內(nèi)熱針療法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細(xì)胞凋亡及Fas和FasL表達(dá)的影響?

陳耘東，田心保，張金晨,2，賴喆鎣，李小龍，田富寶，林瑞珠,2△，許建峰,2△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床最常見(jiàn)的OA類型，常累及關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織，如關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和滑膜，最終導(dǎo)致患者膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙[1，2]，其發(fā)病率高、病程長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨在KOA發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5，6]。成骨細(xì)胞作為軟骨下骨中維持骨形成的主要細(xì)胞，其凋亡加速會(huì)抑制軟骨下骨形成，導(dǎo)致骨重塑失衡，破壞骨穩(wěn)態(tài)，引發(fā)KOA的演變[7，8]。成骨細(xì)胞的凋亡與死亡因子(factor associated suicide，F(xiàn)as)、Fas配體(fas ligand，F(xiàn)asL)表達(dá)密切相關(guān)[9]，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要系統(tǒng)。FasL是Fas的配體，通過(guò)與Fas結(jié)合激活凋亡信號(hào)，使其由細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)一系列酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。因此，調(diào)控軟骨下骨成骨細(xì)胞的凋亡及其增殖活化、延緩其功能衰退成為控制KOA病情發(fā)展的關(guān)鍵。目前，對(duì)于KOA還沒(méi)有很好的治療方法，主要采用非甾體消炎藥物、基因療法、針刺、中藥、手術(shù)等，所有治療方法都是為改善癥狀及關(guān)節(jié)功能[11，12]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)熱針療法對(duì)KOA實(shí)驗(yàn)兔具有良好的治療效果[13]，但內(nèi)熱針治療KOA作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)還較缺乏了解。因此本實(shí)驗(yàn)擬探討內(nèi)熱針對(duì)兔KOA模型的治療效果，分析其對(duì)軟骨下骨成骨細(xì)胞凋亡及Fas、FasL 表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確其治療KOA的部分作用機(jī)制。本研究通過(guò)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2018064)。

1 材料與方法

1.1 試劑

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)YT137)，北京百奧萊博科技有限公司；Fas抗體(貨號(hào)abs135556，稀釋比1∶200)、FasL抗體(貨號(hào)abs130094，稀釋比1∶200)，愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司；二抗山羊抗兔(貨號(hào)ab140509)，美國(guó)Abcam 公司；蘇木素與伊紅染色液(貨號(hào)PH0516)，福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器

內(nèi)熱針(貨號(hào)RS15 A，直徑0.5 mm，針總長(zhǎng)100 mm，針體長(zhǎng)65 mm，針柄長(zhǎng)35 mm，針柄直徑2.2 mm)、內(nèi)熱針治療儀(KF型40路內(nèi)熱針治療儀)，中國(guó)濟(jì)寧佳科醫(yī)療科技有限公司；RM2235型石蠟切片機(jī)，Leica公司；BX51型顯微鏡，Olympus公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物與分組

30只6月齡清潔級(jí)健康新西蘭大白兔，雌雄各半，體質(zhì)量(2.5±0.2)kg，由西安交大動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK(寧)2018-0017。大白兔飼養(yǎng)于西安交大動(dòng)物中心，單籠飼養(yǎng)，12 h晝夜交替，實(shí)驗(yàn)室維持一定的溫度(22±2)℃和濕度(50%±15%)，動(dòng)物自由攝食與飲水，所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只新西蘭兔分為空白組10只，造模組20只。采用Hulth法制備兔KOA模型，造模成功后再隨機(jī)分為模型組治療組各10只。

2.2 造模方法

采用改良Hulth造模方法[14]，實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后開(kāi)始造模。手術(shù)經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶(1 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉后將實(shí)驗(yàn)兔固定于手術(shù)臺(tái)上，對(duì)左后肢膝關(guān)節(jié)局部剃毛、備皮、鋪巾和消毒。取左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)進(jìn)行長(zhǎng)約3 cm的縱切口，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶暴露關(guān)節(jié)腔，然后切除內(nèi)側(cè)半月板并切斷前交叉韌帶。止血后沖洗關(guān)節(jié)腔，抽屜實(shí)驗(yàn)檢查陽(yáng)性后清創(chuàng)縫合敷貼包扎。上述步驟嚴(yán)格按無(wú)菌操作程序進(jìn)行，連續(xù)7d對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行局部注射青霉素鈉20萬(wàn) U/只以避免術(shù)后感染及炎癥反應(yīng)，術(shù)后傷肢不固定，自主活動(dòng)，單籠飼養(yǎng)。造模術(shù)后4周可制備兔KOA模型[15]，造模成功后次日進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。造模4周后，隨機(jī)抽取空白組和造模組各2只實(shí)驗(yàn)兔，麻醉后對(duì)實(shí)驗(yàn)兔左膝關(guān)節(jié)行影像學(xué)X線檢查。

