司美格魯肽對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病心肌病大鼠的保護作用及其機制研究

華炳紅，張菊云，鄭地明，黃辛欣

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種不同于器質性心血管疾病的特異性心肌病變，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一[1]。高糖誘導的細胞因子激活與細胞凋亡、炎性反應和微血管內皮下纖維組織增多等方面密切相關，參與DCM發(fā)病與心肌損傷[2-3]。因此，預防和改善糖尿病患者心肌微循環(huán)纖維化和炎性損傷具有重要的臨床意義。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸促胰島素，可通過調控β細胞的增殖、再生和凋亡，顯著降低患者糖化血紅蛋白和體質量，減輕炎性反應，從而改善心肌損傷[4-5]。司美格魯肽是GLP-1的類似物，臨床研究表明，其在血糖控制和心血管疾病長期預后中表現(xiàn)出良好的有效性和安全性[6]。但其對糖尿病并發(fā)癥,特別是對DCM的作用尚未可知。本研究擬分析司美格魯肽對DCM心肌結構、炎性反應和血管生成方面的影響及作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SPF級雄性SD大鼠60只，8～10周齡，體質量200～250 g，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SYXK(京)2019-0010。嚴格控制(25±1)℃恒溫、50%恒定濕度的標準通風飼養(yǎng)環(huán)境，每日12 h規(guī)律明暗交替光照，普通飼料適應性喂養(yǎng)1周。(2)藥品與試劑：鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，司美格魯肽(上海凱試生物科技有限公司，純度99%)，HE染色試劑盒，改良Masson三色染色試劑盒(索萊寶公司)，兔抗α-平滑肌肌球蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Abcam公司)，兔抗TNF-α抗體(Santa Cruz公司)，兔抗血管內皮生長因子(VEGF)抗體(Sigma公司)，兔抗β-actin抗體(Sigma公司)，山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)，DAB染色液(Dako公司)。(3)儀器設備：TG16-WS/TG16WS臺式高速離心機(中國湘儀集團)；Nikon Eclipse E600倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Bio-rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad Laboratories公司);BG-102血糖儀(上海羅氏制藥有限公司)。

1.2 實驗方法 2021年1月—2022年1月于中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院進行實驗。 60只SD大鼠隨機數(shù)字表法分為對照組、DCM組和干預組，每組20只。DCM組、干預組構建DCM模型：大鼠于禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 70 mg/kg(STZ采用0.1 mol/L、pH 4.2枸櫞酸緩沖液配置)，3 d后使用羅氏血糖檢測儀檢測小鼠血糖水平，隨機血糖大于16.67 mmol/L為糖尿病建模成功，檢測血糖，將大約6周左右發(fā)生DCM的大鼠納入實驗[7]。對照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。造模成功后，干預組大鼠每日給予司美格魯肽腹腔注射給藥(10 nmol/kg，溶于0.9% NaCl溶液)，對照組和DCM組以等量生理鹽水代替，均連續(xù)干預6周。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 心肌組織病理學檢測：干預結束后，大鼠禁食不禁水12 h，戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。脫頸處死，取出大鼠左心室標本，部分組織置于4%多聚甲醛固定24 h以上后，經脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，4 μm厚度切片，行HE和Masson染色，光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)并拍照，利用Image J計算心肌膠原體積分數(shù)(CVF)=單視野內膠原面積/心肌總面積×100%。

1.3.2 大鼠血糖、血脂指標測定：末次給藥后，不禁食采集大鼠眼內眥靜脈血，離心取上清，采用全自動生化分析儀檢測血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.3.3 心肌組織α-SMA和TNF-α表達測定：采用免疫組織化學檢測。心肌石蠟切片脫蠟，抗原修復，用3%過氧化氫孵育阻斷內源性過氧化物酶活性，分別與兔抗α-SMA多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗TNF-α抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日，與山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育60 min。DAB可視化顯色，鏡下控制反應時間(1～2 min)。每組準備5張切片，每張切片隨機選取5個區(qū)域進行分析，應用Image-Pro Plus 6.0測定有α-SMA陽性反應的小血管(即小血管平滑肌增厚且內部直徑<50 μm)和TNF-α陽性反應百分比面積。α-SMA和TNF-α的陰性對照組以相同的實驗方法處理，但不予抗體孵育。

