成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)系統(tǒng)在核酸檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

李宗祥，王金林，王佳芮，羅繼全（通信作者）

三諾生物傳感股份有限公司 （湖南 長沙 410000）

1987年，Ishino 等[1]在研究大腸桿菌堿性磷酸酶同工轉(zhuǎn)化基因時，意外發(fā)現(xiàn)了一種規(guī)律性的重復(fù)序列，但是當(dāng)時的科學(xué)家并不清楚這種序列的生物學(xué)意義。在隨后的幾年時間里，不同的科研人員發(fā)現(xiàn)在不同的古生菌中均存在相似的重復(fù)序列[2]。2002年，Jansen 等[3]通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這種規(guī)律的重復(fù)的DNA序列只存在于細(xì)菌及古生菌中，并將這種串聯(lián)間隔重復(fù)序列正式命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），同時將與 CRISPR 關(guān)聯(lián)密切且能編碼超嗜熱古生菌特異性DNA修復(fù)酶的基因命名CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR-associated proteins，Cas）酶。2005年，多個研究團(tuán)隊的研究結(jié)果均表明，CRISPR的間隔序列（Spacers）可能源于染色體或是已存在的噬菌體和質(zhì)粒[4-6]。Makarova 等[7]根據(jù)研究結(jié)果推測，CRISPR和Cas酶共同組成一種原核生物特有的免疫防御系統(tǒng)。2007年，Marraffini 和 Sontheimer[8]首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CRISPR在細(xì)菌的免疫功能中起作用。2012年，Gasiunas 等[9]通過嗜熱鏈球菌體外實(shí)驗(yàn)表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過切割入侵噬菌體的核酸來抵御侵染，進(jìn)一步證實(shí)了 CRISPR 系統(tǒng)的防疫功能。Cong等[10]利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行了基因編輯的首次嘗試，對人和小鼠細(xì)胞系的基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變，同年 Mali[11]利用 CRISPR/Cas9 在人293T 細(xì)胞和 K652細(xì)胞進(jìn)行基因編輯并取得成功。此后，越來越多的 Cas 酶被發(fā)現(xiàn)[12-15]，而隨之CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因編輯、體外診斷上的應(yīng)用也越來越廣泛。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的分類

CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù) Cas 蛋白效應(yīng)復(fù)合物的性質(zhì)主要分為兩大類，1類CRISPR/Cas系統(tǒng)包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，其中Ⅰ型包括A、B、C、D、E、F和U 7種亞型，Ⅲ型包括A、B、C、D 4種亞型；2類CRISPR/Cas系統(tǒng)包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型，其中Ⅱ型包括A、B、C 3種亞型，Ⅴ型包括A、B和U 3種亞型，Ⅵ型包括A、B、C 3種亞型[16-18]，如圖1所示。1類CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)揮作用依賴于3～6個不同的Cas蛋白組成的多蛋白效應(yīng)復(fù)合物，這些蛋白在這種適應(yīng)性免疫過程中發(fā)揮著不同的功能[19]，2類 CRISPR/Cas 系統(tǒng) Cas 蛋白的種類較少，主要的 Cas 蛋白亞型有Ⅱ型-Cas9、Ⅴ型-Cas12和Ⅵ型-Cas13[20-22]。

圖1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)分類

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用機(jī)制及在核酸檢測中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)

CRISPR/Cas9 是CRISPR/Cas 系統(tǒng)中最早應(yīng)用于生命科學(xué)研究的[10-12]，也是細(xì)菌抵抗自然界中噬菌體侵染的一種防御機(jī)制。CRISPR/Cas 的作用機(jī)制如下（圖2）：第一階段，病原體核酸獲取，當(dāng)外源噬菌體侵染細(xì)菌時，細(xì)菌體內(nèi)的 Cas1、Cas2 蛋白能夠掃描噬菌體DNA序列，并識別出此段DNA序列上的間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），隨后將剪切臨近PAM的間隔序列前體（Protospacer）作為新的間隔序列插入到細(xì)菌自身的CRISPR中[20]，PAM通常由NGG三個堿基構(gòu)成（N為任意堿基），根據(jù)Cas酶的種類不同而有所差異[21-22]；第二階段，CRISPR crRNA的合成，CRISPR 會在前導(dǎo)區(qū)調(diào)控下轉(zhuǎn)錄生成前體 crRNA（pre-crRNA）和反式激活 RNA（trans-acting crRNA，tracrRNA），之后，tracrRNA 與 precrRNA堿基互補(bǔ)配對，pre-crRNA 被剪切加工生成成熟 crRNA[23]；第三階段，噬菌體再次入侵時，成熟的 tracrRNA/crRNA 復(fù)合體招募 Cas9 蛋白形成 Cas9/crRNA/tracrRNA 復(fù)合體，crRNA 的間隔序列通過與靶標(biāo) DNA 序列堿基互補(bǔ)配對將復(fù)合體定位到 PAM/原間隔序列的區(qū)域，DNA 雙鏈被解開，Cas9 核酸酶剪切這段序列，使外源噬菌體 DNA 表達(dá)沉默，從而保護(hù)細(xì)菌抵御病毒的侵害[24]。

