對(duì)采集到的雞蛋光譜進(jìn)行了去基線、平滑和平均光譜處理這三種預(yù)處理方法。

如圖2(a)(b),通過(guò)采用背底線型線段組合的方式進(jìn)行去基線處理,將這些線段不斷循環(huán)最小二乘擬合直到擬合成水平基線為止。由于白噪聲的存在,使得到的光譜的信噪比降低,因此平滑處理是光譜預(yù)處理環(huán)節(jié)的重要步驟。如圖2(c)(d)所示,平滑之后的光譜圖特征峰更加明顯,白噪聲被消除,光譜信噪比得到提高,光譜質(zhì)量得到極大的改善,這對(duì)于后面的光譜分析更加有利。

最后進(jìn)行平均光譜處理。通過(guò)對(duì)采集到的同一個(gè)樣品的蛋清和蛋黃的多條光譜取平均,可以極大地減小因?yàn)榈扒搴偷包S分布不均勻所導(dǎo)致的檢測(cè)差異。在對(duì)同一樣品的3條蛋黃拉曼光譜和3條蛋清拉曼光譜進(jìn)行平滑處理和去基線處理之后,求其平均光譜。如圖2(e)(f)分別對(duì)比儲(chǔ)存了1天的雞蛋蛋清的3條拉曼光譜以及平均光譜。

圖2 蛋清拉曼光譜預(yù)處理

2.2.3 PCA-LDA模型

主成分分析法(PCA)是一種面對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)指標(biāo)時(shí),通過(guò)找到各個(gè)指標(biāo)之間的相互關(guān)系,以一個(gè)或者幾個(gè)主要的指標(biāo)來(lái)對(duì)事件進(jìn)行分析篩選的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法[15]。

正交矯正的偏最小二乘分析(OPLS)，是一種適用于樣本內(nèi)部存在多種數(shù)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系和影響因子或者樣本數(shù)量遠(yuǎn)小于被研究的影響因子數(shù)量的多元統(tǒng)計(jì)方法。OPLS也屬于偏最小二乘分析方法,能夠?qū)⒆宰兞亢蛻?yīng)變量同時(shí)進(jìn)行主成分分解。

線性判別分析(LDA)作為一種線性學(xué)習(xí)方法,在數(shù)據(jù)分析中也是特征降維的工具,且是一種有監(jiān)督的降維方式[16]。其原理是如果每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都有各自的標(biāo)簽,根據(jù)帶標(biāo)簽的數(shù)據(jù)點(diǎn),通過(guò)投影的方式,將數(shù)據(jù)點(diǎn)投影到維度相較于之前更低的空間當(dāng)中去,并進(jìn)行進(jìn)一步的分類區(qū)分,相同類型的數(shù)據(jù)點(diǎn)會(huì)在低維度的空間中相互靠近,不同類型的點(diǎn)在投影后就會(huì)分離。

3 雞蛋拉曼光譜分析及分類

3.1 蛋黃和蛋清的平均拉曼光譜

圖3(a)和(c)分別是雞蛋蛋黃和蛋清在0～40 d內(nèi)的拉曼光譜圖。由于拉曼光譜的數(shù)量較多且相鄰幾天的雞蛋蛋黃拉曼光譜的強(qiáng)度變化較小,因此本實(shí)驗(yàn)分別選取了7個(gè)不同儲(chǔ)存時(shí)間的雞蛋樣品平均拉曼光譜,圖中的a、b、c、d、e、f和g分別是儲(chǔ)存了0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和40 d的雞蛋蛋液平均拉曼光譜圖。從圖3(a)和(c)中可以觀察到隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,蛋黃和蛋清拉曼光譜的幾處特征峰沒(méi)有發(fā)生偏移,但是這些拉曼峰的拉曼強(qiáng)度卻在逐漸減弱,這說(shuō)明隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,雞蛋內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在逐漸發(fā)生變化,導(dǎo)致這一變化的原因一部分是由于雞蛋自身的呼吸作用消耗了一些營(yíng)養(yǎng),導(dǎo)致雞蛋蛋黃的拉曼強(qiáng)度發(fā)生變化,還有部分原因是隨著時(shí)間的增長(zhǎng),雞蛋內(nèi)部細(xì)菌等微生物的繁殖,使得雞蛋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少?gòu)亩鴮?dǎo)致拉曼光譜的強(qiáng)度降低[17]。

為了更直觀的表現(xiàn)蛋黃和蛋清在40 d內(nèi)的拉曼光譜強(qiáng)度的變化,以蛋黃拉曼光譜1 156 cm-1處和蛋清光譜1 004 cm-1處的特征峰的拉曼強(qiáng)度作為研究對(duì)象,做了圖3(b)和(d)。從圖3(b)和(d)中可以發(fā)現(xiàn)在這40 d中蛋黃和蛋清的拉曼光譜的光譜強(qiáng)度均是逐漸減小的。通過(guò)查閱拉曼光譜的譜峰歸屬,知道1 004 cm-1峰位對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式是s(C-C),rb(C-C),對(duì)應(yīng)的物質(zhì)是苯丙氨酸;1 156 cm-1是對(duì)應(yīng)的化學(xué)鍵是C—H,對(duì)應(yīng)多種氨基酸;1 447 cm-1峰位對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式是bυ(CH2),對(duì)應(yīng)的物質(zhì)是膠原蛋白[18-22]。當(dāng)雞蛋中的氨基酸由于自身代謝和細(xì)菌的分解導(dǎo)致含量減低時(shí),拉曼光譜的幾處特征峰的強(qiáng)度也相應(yīng)降低。

