西藏新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中微生物種類 及數(shù)量變化動(dòng)態(tài)研究

◎ 朱艷妮，布 窮，張志德，馬紅梅

（西藏大學(xué) 理學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

風(fēng)干牦牛肉是藏族人民重要的日常食物之一，是以生鮮牦牛肉為原料在低溫陰涼通風(fēng)處陰干或凍干制成的，其傳統(tǒng)的制作方法是把牦牛肉切割成條狀，一條一條掛在陰涼處，讓其自然風(fēng)干。由于其風(fēng)味獨(dú)特，貯存期長，是一種備受消費(fèi)者青睞的傳統(tǒng)肉制品。牛肉經(jīng)冷凍風(fēng)干過程加工后，水分含量低、體積小、質(zhì)量輕，保持了牛肉原有營養(yǎng)價(jià)值和固有風(fēng)味[1]。通過定期測定風(fēng)干過程中牦牛肉自身的pH值，得出上述理化因子的變化和牦牛肉在風(fēng)干過程中微生物的種類和數(shù)量的變化之間是否存在相關(guān)性，以期通過控制理化因子的變化來抑制微生物的生長繁殖，避免牦牛肉在風(fēng)干過程中由微生物引起的腐敗變質(zhì)問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 kg市售西藏生鮮牦牛肉，市售；PCA（Plate Count Agar）培養(yǎng)基、PCA+（改進(jìn)型PCA）培養(yǎng)基、MRS（De Man，Rogosa，Sharpe Agar）培養(yǎng)基、MRS+（改進(jìn)型MRS）培養(yǎng)基和VJ（Vogel Johnson Agar）培養(yǎng)基，西藏建成生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ESCO超凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、DK-8D恒溫水浴鍋（上海佑科儀器儀表有限公司）、JA3003N電子天平、Memert IPP110恒溫培養(yǎng)箱、ZEALWAY高壓滅菌鍋、Panasonic MPR-210醫(yī)用冷藏箱、INFORS Multition Standard搖床（無錫市華科儀器儀表有限公司）、Alalis PC320酸度計(jì)、Sartorius G-16C高速冷凍離心機(jī)、VELP ZX4型振蕩器（鄭州生元儀器有限公司）、DHG-2200B電熱鼓風(fēng)干燥箱、ESCO S-4S1生物安全柜、Panasonic MDF-682醫(yī)用低溫箱、Panasonic MDF-339醫(yī)用低溫箱、Biometra P25 T電泳儀、Biometra TADVANCED 846-x-070-280 PCR儀及Analytik jena M-26XV凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分別于鮮肉、風(fēng)干2 d、風(fēng)干5 d、風(fēng)干7 d、風(fēng)干10 d、風(fēng)干15 d和風(fēng)干20 d取樣，每次取3個(gè)重復(fù)。分別檢測樣品菌落總數(shù)、微球菌、乳酸菌、乳酸桿菌及葡萄球菌數(shù)量的變化，鑒定實(shí)驗(yàn)風(fēng)干過程的優(yōu)勢菌種，并測定其pH值、溫度。

1.3.2 風(fēng)干牦牛肉的制備

購入5 kg市售西藏生鮮牦牛肉，將其切割成一條條的肉條，懸掛在繩子上，進(jìn)行風(fēng)干，置于拉薩室內(nèi)自然環(huán)境下，避光通風(fēng)風(fēng)干。

1.3.3 微生物指標(biāo)的測定

采用稀釋平板法測定微生物數(shù)量，在無菌條件下稱取25.0 g樣品，加入225 mL 0.9%無菌生理鹽水，充分進(jìn)行攪拌，使其充分混勻。取1 mL上清液于含有9 mL 0.9%無菌生理鹽水的試管中，進(jìn)行加倍遞增稀釋，分別稀釋至10-3、10-4、10-5，每個(gè)稀度做3個(gè)平行，用培養(yǎng)基培養(yǎng)[2]。不同的菌群分別采用不同的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離和計(jì)數(shù)。

菌落總數(shù)的測定：用PCA培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)48 h測定細(xì)菌總數(shù)；微球菌數(shù)的測定：用PCA+（改進(jìn)型PCA）培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)48 h測定微球菌；乳酸菌數(shù)的測定：用MRS（De Man Rogosa Sharpe Agar）培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)48 h測定乳酸菌；乳桿菌數(shù)的測定：用MRS+（改進(jìn)型MRS）培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)48 h測定乳桿菌；葡萄球菌數(shù)的測定：用VJ培養(yǎng)基（Vogel Johnson Agar）在30 ℃培養(yǎng)48 h測定葡萄球菌[3]。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