2.3 干預(yù)方法

于造模4周后進(jìn)行治療干預(yù)。將治療組實(shí)驗(yàn)兔固定于兔臺(tái)上，在兔左膝關(guān)節(jié)周圍進(jìn)行內(nèi)熱針布點(diǎn)：選髕上正中點(diǎn)與肢體縱軸的垂直線兩側(cè)各定位 1點(diǎn)，共計(jì)2點(diǎn)；髕下正中定1點(diǎn)，內(nèi)外膝眼各1點(diǎn)，共計(jì)5點(diǎn)。進(jìn)針后針尖抵觸骨膜后停止進(jìn)針，針體連接內(nèi)熱針治療儀后設(shè)定溫度為 42 ℃，治療時(shí)間為20 min，每周1次，共治療4次。其他2組實(shí)驗(yàn)兔僅兔臺(tái)固定相同時(shí)間不采取任何干預(yù)。

2.4 行為學(xué)評(píng)價(jià)

于干預(yù)前和末次內(nèi)熱針干預(yù)后次日根據(jù)改良Lequesne MG量表進(jìn)行各組實(shí)驗(yàn)兔行為學(xué)評(píng)價(jià)，包括局部疼痛度(0～3 分)、步態(tài)(0～3 分)、關(guān)節(jié)腫脹程度(0～2 分)、關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍(0～3 分)4個(gè)方面，分?jǐn)?shù)越高提示病變?cè)絿?yán)重。①疼痛程度(局部疼痛刺激反應(yīng)：用手指擠壓膝關(guān)節(jié)，按刺激反應(yīng)程度不同分為4個(gè)等級(jí))：無(wú)異常疼痛反應(yīng)記0分；患肢出現(xiàn)收縮記1分；患肢收縮、痙攣伴輕度全身反應(yīng)記2分；患肢劇烈收縮痙攣、全身顫抖、亂竄、掙扎記3分；②步態(tài)改變(按照患肢行走、奔跑時(shí)的步態(tài)分為4個(gè)等級(jí))：正常行走記0分；患肢奔跑時(shí)輕度跛行、踏地有力記1分；患肢參與行走但跛行明顯記2分；患肢不能參與行走、不能觸地、蹬地記3分；③關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍(按照患肢膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍角度分為4個(gè)等級(jí)，其中以伸直位為 0°)：0分為≥90°；1 分為≥45°且<90°；2分為≥15° 且<45°；3分為≤15°；④關(guān)節(jié)腫脹程度(按照關(guān)節(jié)的腫脹程度分為3個(gè)等級(jí))：無(wú)腫脹記0分；輕度腫脹、骨性標(biāo)記線變淺記1分；重度腫脹、骨性標(biāo)記線消失記2分。

2.5 軟骨下骨取材

行為學(xué)評(píng)價(jià)后，3組實(shí)驗(yàn)兔均采用空氣栓塞法處死，每組各取材10只。將處死的實(shí)驗(yàn)兔固定于兔臺(tái)上，伸直實(shí)驗(yàn)兔左后肢，用手術(shù)刀暴露膝關(guān)節(jié)腔，咬骨鉗截取脛骨干骺端完整地剔除周圍軟組織，精確分離關(guān)節(jié)軟骨下骨。得到的軟骨下骨組織分為2份，一份置于40 g/L 多聚甲醛液固定 2 d，10%EDTA 脫鈣液 2 周，常規(guī)脫水石蠟包埋、切片，制備石蠟切片，用于HE染色、TUNEL染色法檢測(cè)；另一份置于凍存管內(nèi)，放入-80 ℃冰箱保存，供蛋白免疫印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)使用。

2.6 HE染色

觀察各組實(shí)驗(yàn)兔左膝關(guān)節(jié)軟骨下骨組織的病理學(xué)改變。取石蠟包埋塊4 μm切片，脫蠟后常規(guī)HE染色，光鏡下觀察軟骨下骨組織病理學(xué)改變。

2.7 TUNEL法檢查成骨細(xì)胞凋亡情況

取石蠟包埋塊，蠟塊切成4 μm的切片，常規(guī)脫蠟后行TUNEL染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨下骨的病理改變。TUNEL 染色陽(yáng)性標(biāo)記為核染色為黃或棕黃色，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)軟骨下骨組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)