圖2 CRISPR/Cas 的作用機(jī)制

CRISPR/Cas9 蛋白在引導(dǎo) RNA（guide RNA，gRNA）的指導(dǎo)下能夠切割雙鏈 DNA（double-strand DNA，dsDNA），CRISPR/Cas9 系統(tǒng)除能夠在細(xì)菌體內(nèi)通過基因編輯來抵御病毒侵害外，很多研究人員進(jìn)一步將 CRISPR/Cas9 的這一特性成功有效地應(yīng)用到體外診斷中?？焖儆行У募磿r檢驗(yàn)（pointof-care testing，POCT）技術(shù)能幫助患者在資源匱乏的環(huán)境中進(jìn)行疾病的早期診斷成為可能，同時還能幫助患者實(shí)現(xiàn)疾病的自我監(jiān)測，如 Pardee 等[25]將其與核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）和toehold switch傳感器相結(jié)合以單堿基分辨率檢測寨卡病毒；2018年，Huang等[26]開發(fā)的 CRISPR/Cas9 觸發(fā)的等溫擴(kuò)增指數(shù)反應(yīng)（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR）技術(shù)通過Cas9 裂解產(chǎn)生的 DNA 片段引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，通過實(shí)時熒光檢測實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)（DNA和mRNA）靈敏度低至阿摩爾（aM），并能夠有效區(qū)分單堿基錯配。為檢測細(xì)胞內(nèi)囊泡衍生的微小 RNA（micro RNA，miRNA），Wang 等[27]結(jié)合滾動循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circular amplification，RCA）與 CRISPR/Cas9 建立了 RCA 輔助 CRISPR/Cas9 剪切平臺（RCAassisted CRISPR/Cas9 cleavage，RACE），在多種疾病診斷和預(yù)后評估發(fā)揮著重要作用。Wang等[28]建立的 CRISPR/Cas9 側(cè)向?qū)游龊怂釞z測平臺（CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay，CASLFA）1小時內(nèi)即可完成非洲豬瘟病毒和單核細(xì)胞增生李斯特菌等的檢測，這種與層析結(jié)合的檢測方式不受檢測環(huán)境限制，操作簡單，準(zhǔn)確度高。除能夠檢測單基因外，在2021年， Xiong 等[29]開發(fā)的新型冠狀病毒 CRISPR/Cas9 三線側(cè)向?qū)游龊怂釞z測方法（CRISPR/Cas9-mediated triple-line lateral flow assay，TL-LFA）單試條可實(shí)現(xiàn)雙基因的檢測。

2.2 CRISPR/Cas12 系統(tǒng)

CRISPR/Cas12 系統(tǒng)在體內(nèi)抵御病毒核酸 DNA的剪切機(jī)制與 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)類似，但也有不同。CRISPR/Cas9 識別靶標(biāo)DNA 后對靶標(biāo)進(jìn)行切割，但 CRISPR/Cas12 被激活后除能夠剪切靶標(biāo)單鏈DNA 外，Cas12還具有非特異性切割單鏈 DNA的酶切活性[18-19]。簡而言之，當(dāng) Cas12 和 crRNA結(jié)合，并識別靶標(biāo)單鏈 DNA 序列后，Cas12 的酶切活性被激活，除能夠剪切靶標(biāo)DNA 序列外，還能切割所遇到的其他任何單鏈DNA，這就是所謂的側(cè)向切割活性。在反應(yīng)體系中加入標(biāo)記熒光/淬滅基團(tuán)的單鏈報告DNA，就會被Cas12 蛋白切割，釋放出熒光信號，這樣就可以通過相應(yīng)儀器檢測熒光信號的有無，從而進(jìn)行診斷結(jié)果陰陽性的判讀，這就是利用Cas12 蛋白做基因診斷的原理。正是利用這一特性，CRISPR/Cas12 能更適用于體外核酸檢測診斷中。

