基于16S rRNA測序技術分析HLAP患者腸道微生態(tài)變化及與IL-1、TNF-α的關聯(lián)性

黃奕森，曾以琳，張長青，陳雅妮，王育斌

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院消化內科，泉州 362000）

高脂血癥性急性胰腺炎(Hyperlipidemic Acute Pancreatitis，HLAP)是由高三酰甘油血癥而誘發(fā)的急性胰腺炎，患者臨床上可出現(xiàn)胰腺局部炎性反應，更嚴重者甚至出現(xiàn)全身炎性反應綜合征及器官功能衰竭。伴隨著我國生活方式以及飲食習慣的變化，高三酰甘油血癥已經(jīng)成為了急性胰腺炎的主要發(fā)病因素，同時其發(fā)病率也正逐年升高，但目前對于其發(fā)病機制并不清楚，且主要治療手段也不理想[2]。有文獻記載，當腸道出現(xiàn)細菌易位，脂多糖等一系列毒素入侵體內時，免疫細胞識別后會分泌大量的炎性因子，促進機體進入低炎性狀態(tài)，所以對于患者機體炎性反映的檢測也是較為重要的[3]。腸道菌群變化是腸道微環(huán)境以及腸道結構功能的重要影響成分，有研究發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎患者需要較長時間的禁食，這會導致腸道菌群失衡以及腸道屏障功能受到破壞[4]。但目前對于腸道微生態(tài)變化是否促進HLAP的發(fā)生與發(fā)展還有待考究[5]。因此本研究選取我院收治的60例急性胰腺炎患者以及同期61例健康體檢者臨床資料進行分析，研究基于16S rRNA測序技術分析HLAP患者腸道微生態(tài)變化及與IL-1、TNF-α的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2020年12月泉州市第一醫(yī)院收治的60例急性胰腺炎患者以及同期61例健康體檢者作為研究對象，將其中高脂血癥性急性胰腺炎列入HLAP組（n=33），非高脂血癥性急性胰腺炎列入非HLAP組（n=27），健康體檢者作為對照組（n=61）。HALP組33例，男性16例，女性17例，年齡38~61歲，平均年齡（53.23±5.98）歲，BMI指數(shù)19~23 kg/m2，平均BMI指數(shù)（22.41±1.01）kg/m2；非HALP組患者27例，男性14例，女性13例，年齡37~61歲，平均年齡（53.08±5.46）歲，BMI指數(shù)19~23 kg/m2，平均BMI指數(shù)（22.31±1.12）kg/m2，對照組61例，男性31例，女性30例，年齡37~61歲，平均年齡（53.11±5.61）歲，BMI指數(shù)19~23 kg/m2，平均BMI指數(shù)（22.24±1.07）kg/m2，兩組患者一般資料差異比較無統(tǒng)計學意義，具有可比性（P＞0.05）（見表1）。納入標準：患者符合《急性胰腺炎的診斷和治療》[6]中急性胰腺炎診斷標準；HALP組患者伴有靜脈乳糜血且TG 5.65～11.3 mmol/L或血清三酰甘油 （TG）>11.3 mmol/L；患者未合并其他系統(tǒng)性疾病，如高血壓、糖尿病、心臟病、腎病、肝病等；患者精神意志正?？膳浜现委?。排除標準：患者合并惡性腫瘤、白血病等重大疾?。换颊甙肽陜仍褂妹庖咭种苿?；患者胃腸功能障礙，入院2天內腸功能未恢復者；入選者資料不完整；懷孕和哺乳期女性。

