液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中滅螨醌 和羥基滅螨醌殘留量的分析方法

◎ 李 苗，代 菲，金 萍，丁洪流，秦孟姣

（1.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 蘇州 215104；2.SCIEX亞太技術(shù)支持中心，上海 200335）

茶作為我國的傳統(tǒng)飲品，也是世界三大飲料之一[1]。據(jù)科學(xué)測(cè)定，茶葉中含有兒茶素類、咖啡堿、茶多酚、維生素和礦物質(zhì)等多種成分，不僅對(duì)多種疾病有治療作用，而且有良好的延年益壽、抗老強(qiáng)身的作用。茶樹種植過程中出現(xiàn)的蟲害種類較多，螨類較多時(shí)對(duì)茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)都有嚴(yán)重影響，從而造成經(jīng)濟(jì)損失。很多茶農(nóng)會(huì)噴灑農(nóng)藥以防治病蟲害，但茶葉易吸附農(nóng)藥。大多數(shù)茶葉都含有一定量的農(nóng)藥，只要農(nóng)藥殘留量低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量，就是安全的產(chǎn)品。滅螨醌作為觸殺性殺螨劑，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[2]中滅螨醌（滅螨醌與其代謝物羥基滅螨醌之和）限量為0.01 mg·kg-1。本實(shí)驗(yàn)參照《出口食品中滅螨醌和羥基滅螨醌殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 4066—2014）[3]中前處理方法，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對(duì)茶葉中滅螨醌和羥基滅螨醌殘留量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滅螨醌標(biāo)準(zhǔn)品、羥基滅螨醌標(biāo)準(zhǔn)品（美國A Chemtek公司）；乙腈、丙酮、甲醇、正己烷、甲酸和乙酸銨（色譜純，美國Merck公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水一級(jí)水；氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司）；弗羅里硅固相萃取小柱（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

I-Class液相色譜儀（美國Waters公司）；Qtrap 6500串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；電子分析天平（0～120 g，英國梅特勒-托利多公司）；渦旋混合儀（IKA）；氮吹儀（杭州奧盛儀器）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

稱取2.5 g茶葉于50 mL離心管中，加入5 mL水、0.02 mL甲酸后，放置0.5 h。加入15 mL甲酸-乙腈溶液，高速勻漿1 min，加入2 g氯化鈉，漩渦混勻，離心5 min，吸取上層有機(jī)相于25 mL容量瓶中。殘?jiān)屑尤?0 mL甲酸-乙腈溶液，重復(fù)提取一次，合并上層有機(jī)相并定容至25 mL。轉(zhuǎn)移5 mL有機(jī)相至試管中，在40 ℃條件下，氮吹濃縮至近干，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

以2 mL弗羅里硅土柱洗脫液分兩次洗滌試管中殘留物并全部轉(zhuǎn)入活化后的弗羅里硅土固相萃取柱中，待溶液全部流出后，加入10 mL洗脫液洗脫，收集全部洗脫液，于40 ℃氮?dú)獯抵两?，用乙腈溶解并定容? mL，過膜，測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制

分別精密稱取滅螨醌和羥基滅螨醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲酸-乙腈溶劑溶解并定容至刻度，搖勻，配制成1.0 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)液。稱取一定質(zhì)量的陰性樣品，按照上述前處理方法制備空白基質(zhì)溶液。準(zhǔn)確吸取滅螨醌和羥基滅螨醌混合標(biāo)準(zhǔn)液適量，用空白基質(zhì)提取液將其稀釋為標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，臨用時(shí)配制。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜參考條件。色譜柱：ACQUITY UPLC C18柱；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為10 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜/質(zhì)譜條件。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；電噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：400 ℃；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、定量離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓及碰撞能見表2。

表2 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、定量離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓及碰撞能表

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

準(zhǔn)確移取滅螨醌和羥基滅螨醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，用基質(zhì)空白提取液逐級(jí)稀釋成濃度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、25 ng·mL-1和 50 ng·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。線性相關(guān)范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3，滅螨醌和羥基滅螨醌線性范圍較寬，線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）[4]，應(yīng)滿足R≥0.98，本實(shí)驗(yàn)滿足要求。

表3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及線性方程表

2.2 定量限

稱取陰性樣品2.5 g于離心管中，加入濃度為25.0 ng·mL-1滅螨醌和羥基滅螨醌標(biāo)準(zhǔn)工作液0.500 mL，制備含滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度為5 μg·kg-1的待測(cè)試樣，經(jīng)提取和凈化后待測(cè)液濃度為2.5 ng·mL-1。待測(cè)液上機(jī)，進(jìn)樣2 μL，進(jìn)行色譜分析。根據(jù)上機(jī)結(jié)果，逐級(jí)稀釋待測(cè)液濃度，直到信噪比值約為10，即為定量限。

滅螨醌和羥基滅螨醌的色譜圖見圖1。滅螨醌的定量限為4 μg·kg-1時(shí)，信噪比為S/N=10.4；羥基滅螨醌的的定量限為2 μg·kg-1時(shí)，信噪比為S/N=10.2。S/N≥10時(shí)表明方法定量限驗(yàn)證結(jié)果能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求[5]。因此，滅螨醌的定量限為4 μg·kg-1，羥基滅螨醌的定量限為2 μg·kg-1，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

圖1 滅螨醌和羥基滅螨醌色譜圖

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

稱取2.5 g陰性樣品9份，分成3×3組分別進(jìn)行加標(biāo)，使樣品中滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度為5 μg·kg-1、20 μg·kg-1、80 μg·kg-13 個(gè) 梯 度， 按 照 1.3.1 和 1.3.2進(jìn)行樣品處理，滅螨醌和羥基滅螨醌的最終濃度為2.5 ng·mL-1，10.0 ng·mL-1，40.0 ng·mL-1， 上 機(jī)。 通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度，計(jì)算回收率，見表4。回收率為81.6%～97.4%，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可滿足茶葉中滅螨醌和羥基滅螨醌的測(cè)定要求（被測(cè)組分含量＜0.1 mg·kg-1時(shí)，回收率范圍為60% ～ 120%[6]）。

表4 滅螨醌和羥基滅螨醌的回收率表

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

稱取6份陰性樣品各2.5 g，向陰性樣品中加標(biāo)，按照1.3.1和1.3.2進(jìn)行樣品處理，樣液中滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度為10 ng·mL-1。根據(jù)滅螨醌和羥基滅螨醌的峰面積響應(yīng)值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。RSD為1.92%～2.39%，精密度滿足相關(guān)要求，具體見表5。

表5 滅螨醌和羥基滅螨醌精密度表

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)工作中，APCI源涉及的檢測(cè)項(xiàng)目較單一，而ESI源具有良好的通用性，且溶劑使用量較少，本實(shí)驗(yàn)的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法通過ESI源代替APCI源檢測(cè)滅螨醌及羥基滅螨醌，不僅線性良好、準(zhǔn)確可靠、靈敏度和精密度高，而且在大批量檢測(cè)任務(wù)中，可節(jié)省更換離子源環(huán)節(jié)的時(shí)間，延緩儀器使用壽命，提高檢測(cè)效率，為今后檢測(cè)茶葉中的滅螨醌和羥基滅螨醌含量提供了科學(xué)參考。