取風(fēng)干過程的牦牛肉，分別于鮮肉、風(fēng)干2 d、風(fēng)干5 d、風(fēng)干7 d、風(fēng)干10 d、風(fēng)干15 d和風(fēng)干20 d進(jìn)行取樣，每次取3個(gè)重復(fù)。將牦牛肉干切碎置于燒杯中，用穿刺型pH計(jì)測定樣品的pH值，記錄，結(jié)果取3次測定的pH平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，并使用SPSS 26軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，然后使用Origin軟件繪圖。

1.5 優(yōu)勢種鑒定

1.5.1 取樣并純化

實(shí)驗(yàn)分別從鮮肉、風(fēng)干2 d、風(fēng)干5 d、風(fēng)干7 d、風(fēng)干10 d、風(fēng)干15 d和風(fēng)干20 d中取樣，每次取3個(gè)重復(fù)，將上述制成的稀釋液接種于PCA+培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、MRS+培養(yǎng)基、VJ培養(yǎng)基，在各培養(yǎng)基中分別取數(shù)目最多、重復(fù)最高的菌落數(shù)純化，得到純化的單菌株。

1.5.2 16S rDNA鑒定細(xì)菌

（1）DNA的提取。將菌體放入離心管中，加入50 μL的DNA提取液，10 μL的二氧化硅晶體，放入離心機(jī)中，離心（4 ℃，10 000 r·min-1，5 min），取上層清液于管中，放入4 ℃冰箱里保存30 min后取出，在65 ℃水浴鍋里水浴1 h，然后置于-20 ℃冰箱里保藏。

（2）PCR擴(kuò)增（16S rRNA序列的擴(kuò)增）。16S rRNA基因的擴(kuò)增使用細(xì)菌通用引物27F和1459R。16S rRNA基因正向引物27F核酸序列（5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1495R核酸序列（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。PCR 體系 50 μL 內(nèi) 含 模 板 DNA（100 ng·μL-1）2.0 μL、27F（20 pmoL·μL-1）2.0 μL、1495R（20 pmoL·μL-1）2.0 μL、Premix-Taq酶25 μL和超純水25 μL；擴(kuò)增條件：94 ℃下模板變性5 min，隨后94 ℃下變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后4 ℃保存。PCR結(jié)束后，DNA在1%（W/V）瓊脂糖凝膠（Promega）中電泳。

（3）在凝膠成像儀上觀察。電泳結(jié)束后用100 mg·mL-1溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）溶液浸泡凝膠10 min，回收溴化乙錠溶液，用蒸餾水沖洗凝膠后在紫外光（凝膠成像儀）下觀察，PCR產(chǎn)物為1 500 bp的條帶。

（4）送檢。將樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中的微生物指標(biāo)變化

2.1.1 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中細(xì)菌總數(shù)的變化

由圖1可知，牦牛肉風(fēng)干過程中細(xì)菌總數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢，但菌落總數(shù)均沒有超過30 000 CFU·g-1，符合熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[4]。在鮮肉到風(fēng)干5 d之間均沒有顯著性差異，在風(fēng)干5 d與風(fēng)干7 d之間存在顯著性差異，在風(fēng)干7 d與風(fēng)干10 d之間存在顯著性差異，而風(fēng)干10 d到風(fēng)干20 d之間不存在顯著性差異。

圖1 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中細(xì)菌總數(shù)變化圖

2.1.2 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中微球菌數(shù)的變化

由圖2可知，牦牛肉風(fēng)干過程中微球菌數(shù)呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。實(shí)驗(yàn)初期，微球菌為優(yōu)勢菌種，數(shù)量較多，但隨新鮮牦牛肉的風(fēng)干，微球菌數(shù)量下降，但下降不顯著。隨pH值上升，乳酸菌和乳酸桿菌對(duì)其抑制作用減弱，微球菌數(shù)量上升。

圖2 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中微球菌數(shù)變化圖

2.1.3 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中乳酸菌數(shù)的變化

由圖3可知，牦牛肉風(fēng)干過程中乳酸菌數(shù)基本上呈升高趨勢。在整個(gè)風(fēng)干過程中，乳酸菌一直是優(yōu)勢菌，能產(chǎn)生細(xì)菌素，抑制有害微生物的生長，顯著提高產(chǎn)品的安全性[5]。在鮮肉與風(fēng)干5 d無顯著性差異，而在鮮肉到風(fēng)干2 d有顯著性差異，風(fēng)干2 d到風(fēng)干5 d有顯著性差異。