1.2方法 腸道檢查微生態(tài)檢查方法:病例組患者均在入院第一時間提取糞便并進行檢測，對照組時間一致。收集糞便2 g，將其分裝于無菌干燥小瓶內，同時標記后放于-80℃冰箱內保存。采用16S rRNA測序技術分析HLAP患者腸道菌群，將標本給予深圳華大基因股份有限公司進行數(shù)據(jù)分析和對比。糞便內DNA提取以及16S rDNA擴增方法：糞便細菌的總DNA嚴格按照購自翌圣生物上?？萍加邢薰镜腗olPureStool DNA Kit糞便DNA提取試劑盒進行檢測；樣本使用前以及高通量測序方法：將擴增子片段回收，同時采用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶以T4多核苷酸激酶把黏性末端恢復為平末端，隨后將堿基A加于3端，促進DNA片段與3端具有T堿基的特殊接頭相連，設計合成具有測序接頭的雙探針融合引物，將基因組DNA設置為模板，隨后開始融合引物PCR，運用磁珠篩選目的擴增子片段，隨后采用合適的文庫開始制備簇以及測序。16S rDNA V4可變區(qū)引物序列：正向引物為5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3',反向引物3'-GGACTACHV GGGTWTCT-AAT-5'。在98℃下反應2 min，在95℃下反應20 s，在50℃下反應30 s，在72℃下反應30 s，以此順序反復進行30次，再次在72℃下反應30 s，使用Ampure XP beads排除掉非目產物。平均分子長度以上海安捷倫科技有限公司的2100生物分析工具進行測量。數(shù)據(jù)分析：采取條碼序列以內部所制作的程序將樣品拆分。條碼序列和測序的比對不允許有錯誤配對。在Hiseq2500，測序長度為P250，模式為PE250+8+8+250的平臺開始雙末端測序，下機數(shù)據(jù)將低質量序列去除，剩下的高質量數(shù)據(jù)運用在后期的分析中；將序列間相重疊的序列拼接為標簽；在所獲得相似度下將標簽換做為運算分類單位，隨后采用運算分類單位和數(shù)據(jù)庫進行比對，對運算分類單位進行物種注釋；在運算分類單位的基礎上與物種注釋結構進行樣品物種復雜度的對比分析以及組間物種差異分析。樣本組間差異分析：采用統(tǒng)計學方法對兩組樣本間的微生物豐度差異性進行測量，同時使用錯誤發(fā)現(xiàn)率對差異性顯著性進行評估。在門綱目科屬種之間差異性進行評價。采用Metastats軟件對組間差異性進行分析。

血清學檢測方法：血清學抽取時間與糞便樣品收集時間一致。抽取患者空腹靜脈血5 mL，并取2 mL放置于未加入抗凝劑的試管內，在常溫下靜置1 h，隨后以轉速為3500轉/min，持續(xù)離心5 min，分離血清并冷藏于-80℃的冰箱內，送至檢驗科。IL-1選取上海雙贏生物科技有限公司的IL-1 ELISA定量檢測試劑盒并采用酶聯(lián)免疫吸附定量檢測法進行檢測；TNF-α選取上?？道噬锛夹g有限公司的TNF-α檢測試劑盒并采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測。

1.3觀察指標 對比三組入選者腸道微生態(tài)以及血清IL-1、TNF-α水平；對比HALP組和非HLAP組患者腸道微生態(tài)?；颊呶⑸鷳B(tài)以chao指數(shù)和shannon指數(shù)進行表達，chao指數(shù)：樣本內群落的豐度，也就是樣本中物種的數(shù)量，但并不指群落內每個物種豐度。shannon指數(shù)：指的是群落內多樣性，群落內物種的豐富度和均勻度能夠對其造成影響。

1.4方法 SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。年齡計量資料以(±s)的形式表示，組間采用獨立樣本t檢驗、組內均采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，記P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1三組入選者糞便微生態(tài)對比 與對照組相比，HLAP組和非HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低；與非HLAP組相比，HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2三組入選者IL-1和TNF-α水平對比 與對照組相比，HLAP組和非HLAP組IL-1和TNF-α水平顯著更高；與非HLAP組相比，HLAP組IL-1和TNF-α水平顯著更高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 三組入選者糞便微生態(tài)對比(±s)

表1 三組入選者糞便微生態(tài)對比(±s)

注：與對照組相比a P＜0.05；與非HLAP組相比b P＜0.05。

組別 運算分類單位 chao指數(shù) shannon指數(shù)HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）對照組（n=61）2.51±0.18ab 2.78±0.26a 3.19±0.22 90.58＜0.001 FP 182.23±5.65ab 210.19±5.45a 224.23±5.89 575.29＜0.001 187.53±5.11ab 201.23±5.31a 218.77±5.12 409.01＜0.001

表2 三組入選者IL-1和TNF-α水平對比(±s)

表2 三組入選者IL-1和TNF-α水平對比(±s)

注：與對照組相比a P＜0.05；與非HLAP組相比b P＜0.05。

組別 IL-1（pg/L） TNF-α（pg/L）HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）對照組（n=61）108.21±10.08ab 64.52±10.31a 15.09±10.49 895.80＜0.001 FP 69.43±3.65ab 60.23±3.42a 40.51±3.39 823.98＜0.001

2.3 HLAP組和非HLAP組糞便菌群門豐度水平對比 相比于非HLAP組患者，HLAP組患者厚壁菌門、擬桿菌門顯著更低，變形菌門、梭桿菌門以及放線菌門顯著更高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 HLAP組和非HLAP組糞便菌群屬豐度水平對比 相比于非HLAP組患者，HLAP組患者雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、薩特菌屬和艾克曼菌屬顯著更高，擬桿菌屬、瘤胃球菌、梭菌屬、戴阿利斯特菌屬以及巨球菌屬顯著更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表3 HLAP組和非HLAP組糞便菌群門豐度水平對比(±s)

