建蘭種子無(wú)菌萌發(fā)技術(shù)研究

賴金莉 鄭 薇 羅素梅 郭崇炎 蔡繼鴻 劉小平* 季春峰

（1贛州市蔬菜花卉研究所，江西贛州 341413；2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌 330045）

建蘭（Cymbidium ensifolium）又稱劍蕙、四季蘭，是蘭屬地生蘭的一種，其株型飄逸、易于管理、花香濃郁，常被用作園林造景植物。建蘭作為蘭科植物的一大類群，其繁殖方式主要有分株繁殖和外植體離體培養(yǎng)2種，后來(lái)科學(xué)家通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一種可以獲得大量植株的方法——種子的非共生萌發(fā)，即種子無(wú)菌萌發(fā)。蘭科植物種子無(wú)菌萌發(fā)繁殖系數(shù)高、周期短，在短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量同品種蘭花的無(wú)菌芽，是蘭科植物最優(yōu)的繁育方法[1]。因此，在建蘭大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中，種子繁殖成為研究者研究的熱點(diǎn)之一。

余迪求等[2]以建蘭未成熟的種子為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，對(duì)建蘭原球莖的發(fā)生進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系為MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA時(shí)，建蘭種子的原球莖發(fā)生率可達(dá)85.71%。這是建蘭最早的種子無(wú)菌萌發(fā)研究。近年來(lái)，隨著建蘭珍稀名品的不斷出現(xiàn)，建蘭在花卉市場(chǎng)上的熱度暴漲，關(guān)于其種子繁育技術(shù)的研究也逐漸增多。葉秀仙等[3]研究了基本培養(yǎng)基和植物激素2個(gè)關(guān)鍵因子對(duì)素心建蘭種子萌發(fā)、根狀莖增殖、分化等各培養(yǎng)階段的影響，提出了素心建蘭在各生長(zhǎng)發(fā)育階段的最佳培養(yǎng)體系以及培養(yǎng)方法。陳春[4]以建蘭嶺南奇蝶自交成熟的果莢為研究對(duì)象，研究了外植體消毒時(shí)間、生長(zhǎng)素濃度、分化培養(yǎng)基、有機(jī)添加物等4個(gè)因素對(duì)外植體污染率、根狀莖增殖、分化和生根壯苗等的影響，克服了使用莖尖培養(yǎng)污染率高的問(wèn)題，且培養(yǎng)基中添加0.5～3.0 mg/L NAA及0.5～1.5 mg/L IBA，可大大提高根狀莖的增殖系數(shù)。此外，陳緒盛等[5]、唐鳳鸞等[6]也對(duì)建蘭的非共生萌發(fā)進(jìn)行了研究，獲得了較好的試驗(yàn)成果。目前，關(guān)于建蘭種子無(wú)菌萌發(fā)的研究較多，但是都局限于市場(chǎng)前景較好的品種，鮮有對(duì)鄉(xiāng)土品種的報(bào)道。本研究以贛南地區(qū)野生建蘭的成熟蒴果為試驗(yàn)材料，采用組織培養(yǎng)的方法，對(duì)其種子無(wú)菌萌發(fā)技術(shù)進(jìn)行了研究，以探索最適合建蘭種子無(wú)菌萌發(fā)的培養(yǎng)體系，為本地建蘭工廠化、規(guī)?；a(chǎn)及新品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為野生建蘭成熟但未開(kāi)裂的果莢，于2020年7月采自上猶五指峰和崇義齊云山。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒。①流水沖洗。取建蘭尚未開(kāi)裂的成熟蒴果，用剪刀剪去過(guò)長(zhǎng)的果柄，用清水洗凈果莢表面的灰塵，放于燒杯中，用流水沖洗1 h。②初步消毒。用70%乙醇浸泡5 min進(jìn)行初步消毒后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)。然后用無(wú)菌水沖洗果莢表面的乙醇，沖洗2遍。③氯化汞消毒。用氯化汞消毒液浸泡5 min后，用無(wú)菌水沖洗3～5遍。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的配制。采用固體培養(yǎng)基，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別設(shè)置如下6個(gè)處理，即1/2 MS+8 g/L 瓊脂粉+30 g/L 蔗糖（A）、1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA（B）、1/2 MS+8 g/L 瓊脂粉+60 g/L 蔗糖（C）、1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+60 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA（D）、1/2 MS+8 g/L 瓊脂粉+90 g/L 蔗糖（E）、1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+90 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA（F）。以上培養(yǎng)基均添加1g/L活性炭，pH值5.8。