圖3 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中乳酸菌數(shù)變化圖

2.1.4 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中乳酸桿菌數(shù)的變化

由圖4可知，牦牛肉風(fēng)干過程中乳酸桿菌數(shù)均呈升高趨勢。在整個(gè)風(fēng)干過程中，乳酸桿菌一直是優(yōu)勢菌，可以抑制各種腐敗和致病細(xì)菌增長。鮮肉到風(fēng)干5 d無顯著性差異，風(fēng)干5 d到風(fēng)干7 d有顯著性差異，風(fēng)干7 d到風(fēng)干10 d有顯著性差異，風(fēng)干10 d到風(fēng)干15 d有顯著差異，而風(fēng)干15 d到風(fēng)干20 d無顯著性差異。

圖4 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中乳酸桿菌數(shù)變化圖

2.1.5 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中葡萄球菌數(shù)的變化

由圖5可知，牦牛肉風(fēng)干過程中葡萄球菌數(shù)基本呈上升趨勢。隨著風(fēng)干的進(jìn)行，葡萄球菌數(shù)量因乳酸菌產(chǎn)酸的影響有所下降，之后由于水分含量的降低，乳酸菌數(shù)量減少，葡萄球菌耐受性增加，導(dǎo)致葡萄球菌數(shù)量回升[6]。

圖5 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中葡萄球菌數(shù)變化圖

2.2 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中的pH變化

由圖6可知，pH值在7 d前呈上升趨勢，在7 d和15 d之間呈下降趨勢，但總體來說pH值是呈上升趨勢的，家畜剛被宰殺時(shí)的肉處于等電點(diǎn)，其pH值為5.3～5.5[7]。pH值從實(shí)驗(yàn)初始5.355升至實(shí)驗(yàn)中段6.055，然后降至實(shí)驗(yàn)后期5.935，最后上升至6.205。在肉制品的生產(chǎn)過程中，提高肉制品pH值，可以增加肉制品的系水性[8]。由此可知，實(shí)驗(yàn)pH值升高，可能與肉制品系水性提高相關(guān)。實(shí)驗(yàn)后期，乳酸菌、微球菌占據(jù)微生物菌群的主導(dǎo)地位，乳酸菌產(chǎn)酸，使肉制品的pH下降；微球菌也可以降低pH，控制病原微生物和腐敗微生物的生長[9]。

圖6 新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中pH值變化圖

2.3 優(yōu)勢菌種鑒定結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)初期的優(yōu)勢種為清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、彎曲乳酸桿菌（Latilactobacillus curvatus）、魏森特普山假單胞菌（Pseudomonas weihenstephanensis）、乳酸乳球菌亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）、馬葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、短波單胞菌屬（Brevundimonassp.）；在實(shí)驗(yàn)中期的優(yōu)勢種為清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、魏森特普山假單胞菌（Pseudomonas weihenstephanensis）、多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）；在實(shí)驗(yàn)后期與末期的優(yōu)勢種為清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、彎曲乳酸桿菌（Latilactobacillus curvatus）、琥珀酸葡萄球菌亞種（Staphylococcus succinussubsp.succinus）。

3 結(jié)論

新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中細(xì)菌總數(shù)均沒有超過國家標(biāo)準(zhǔn)，可以安全食用。細(xì)菌總數(shù)及微球菌、乳酸菌、乳桿菌、葡萄球菌呈上升趨勢，細(xì)菌總數(shù)及乳酸菌、乳桿菌數(shù)目較高。優(yōu)勢細(xì)菌以乳酸菌、乳桿菌為主，其次為假單胞桿菌、葡萄球菌，以及少量的鞘氨醇桿菌、單胞菌屬。

（2）新鮮牦牛肉風(fēng)干過程中pH變化基本上呈上升趨勢，pH為5.35～6.23，其pH值波動(dòng)或與乳酸菌、微球菌使牦牛肉pH值下降，與肉制品系水性提高使pH升高有關(guān)。

（3）清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）的代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素和肽聚糖可以抑制致病或腐敗細(xì)菌。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，為優(yōu)勢種。清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）對(duì)牦牛肉風(fēng)干過程中腐敗微生物起抑制作用。彎曲乳酸桿菌（Latilactobacillus curvatus）可以在牦牛肉風(fēng)干過程的初期與后期起到抑制各種腐敗菌和致病菌增長的作用。這兩種菌或在牦牛肉風(fēng)干過程中有效抑制了致病菌及腐敗菌的增殖，為保持牦牛肉風(fēng)干過程中的安全性及可食用性提供了切實(shí)的保障。