近年來，CRISPR/Cas12 在體外診斷中得到了快速的發(fā)展。如 Chen 等[30]將重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplificaton，RPA）與CRISPR/Cas12 相結(jié)合建立的 DNA 核酸內(nèi)切酶靶向 CRISPR 反式報告基因方法（DNA endonucleasetargeted CRISPR trans reporter，DETECTR）能夠在1小時內(nèi)實(shí)現(xiàn)對臨床樣本中 HPV16 和 HPV18 的分型檢測，特異度達(dá)到100%和92%，靈敏度可檢測到阿摩爾的 DNA 分子。Li 等[31]基于 CRISPR/Cas12 系統(tǒng)建立的一種單小時低成本多用途高效系統(tǒng)（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES）靈敏度與 DETECTR相當(dāng)，通過在 PCR 引物中引入 PAM 序列，能夠區(qū)分 DNA 和 RNA 病毒株，并實(shí)現(xiàn)任何單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)的檢測，檢測流程如圖3所示。2019年該團(tuán)隊在現(xiàn)有基礎(chǔ)上又進(jìn)一步建立了HOLMES v2平臺，該平臺能夠檢測人的mRNA和環(huán)狀RNA[32]，實(shí)現(xiàn)了對DNA甲基化程度的定量測定。除此之外，與DETECTR 和 HOLMES 等檢測平臺相比，Dai等[33]開發(fā)的以 CRISPR/Cas12a 為基礎(chǔ)的電化學(xué)生物傳感器[a CRISPR-Cas12a（cpf1）based electrochemical biosensor，E-CRISPR]檢測成本更低且易攜帶，與適配體結(jié)合可檢測臨床樣本中的一些蛋白。

圖3 CRISPR/Cas12診斷檢測流程

以CRISPR/Cas12為基礎(chǔ)建立的體外檢測平臺除能夠檢測核酸DNA 外，通過一定的生物技術(shù)手段將靶標(biāo)RNA 轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA 進(jìn)而也能實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)RNA 的檢測。這個技術(shù)在體外檢測中的應(yīng)用對于靶標(biāo)DNA 甲基化程度檢測、DNA 病毒的分型檢測以及靶標(biāo)SNP 位點(diǎn)基因檢測具有重要意義。

2.3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)

CRISPR-Cas13是 向 導(dǎo)RNA 介 導(dǎo) 的RNA 靶向的內(nèi)切酶系統(tǒng)，是目前CRISPR-Cas 家族中唯一的一支靶向單鏈RNA（single stranded RNA，ssRNA）系統(tǒng)，其中CRISPR/Cas13a 是第一個被應(yīng)用于靶向RNA 切割的效應(yīng)蛋白。該系統(tǒng)類似于CRISPR/Cas12系統(tǒng)，Cas12靶標(biāo)為單鏈DNA，與Cas12不同的是，Cas13蛋白靶標(biāo)為單鏈RNA。CRISPR-Cas13應(yīng)用在體外診斷中的檢測原理和Cas12基本一致，只是發(fā)光底物由單鏈DNA 變成了單鏈RNA。因?yàn)镃RISPR/Cas13是CRISPR 家族中靶向RNA 的系統(tǒng)，這使得CRISPR/Cas13系統(tǒng)在體外檢測靶標(biāo)RNA 方面發(fā)揮著重要的作用。

2017年，Gootenberg 等[34]將Cas13與RPA擴(kuò)增相結(jié)合建立了一種RNA分子的檢測方法——高靈敏度的報告基因開鎖法（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）；與以CRISPR/Cas12為基礎(chǔ)建立起來的檢測平臺相比，靶標(biāo)擴(kuò)增后的轉(zhuǎn)錄步驟進(jìn)一步放大信號，使得檢測靈敏度可以進(jìn)一步提升，如圖4所示；為實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)同時檢測并擺脫依賴儀器檢測熒光的限制，在2018年，該團(tuán)隊對此平臺進(jìn)行優(yōu)化建立了SHERLOCK v2平臺，新平臺通過4種不同Cas蛋白實(shí)現(xiàn)了4個不同靶標(biāo)的定量檢測，為使檢測結(jié)果讀取更加方便快捷，創(chuàng)新性地與免疫層析膠體金技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了不依賴儀器直接肉眼判讀結(jié)果的診斷方式，更好地將 CRISPR/Cas 檢測系統(tǒng)應(yīng)用到POCT中[35]。隨之，Myhrvold 等[36]通過加熱和化學(xué)還原裂解病毒顆粒并滅活體液中高水平核糖核酸酶的方法（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON），進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對體液中的病毒不需核酸純化就可直接檢測的目的，簡化了診斷檢測流程，縮短了診斷檢測時間，并最終應(yīng)用到可檢測全血、血清和唾液中的寨卡病毒和登革熱病毒。優(yōu)化的 SHERLOCK 平臺為更好地提高檢測靶標(biāo)的靈敏度，需要和靶標(biāo)擴(kuò)增步驟相結(jié)合，而與現(xiàn)有的 PCR 技術(shù)相比，CRISPR 技術(shù)更大的熱點(diǎn)趨勢與優(yōu)勢是實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)免擴(kuò)增檢測；為更好地實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員做了很多的科研實(shí)驗(yàn)并取得了一定的研究成果，如 Shan 等[37]建立的miRNA 檢測平臺可實(shí)現(xiàn)在30分鐘內(nèi)完成 miRNA 的免擴(kuò)增檢測，檢測限可達(dá)4.5 aM；Bruch等[38]結(jié)合微流控裝置建立的miRNA檢測平臺使用微量樣本（0.9 μL）即可完成檢測；2019年 Qin 等[39]開發(fā)的自動化微流控檢測平臺使用便攜集成熒光計能夠檢測相應(yīng)底物的熒光強(qiáng)度，與便攜式儀器結(jié)合的檢測方式更加適用于野外及設(shè)備欠缺地區(qū)等。