1.3.4 心肌組織TNF-α和VEGF蛋白表達檢測：采用Western-blot法檢測心肌組織內TNF-α和VEGF蛋白表達。冰上剪碎心肌組織，利用RIPA裂解液180 μl+蛋白酶抑制劑20 μl對組織樣本進行勻漿，冰上裂解30 min。4℃離心取上清。BCA法檢測樣本蛋白濃度，煮沸變性。應用SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳。濕轉將蛋白轉移至PVDF膜(Millipore，美國)，8%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1 h，分別孵以TNF-α(1∶500)和VEGF一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次后，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。β-actin作為內參，使用Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學觀察比較 (1)HE染色：對照組大鼠心肌纖維形態(tài)均勻，排列規(guī)律緊密，胞核藍染清晰可見；DCM組大鼠心肌組織出現(xiàn)結構異常變性，表現(xiàn)為異常胞質空泡樣變性，心肌細胞排列疏松紊亂，肌纖維肥大斷裂；干預組大鼠經藥物治療后，心肌結構紊亂程度降低，心肌排列較DCM組規(guī)則，見圖1。(2)心肌Masson染色：對照組多為紅色為主的心肌纖維和藍色細胞核；DCM組大鼠心肌組織膠原纖維沉積明顯增多，相互交聯(lián)成網狀，排列紊亂，血管周圍纖維化明顯增多，而干預組大鼠間質膠原纖維減少，心肌纖維化程度得到明顯改善。DCM組心肌膠原體積分數(shù)(16.3±1.4)%高于對照組的(2.6±0.4)(t/P=42.079/<0.001)，干預組心肌膠原體積分數(shù)(6.8±1.7)%顯著低于DCM組，差異有統(tǒng)計學意義(t/P=19.292/<0.001)，見圖2。

注：A.對照組；B.干預組；C、D為DCM組，表現(xiàn)為心肌細胞破裂(之字形箭頭)，空泡化(十字箭頭)，間質液(雙裂箭頭)和紅細胞(粗箭頭)浸潤

注：A.對照組；B.DCM組；C.干預組

2.2 各組大鼠血糖及血脂水平比較 DCM組大鼠血清FPG、TC、TG和LDL-C水平均高于對照組(P<0.01),而HDL-C水平則顯著低于對照組(P<0.01)。干預組大鼠血清FPG、TC、TG和LDL-C水平均低于DCM組(P<0.01)，而2組HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組大鼠血糖、血脂水平比較

2.3 各組大鼠心肌組織TNF-α和α-SMA水平比較 免疫組化結果顯示，與對照組相比，DCM組大鼠心肌細胞TNF-α陽性細胞明顯增多(P<0.01)；與DCM組比較，干預組陽性細胞降低(P<0.01),見表2、圖3。對照組心肌組織中α-SMA表達僅在微動脈平滑肌層內；DCM組大鼠心肌組織α-SMA陽性細胞較對照組明顯降低(P<0.01)；與DCM組比較，干預組心肌組織中α-SMA陽性表達水平明顯增高，尤其是微動脈周圍心肌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2、圖4。

表2 各組大鼠心肌TNF-α、α-SMA水平比較

注：A.陰性抗體對照，細胞核呈藍色，胞漿呈淡藍色；B.對照組；C.DCM組，箭頭代表心肌細胞內棕黃色顆粒樣陽性物質增多，并聚合成團；D.干預組

注：A.陰性抗體對照，細胞核呈藍色，胞漿呈淡藍色，小動脈側部分紅細胞呈淡藍色；B.對照組；C.DCM組；D.干預組，箭頭代表棕紅色α-SMA陽性表達，主要集中于增厚的小動脈平滑肌層

2.4 各組大鼠TNF-α、VEGF蛋白表達比較 Western-blot結果顯示，與對照組比較，DCM組大鼠心肌TNF-α蛋白表達量明顯增高，而VEGF蛋白表達降低(均P<0.05)。與DCM組比較，干預組大鼠TNF-α蛋白表達降低，而VEGF蛋白表達升高(均P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織TNF-α和VEGF蛋白表達比較

3 討 論

當前全球糖尿病患病率逐年升高，且因血糖控制效果不佳，常伴隨不同程度并發(fā)癥，給患者生活質量帶來巨大負擔。高血糖作為糖尿病基本病因，可誘發(fā)多個系統(tǒng)和器官損害，也可介導炎性反應、細胞凋亡和心肌纖維化，是引起DCM的重要危險因素，且糖尿病患者通常伴有高脂血癥，亦可增加心血管疾病的風險[8]。GLP-1是一類治療2型糖尿病的新型藥物，可通過調節(jié)β細胞的增殖、再生和凋亡來增強胰島素分泌、模擬胰島素作用并抑制胰高血糖素，發(fā)揮降糖效果并改善血管內皮功能障礙，而司美格魯肽作為一種腸道分泌GLP-1類似物可能具有類似效果[9]。多項臨床研究表明，司美格魯肽可有效升高患者心肌梗死后的存活率，改善糖尿病患者心臟功能[6]。本研究結果顯示，司美格魯肽治療可顯著改善DCM組大鼠的高血糖和高血脂狀態(tài)，說明司美格魯肽對糖尿病患者具有明顯的降糖調脂作用，這些實驗結果與Kraljevic等[10]進行的研究結果部分一致，但其作用機制尚需進一步探索。