1.2.3 無(wú)菌播種。外植體消毒結(jié)束后，在酒精燈旁，用酒精燈灼燒過(guò)的解剖刀把建蘭蒴果從中間剖開(kāi)，將種子均勻撒在培養(yǎng)基上。播種后在黑暗條件下培養(yǎng)至有種子開(kāi)始萌發(fā)，再放入光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，相對(duì)濕度為 75%。

1.2.4 生根壯苗培養(yǎng)。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別加 0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L NAA。 以上培養(yǎng)基均添加0.4 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、50 g/L瓊脂、1.0 g/L活性炭，pH值5.4。以650 mL組培瓶為培養(yǎng)容器，每瓶培養(yǎng)基用量100 mL，每瓶接種20個(gè)幼芽，每個(gè)NAA濃度接種4瓶，培養(yǎng)溫度（25±3）℃，光照強(qiáng)度 2 000～2 500 lx。

1.3 萌發(fā)指標(biāo)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)方法

播種后每隔30 d，用體視顯微鏡觀察每個(gè)平板上種子的萌發(fā)狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)種子發(fā)育的數(shù)量及階段，計(jì)算各階段發(fā)育所需時(shí)間。將建蘭初期萌發(fā)過(guò)程分為 A、B、C、D、E等 5個(gè)階段：A 階段，種胚未萌動(dòng)；B階段，種胚膨大但未突破種皮；C階段，原球莖突破種皮；D階段，根狀莖突破種皮且變成綠色；E階段，根狀莖出現(xiàn)分枝現(xiàn)象[7]。無(wú)菌播種培養(yǎng)300 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)結(jié)果，生根壯苗試驗(yàn)接種90 d后統(tǒng)計(jì)生根率，計(jì)算公式如下：

式中，A、B、C、D、E 分別為不同階段種子數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)建蘭種子萌發(fā)的影響

植物激素的有無(wú)以及蔗糖濃度的高低對(duì)建蘭種子萌發(fā)均有顯著影響。在不添加植物激素的條件下，建蘭種子也可萌發(fā)，但萌發(fā)率較低，如表1所示，處理A、C、E未添加 6-BA、NAA，萌發(fā)率分別為 46.43%、65.43%、27.68%；添加 6-BA 與 NAA 后，處理 B、D、F萌發(fā)率分別為74.04%、86.27%、57.94%，分別較處理A、C、E增加了27.61個(gè)百分點(diǎn)、20.84個(gè)百分點(diǎn)和30.26個(gè)百分點(diǎn)。在蔗糖濃度為60 g/L時(shí)，種子萌發(fā)率最高達(dá)86.27%，顯著高于蔗糖濃度為30 g/L和90 g/L的處理；種子的萌發(fā)指數(shù)最高可達(dá)23.76，顯著高于其他處理。可見(jiàn)適宜的蔗糖濃度可以促進(jìn)種子萌發(fā)，蔗糖濃度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)在一定程度上抑制建蘭種子萌發(fā)。綜上可知，添加外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA以及適宜濃度的蔗糖能顯著提高建蘭種子的萌發(fā)率。本試驗(yàn)篩選出建蘭種子無(wú)菌萌發(fā)最適培養(yǎng)基為1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+60 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA+1 g/L活性炭（處理D），為后期建蘭種苗批量繁育奠定了基礎(chǔ)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)建蘭種子萌發(fā)的影響

2.2 建蘭種子萌發(fā)過(guò)程觀察

用高清體視顯微鏡觀察種子在處理D培養(yǎng)基中的萌發(fā)過(guò)程，建蘭種子呈紡錘狀，外層由透明種皮包裹，見(jiàn)圖1（a）。在萌發(fā)培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)120 d的培養(yǎng)，觀察到種子開(kāi)始萌發(fā)。發(fā)育至圖1（c）的種子，突破種皮，開(kāi)始萌動(dòng)，并出現(xiàn)綠色的原球莖。取出10個(gè)發(fā)育至圖1（b）的種子進(jìn)行重點(diǎn)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由圖 1（b）發(fā)育至圖1（c）平均約需40 d，其中用時(shí)最長(zhǎng) 68 d、最短15 d，此階段原球莖體積快速增大，顏色呈深綠色。