取-80 ℃冰箱保存的軟骨下骨組織約50 mg，液氮下研磨至粉末狀，用PBS洗滌1次后加入裂解液，提取軟骨下骨總蛋白測(cè)量其濃度，制備分離膠和濃縮膠，上樣并經(jīng)過(guò)SDS-Page凝膠電泳、剝膠、轉(zhuǎn)膜，分別加入Fas、FasL一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，然后ECL 顯影、定影、洗片、凝膠、成像。采用Image-Pro Plus軟件分析，參照以GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)軟骨下骨組織中Fas、FasL的mRNA表達(dá)

取-80 ℃冰箱保存的軟骨下骨組織約50 mg，液氮下研磨至粉末狀，細(xì)胞裂解法提取軟骨下骨總RNA，并用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)每個(gè)樣本濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明配成逆轉(zhuǎn)錄體系，得到cDNA待用，以其為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Fas：F 5′-CCTGTATTGCTGGCTCACTG-3′，R 5′-GTG TACTCCTCCCCTTCCTG-3′; FasL：F 5′-TGGCTCA CTGTCCACAAGTA-3′，R 5′-TGTCTGTGTACTCCT CCCCT-3′; GAPDH：F 5′-CACTTGAAGGGTGGAGC CAAA-3′，R 5′-GCATTGCTGACAATCTTGAGTGA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s 循環(huán)1次；95 ℃ 5s，62 ℃ 30 s 循環(huán)40次；95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s 循環(huán)1次。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)各組Ct值計(jì)算2-△△Ct值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 KOA實(shí)驗(yàn)兔模型的建立

圖1示，KOA實(shí)驗(yàn)兔模型建立結(jié)束后，分別對(duì)空白組及模型組2只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行影像學(xué)X線檢查。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組實(shí)驗(yàn)兔左膝關(guān)節(jié)間隙變窄，有骨贅形成，表明造模成功。

圖1 造模后空白組與造模組實(shí)驗(yàn)兔左膝關(guān)節(jié)影像學(xué)X線結(jié)果比較

3.2 各組實(shí)驗(yàn)兔行為學(xué) Lequesne MG 評(píng)分比較

表1示，干預(yù)前與空白組比較，模型組、治療組實(shí)驗(yàn)兔Lequesne MG 評(píng)分均升高(P<0.05)，提示造模成功。干預(yù)后與模型組比較，治療組實(shí)驗(yàn)兔Lequesne MG 評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔干預(yù)前后 Lequesne MG 量表評(píng)分結(jié)果比較(分，

3.3 各組實(shí)驗(yàn)兔軟骨下骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果比較

圖2示，HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨存在骨小梁變細(xì)、斷裂、連續(xù)性中斷、排列疏松、間隙變大等改變；干預(yù)后與模型組比較，治療組實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨可見(jiàn)骨小梁增粗增多，排列密集，間隙變窄。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)兔HE染色(放大倍數(shù)×200)檢查軟骨下骨組織形態(tài)學(xué)變化

3.4 TUNEL染色觀察各組實(shí)驗(yàn)兔軟骨下骨組織中成骨細(xì)胞凋亡水平比較

圖3示，通過(guò)TUNEL染色分析軟骨下骨中成骨細(xì)胞凋亡，與空白組比較，模型組成骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，且凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。經(jīng)內(nèi)熱針干預(yù)后，成骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)明顯減少且凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

注：與空白組比較：***P < 0.001；與模型組比較：###P < 0.001；紅色△→成骨細(xì)胞凋亡的陽(yáng)性表達(dá)

3.5 各組實(shí)驗(yàn)兔軟骨下骨組織中Fas、FasL mRNA及蛋白表達(dá)的比較

圖4示，與空白組比較，模型組軟骨下骨組織中Fas、FasL蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)；干預(yù)后與模型組比較，治療組軟骨下骨組織中Fas、FasL的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，治療組軟骨下骨組織中Fas、FasL的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

注：與空白組比較：***P<0.001；與模型組比較： #P<0.05，###P<0.001

4 討論

KOA是一種常見(jiàn)于中老年人群的以膝關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅增生、軟骨下骨改變和滑膜炎為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病[16]，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及功能障礙等，給患者和家庭社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[17]。因此，尋求有效防治KOA的方法不僅可以提高患者的生活質(zhì)量，還可以降低KOA晚期膝關(guān)節(jié)置換率，減輕疾病給患者帶來(lái)的痛苦及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