DCM是與糖尿病特有代謝紊亂有關的一種特異性心肌病變[11-12]。能量代謝紊亂引起的細胞因子和電生理改變，對心肌結構和功能產生損傷。多項研究表明，GLP-1類藥物和GLP-1受體激動劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonists，GLP-1RA)具有調節(jié)心肌纖維化作用，可改善糖尿病患者的心血管功能[13-15]。此外，其還可通過抑制炎性介質(血清TNF-α、IL-6和IL-1β)、氧化應激及P38、核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路以緩解大鼠DCM[16]。本研究病理組織結構檢測發(fā)現(xiàn)，DCM組大鼠心肌組織出現(xiàn)大量間質纖維化、炎性細胞浸潤、凋亡細胞增多和紅細胞異常分布等組織損傷。研究已證實，DCM發(fā)展過程中，抗氧化因子在心臟組織中急劇下降，持續(xù)增長的ROS刺激轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smad3信號通路激活，從而促進幾種關鍵纖維化標志物的表達，如DCM心臟中的α-SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原[17-18]。本研究以尾靜脈一次性注射大劑量STZ構建DCM模型，大鼠出現(xiàn)DCM典型生化指標表現(xiàn)，包括高血糖和高血脂等，說明模型構建成功。實驗結果顯示，STZ誘導的DCM大鼠心肌微動脈平滑肌層內成纖維細胞標志物α-SMA的表達明顯降低，提示由成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化增加，導致DCM心肌病理改變和心臟功能障礙，而干預組司美格魯肽治療則可顯著增加DCM大鼠心肌微動脈內膜α-SMA表達，抑制心肌細胞變性，緩解DCM大鼠心肌纖維化。以上結果提示，司美格魯肽可顯著改善DCM大鼠心肌組織結構病理改變，在結構和分子水平上阻止心肌細胞的退行性改變。

TNF-α是細胞因子網絡中的關鍵成分，具有多種生物學活性，活化的巨噬細胞產生過量TNF-α可介導炎性免疫損傷[19]。Palomer等[20]最近的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠心肌組織TNF-α的表達顯著增高，其水平與心肌纖維化程度和心室肌重量呈正相關。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，司美格魯肽可通過抗炎機制顯著降低NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎性因子的表達水平，抑制ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠的斑塊病變發(fā)展，這種改變在一定程度上與血糖、體質量和膽固醇降低無關[21-23]。本實驗結果顯示，DCM模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白表達顯著升高；同時，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，心肌細胞內TNF-α陽性棕黃色顆粒樣物質增多，并聚合成團。可見TNF-α參與了DCM病變的發(fā)展。此外，司美格魯肽治療可顯著降低DCM大鼠心肌組織TNF-α的表達和聚集，這表明司美格魯肽可通過抑制炎性反應發(fā)揮DCM心肌保護作用，與文獻報道相符[20]。

VEGF作為一種有效的血管生成因子，可刺激內皮細胞增殖，促進側支循環(huán)血管的發(fā)育，其在糖尿病患者中的表達降低可能是糖尿病患者心肌梗死高風險的重要因素之一[24]。Maskery等[25]發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動劑可減少腦梗死患者梗死面積、凋亡、氧化應激和炎性反應，并促使血管新生因子VEGF表達的上調，繼而增加神經和血管新生。本研究結果表明，司美格魯肽治療可顯著增加大鼠心肌組織VEGF表達，促進冠狀動脈微血管新生，對DCM心肌損傷發(fā)揮保護作用。

綜上所述，司美格魯肽可明顯改善DCM大鼠心肌組織結構病理改變，它在結構和分子水平上可阻止心肌細胞的退行性改變，對DCM組大鼠的心肌纖維化和炎性反應有明顯的保護作用，并且可促進冠狀動脈血管新生。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

華炳紅：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張菊云：提出研究思路，分析試驗數(shù)據，論文審核;鄭地明：資料搜集整理，論文修改;黃辛欣：課題設計，分析整理