3.2 新鮮與不新鮮雞蛋分類

本實(shí)驗(yàn)采用PCA-LDA和OPLS-LDA模型對(duì)采集到的蛋黃和蛋清光譜進(jìn)行分類,通過(guò)該模型實(shí)現(xiàn)基于拉曼光譜法的雞蛋的新鮮與否分類鑒別。

圖3 蛋黃和蛋清拉曼光譜隨時(shí)間變化關(guān)系圖

通過(guò)檢測(cè)雞蛋的物理新鮮度指標(biāo)(哈夫單位、蛋黃指數(shù)、氣室直徑和寬度)將雞蛋分為新鮮和不新鮮兩類。200份拉曼光譜樣本分成了80份新鮮雞蛋樣本光譜(其中包括40份新鮮蛋黃和40份新鮮蛋清)和120份不新鮮雞蛋樣本光譜(其中包括40份不新鮮蛋黃和80份不新鮮蛋清)。

圖4(a)到(d)分別是基于PCA-LDA和OPLS-LDA模型的蛋黃和蛋清光譜分類得分圖。圖中紅色圓點(diǎn)代表新鮮雞蛋的拉曼光譜,藍(lán)色三角點(diǎn)代表不新鮮雞蛋的拉曼光譜,橢圓為95%置信區(qū)間。從圖中可以發(fā)現(xiàn),基于PCA-LDA鑒別模型對(duì)蛋黃和蛋清輸入光譜進(jìn)行分類的結(jié)果比OPLS-LDA模型更理想,處于95%的置信區(qū)間之外的點(diǎn)更少。通過(guò)比較圖4(a)和(c)可以明顯發(fā)現(xiàn)PCA-LDA模型對(duì)蛋黃的光譜的分類效果明顯比OPLS-LDA模型好,圖4(a)中新鮮蛋黃和不新鮮蛋黃的有較明顯的分類,代表新鮮蛋黃的紅色圓點(diǎn)全部分布于藍(lán)色三角點(diǎn)的左邊,兩類光譜在分布上幾乎沒(méi)有重疊,僅4個(gè)點(diǎn)重疊在一起。而圖4(c)中新鮮蛋黃和不新鮮蛋黃的光譜沒(méi)有明顯的分類,兩者之間具有大面積的重疊區(qū)域,且處于95%置信區(qū)間之外的點(diǎn)更多。

圖4 基于PCA-LDA和OPLS-LDA分類模型對(duì)蛋黃和蛋清拉曼光譜分類圖

為了對(duì)雞蛋拉曼光譜進(jìn)行更好的分類,我們將得到的200張拉曼光譜進(jìn)行求二階導(dǎo)數(shù)處理,然后將得到的二階導(dǎo)數(shù)光譜作為輸入量,并對(duì)比其分類結(jié)果。

如圖5(a)到(d)分別是基于PCA-LDA和OPLS-LDA模型的蛋黃蛋清二階導(dǎo)光譜分類得分圖。圖中圓點(diǎn)代表新鮮雞蛋的蛋清光譜,三角點(diǎn)代表不新鮮雞蛋的蛋清光譜,橢圓為95%置信區(qū)間。從圖中可以發(fā)現(xiàn),相較于原始光譜,二階導(dǎo)光譜在PCA-LDA和OPLS-LDA兩種模型中的分類效果更加理想,對(duì)兩類蛋清光譜有明顯的區(qū)分,圓點(diǎn)全部位于三角點(diǎn)的左邊,得分圖中新鮮與不新鮮的光譜沒(méi)有重疊區(qū)域,而且處于95%的置信區(qū)間之外的點(diǎn)也比原始光譜更少,因此PCA-LDA和OPLS-LDA模型對(duì)雞蛋二階導(dǎo)光譜具有很好的分類效果。

圖5 基于PCA-LDA和OPLS-LDA分類模型對(duì)蛋黃和蛋清二階導(dǎo)光譜分類圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩種模型對(duì)雞蛋樣品的新鮮度識(shí)別能力,本實(shí)驗(yàn)還采用了留一法交叉驗(yàn)證的方法對(duì)這兩種分類模型進(jìn)行準(zhǔn)確率的檢測(cè)。將單個(gè)雞蛋的拉曼光譜作為測(cè)試數(shù)據(jù),將其余拉曼光譜作為分類器的訓(xùn)練數(shù)據(jù),并對(duì)每個(gè)樣品光譜進(jìn)行驗(yàn)證。最后得到PCA-LDA對(duì)蛋黃和蛋清分類的準(zhǔn)確率為96.3%和96.7%,OPLS-LDA對(duì)蛋黃和蛋清分類的準(zhǔn)確率為98.6%和99.2%。由此可得OPLS-LDA模型對(duì)蛋黃和蛋清二階導(dǎo)光譜分類效果最佳。

4 結(jié) 語(yǔ)

本論文首先檢測(cè)雞蛋的新鮮度物理指標(biāo):哈夫單位、蛋黃指數(shù)、蛋殼氣室直徑和高度。然后通過(guò)這些新鮮度物理指標(biāo)將200個(gè)雞蛋樣本光譜分為80張新鮮雞蛋光譜和120張不新鮮雞蛋光譜(其中新鮮雞蛋蛋黃平均光譜40張,新鮮雞蛋蛋清40張,不新鮮雞蛋蛋黃40張,不新鮮雞蛋蛋清80張)。然后分別將蛋黃和蛋清的拉曼光譜和二階導(dǎo)光譜輸入到PCA-LDA和OPLS-LDA模型中。OPLS-LDA模型對(duì)蛋黃和蛋清二階導(dǎo)拉曼光譜的分類效果最佳,準(zhǔn)確率分別達(dá)到了98.6%和99.2%。綜上,基于拉曼光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)雞蛋新鮮程度的快速檢測(cè)。