KOA屬于中醫(yī)學(xué)痹病范疇，本病的病因病機(jī)的論述可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《素問(wèn)·痹論篇》記載：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，指出其基本病機(jī)為肝腎不足，風(fēng)寒濕邪侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)障礙，造成局部疼痛[10]。因此對(duì)于 KOA 的治療應(yīng)以補(bǔ)肝益腎、祛風(fēng)寒濕、溫經(jīng)通絡(luò)為主[18]。而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為內(nèi)熱針療法可溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)、緩解局部腫脹、松解黏連組織，加強(qiáng)針刺的作用[19]。內(nèi)熱針療法作為一種新的以軟組織外科學(xué)無(wú)菌性炎癥致痛學(xué)說(shuō)為理論依據(jù)的非藥物療法[20]，在治療KOA的臨床研究中表明，可有效改善患者臨床癥狀，減輕膝關(guān)節(jié)疼痛效果[21，22]。

研究表明，軟骨下骨的骨重塑異常被認(rèn)為是KOA的發(fā)病機(jī)制和病理過(guò)程的重要因素[23]。在KOA的發(fā)展過(guò)程中，軟骨下骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙變窄等形態(tài)學(xué)改變最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[24]。X線檢查是診斷KOA最重要的方法之一[25]，因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)行影像學(xué)X線檢查，以鑒定采用Hulth法制備的KOA模型。X線檢查結(jié)果顯示，與空白組比較，造模組實(shí)驗(yàn)兔左膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙變窄并有骨贅形成，表明成功制備了兔KOA模型。本實(shí)驗(yàn)采用手術(shù)誘導(dǎo)中Hulth法成功制備兔KOA模型，在其病理進(jìn)展初期即出現(xiàn)軟骨下骨改變，即HE染色結(jié)果表明，模型組實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨存在骨小梁變細(xì)、斷裂、連續(xù)性中斷、排列疏松、間隙變大等改變，經(jīng)內(nèi)熱針干預(yù)后可明顯改善上述病理變化。上述結(jié)果與YANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)誘導(dǎo)法制備的KOA模型軟骨損傷繼發(fā)于軟骨下骨改變的結(jié)果相一致。

正常軟骨下骨的骨重塑通過(guò)成骨細(xì)胞的成骨活性和破骨細(xì)胞降解活性維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡[27]。在KOA的病程發(fā)展過(guò)程中，動(dòng)態(tài)平衡破壞，成骨細(xì)胞代謝活動(dòng)改變，軟骨下骨出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的改變，導(dǎo)致軟骨下骨的骨重塑失衡，破壞骨穩(wěn)態(tài)[28]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨成骨細(xì)胞凋亡加速，骨形成下降，導(dǎo)致骨量減少，骨重塑異常[29]。在本研究采用TUNEL染色檢測(cè)軟骨下骨成骨細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示內(nèi)熱針能顯著降低KOA模型兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨下骨中成骨細(xì)胞數(shù)量及凋亡指數(shù)，提示內(nèi)熱針干預(yù)抑制KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨成骨細(xì)胞的凋亡，修復(fù)和減輕膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的損傷。

而有研究表明，F(xiàn)as、FasL能夠調(diào)控軟骨下骨成骨細(xì)胞的凋亡[9]。Fas是位于細(xì)胞膜上的一個(gè)受體，屬Ⅰ型膜蛋白及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員；FasL是Ⅱ型膜蛋白，胞外區(qū)與腫瘤壞死因子家族高度同源。FasL是Fas的配體，通過(guò)與Fas結(jié)合激活凋亡信號(hào)，使其由細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)一系列酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。武中慶等[30]探究右歸飲對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，中藥右歸飲能通過(guò)下調(diào)Fas、FasL蛋白表達(dá)顯著抑制KOA模型中軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡，控制KOA的進(jìn)一步發(fā)展。所以，此次實(shí)驗(yàn)在上述研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討內(nèi)熱針對(duì)KOA模型中軟骨下骨成骨細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。而本研究同樣證明，內(nèi)熱針治療兔KOA模型能通過(guò)下調(diào)Fas、FasL的表達(dá)，緩解KOA中軟骨下骨成骨細(xì)胞的凋亡，達(dá)到緩解膝關(guān)節(jié)軟骨下骨組織損傷的目的。

綜上所述，內(nèi)熱針療法能顯著改善 KOA 實(shí)驗(yàn)兔的組織病理學(xué)變化，抑制 KOA中軟骨下骨成骨細(xì)胞的凋亡，其作用途徑可能與下調(diào)Fas和FasL的表達(dá)密切相關(guān)，其對(duì)KOA實(shí)驗(yàn)兔的損傷修復(fù)具有積極作用。但是KOA的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，內(nèi)熱針療法是否能通過(guò)其他途徑抑制軟骨下骨成骨細(xì)胞的凋亡或促進(jìn)軟骨下骨的修復(fù)，有待進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。