由圖 1（c）發(fā)育至圖 1（d）平均約需 43 d，其中用時(shí)最長(zhǎng)64 d、最短34 d，此發(fā)育階段原球莖長(zhǎng)度和體積快速增長(zhǎng)，顏色加深。 圖 1（d）發(fā)育至圖 1（e）平均約需 47 d，其中用時(shí)最長(zhǎng)86 d、最短32 d，繼續(xù)培養(yǎng)形成綠色的原球莖，原球莖不斷伸長(zhǎng)繼而形成根狀莖，并出現(xiàn)分枝現(xiàn)象，此時(shí)根狀莖完全脫離種皮。在萌發(fā)過(guò)程中，還有一些不能正常萌發(fā)的種子，受種胚發(fā)育不良、營(yíng)養(yǎng)缺乏等影響，種子生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，最后完全褐化死亡，見(jiàn)圖 1（f）。

2.3 NAA對(duì)建蘭生根壯苗培養(yǎng)的影響

由表2可知，在生根培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素NAA后，可以明顯提高建蘭無(wú)菌芽的生根率。NAA濃度為 0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L 時(shí)，接種 90 d 的平均生根率分別為53.39%、72.04%、60.60%、48.03%。由此可知，在NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)，生根率最高，在90 d時(shí)最高可達(dá)80.50%。綜上可知，在生根培養(yǎng)基中添加0.8 mg/L NAA時(shí)，建蘭的生根效果最好。

表2 NAA濃度對(duì)生根的影響

3 結(jié)論與討論

蘭科植物的一個(gè)蒴果內(nèi)含有數(shù)萬(wàn)粒甚至百萬(wàn)粒種子[8]，且種子非常細(xì)小，呈粉末狀。受種胚發(fā)育不良、無(wú)子葉和胚乳、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少、種皮致密、透氣性差等因素影響，蘭科植物的種子在自然條件下很難萌發(fā)[9]。傳統(tǒng)的分株繁殖由于繁殖周期長(zhǎng)、繁殖率低，且存在種性退化和攜帶病毒的問(wèn)題，不能滿足市場(chǎng)對(duì)優(yōu)良品系的需求[7]。蘭科植物種子數(shù)量多、易獲得，是進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要材料。因此，種子無(wú)菌萌發(fā)成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一，如陳丹丹[10]、席會(huì)鵬等[11]、鄭洲翔等[12]在無(wú)菌播種的條件下，探索了蘭科植物種子萌發(fā)的最適培養(yǎng)條件。

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，它為植物的離體培養(yǎng)提供了生長(zhǎng)發(fā)育所需的各種營(yíng)養(yǎng)元素。蔗糖作為能源物質(zhì)在組織培養(yǎng)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，相關(guān)研究表明，2%蔗糖最有利于蘭花原球莖的生長(zhǎng)，2%～3%蔗糖有利于芽的形成，5%蔗糖有利于根的生長(zhǎng)和分化[13]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為組織培養(yǎng)過(guò)程中另一個(gè)重要因素，常用的有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類，包括NAA、6-BA和IBA等，一般組培苗在不同生長(zhǎng)階段對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的需求也不同。

本研究以建蘭種子為試驗(yàn)材料，探索了蔗糖濃度及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)建蘭種子萌發(fā)及生根的影響。結(jié)果表明，60 g/L蔗糖與0.4 mg/L 6-BA、2 mg/L NAA組合，建蘭種子萌發(fā)率最高；在生根壯苗試驗(yàn)中，當(dāng)0.8 mg/L NAA與0.4 mg/L 6-BA組合時(shí)，生根率最高，在90 d時(shí)最高可達(dá)80.50%。此外，本研究還觀察了建蘭種子無(wú)菌萌發(fā)的過(guò)程，在播種后到根狀莖分枝大約要經(jīng)歷250 d，后續(xù)生根壯苗還需要一段較長(zhǎng)的時(shí)間。對(duì)建蘭種子萌發(fā)過(guò)程的觀測(cè)可加深對(duì)建蘭種子萌發(fā)研究的理解。