圖4 CRISPR/Cas13診斷檢測流程

CRISPR/Cas13系統(tǒng)與擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒的高靈敏度檢測和分型，對傳染病預(yù)防以及治療具有重要意義，但仍存在以下局限性：（1）crRNA 篩選工作量大；（2）檢測成本較高；（3）脫靶可能性大。對于上述局限性的改變將拓寬CRISPR/Cas 系統(tǒng)的應(yīng)用。

3 CRISPR/Cas 核酸檢測平臺比較

CRISPR/Cas 系統(tǒng)利用Cas 蛋白的核酸剪切酶活性對靶標(biāo)進(jìn)行檢測，在病原體檢測、基因分型及疾病治療上發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13為基礎(chǔ)建立的核酸檢測平臺如表1所示。

表1 CRISPR/Cas 核酸檢測平臺

通過比對發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)在體外檢測的應(yīng)用各有不同，各有優(yōu)勢。而為了更好地提高靶標(biāo)檢測的靈敏度及縮短檢測時間，目前CRISPR 檢測主要是與恒溫擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，但是這種結(jié)合會使得反應(yīng)極為迅速且極易達(dá)到飽和狀態(tài)，所以目前技術(shù)仍難以達(dá)到對靶標(biāo)的準(zhǔn)確定量檢測的目標(biāo)，所以需要進(jìn)一步對各種條件進(jìn)行優(yōu)化。

4 小結(jié)

近幾年，因?yàn)镃RISPR/Cas 系統(tǒng)所具有的技術(shù)優(yōu)勢在不斷的引起科學(xué)界的重視，尤其是2019年暴發(fā)的新型冠狀病毒感染疫情，更是讓CRISPR 技術(shù)分子診斷方面的應(yīng)用得到了快速發(fā)展，除此之外，CRISPR 技術(shù)在人體遺傳疾病的治療與預(yù)防、農(nóng)作物育種、新藥開發(fā)等方面也扮演著越來越重要的角色。

準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的核酸檢測方法在感染性病原體診斷中起著重要的作用。目前，核酸檢測金標(biāo)準(zhǔn)是以PCR 為基礎(chǔ)的診斷方法，其靈敏度高、特異度高，但需要特殊的儀器、實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)場地和專業(yè)技術(shù)人員，且對實(shí)驗(yàn)室有嚴(yán)格的分區(qū)要求，這些需求限制了PCR 技術(shù)在疫情暴發(fā)的貧困國家及基礎(chǔ)設(shè)施缺乏的地方的使用。此外，很多檢測手段的發(fā)展特別是基于抗體的檢測手段，需要一個極長的研發(fā)周期，這在面對致命病毒與快速進(jìn)化的病原體時也有很大不足。由于基于CRISPR 技術(shù)的檢測系統(tǒng)簡單易操作，且極大地降低了對于儀器的依賴，因此基于CRISPR 技術(shù)的分子診斷平臺未來發(fā)展前景可觀。

目前，基于CRISPR 技術(shù)的體外核酸檢測方法處于起步發(fā)展階段，現(xiàn)有診斷方法仍需進(jìn)一步摸索和改進(jìn)。如何實(shí)現(xiàn)無需擴(kuò)增靶標(biāo)序列直接檢測、如何進(jìn)一步提高核酸檢測的靈敏度和特異度、如何將試劑組分合并與簡化、如何實(shí)現(xiàn)基于CRISPR 技術(shù)的核酸檢測走向家庭化/私密化、如何更進(jìn)一步地降低成本、如何將CRISPR 檢測核酸技術(shù)和儀器設(shè)備相結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動化快速檢測，這些都是基于CRISPR 技術(shù)核酸檢測需要改進(jìn)和發(fā)展的方向。未來各種具備其他特性的Cas 酶也會被人們發(fā)現(xiàn)并加以利用，結(jié)合上創(chuàng)新的信號檢測手段及其他技術(shù)，基于CRISPR 技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷將會在時間、成本、靈敏度、體積等多個維度上得到革命性的改變。