表3 HLAP組和非HLAP組糞便菌群門豐度水平對比(±s)

組別 厚壁菌門 變形菌門 擬桿菌門 梭桿菌門 放線菌門HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）t P 41.56±5.43 48.08±3.42 5.417＜0.001 19.52±3.28 10.23±3.41 7.724＜0.001 21.56±3.51 40.12±3.38 20.717＜0.001 2.89±0.57 0.57±0.49 16.691＜0.001 3.56±0.43 1.23±0.59 17.675＜0.001

3 討論

隨著我國生活水平的提升以及不良飲食習慣的變法，我國高三酰甘油血癥的發(fā)病率日益增加[7]。HALP又被稱為高三酰甘油血癥性胰腺炎，高三酰甘油血癥是急性胰腺炎的常見致病因素[8-9]。有研究統(tǒng)計，HALP占到急性胰腺炎的40%左右，且發(fā)病率有升高的趨勢[10]。腸道微生態(tài)是人類微生態(tài)中最大的組成部分，研究發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)在急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用[11-12]。但目前對于HALP患者腸道微生態(tài)學研究較少，因此本次研究對其展開研究并檢測患者血清炎性指標進行分析，為臨床的診治提供參考。

16S rRNA（16S核糖體RNA）測序技術是細菌編碼rRNA所對應的DNA序列，在所有的細菌基因組內均存在，具有準確、快速和靈敏的特點，可全方位表達腸道菌群的種類、分布以及豐度[13]。本次研究則采用分析HLAP患者和同期健康體檢者患者腸道菌群顯示，與對照組相比，HLAP組和非HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低；與非HLAP組相比，HLAP組運算分類單位、chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著更低。這說明，HLAP在患者發(fā)病中存在較為明顯的腸道微生態(tài)異常。研究過程中發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎發(fā)生時機體受刺激而釋放出多種細胞因子和炎性介質，而IL-1作為一種細胞因子，是活化單核巨噬細胞所生成，可促進淋巴細胞抗體的大量生成，具有調節(jié)炎性反應的作用，在HLAP的進展中發(fā)揮著重要作用[14]。而TNF-α在HLAP的發(fā)生過程中具有始動作用，其作為一種促炎性細胞因子，是炎性反應的敏感指標，誘導IL-1等基因表達,導致炎癥介質失控性釋放,并促進和調節(jié)細胞因子、黏附分子以及一氧化氮等炎癥介質分泌，且與疾病嚴重程度呈正相關[15]。在脂肪酶的促進下，三酰甘油會被分解為游離脂肪酸，而游離脂肪酸對于胰腺腺泡細胞以及毛細血管內皮細胞造成影響[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HLAP組和非HLAP組IL-1和TNFα水平顯著更高；與非HLAP組相比，HLAP組IL-1和TNF-α水平顯著更高。筆者推測由于IL-1和TNF-α的生物膜細胞毒作用可對生物膜直接造成損傷，進而引發(fā)細胞和細胞器的腫脹異變，通透性也會隨之升高，且其作為能夠介導機體感染、創(chuàng)傷和炎癥反應的重要細胞因子，參與了機體免疫系統(tǒng)的調節(jié)和炎癥反應的發(fā)生發(fā)展過程，因此其水平越高表明患者病情越嚴重[18-19]。厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門以及放線菌門都是消化道內較為多見的細菌。本次研究發(fā)現(xiàn)，相比于非HLAP組患者，HLAP組患者厚壁菌門、擬桿菌門顯著更低，變形菌門、梭桿菌門以及放線菌門顯著更高。這表明，HLAP組患者比非HLAP組急性胰腺炎患者腸道失衡更為明顯。在菌屬中，擬桿菌變化并不大，而其他菌屬均出現(xiàn)明顯的變化。其中對人體有害的擬桿菌屬、瘤胃球菌、梭菌屬、戴阿利斯特菌屬以及巨球菌屬出現(xiàn)明顯的降低，而雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、薩特菌屬和艾克曼菌屬明顯增加，這可能是因為機體對于菌群失衡以及腸道菌群移位的阻止形式[20-21]。本次研究通過對比性研究發(fā)現(xiàn)，HLAP患者腸道微生態(tài)以及炎性反應均出現(xiàn)明顯的失衡，存在相關性。但本次研究可能因為病例收集的因素，導致實驗存在一定偏差，以后因彌補此不足。

綜上所述，腸道微生態(tài)的失衡與HLAP患者存在明顯的相關性，在其發(fā)展過程中扮演著重要的角色，同時患者伴隨著炎性因子的升高。日后，我們需加強對高三酰甘油患者的管理，以預防和減少急性胰腺炎尤其是重癥急性胰腺炎的發(fā)生。

表4 HLAP組和非HLAP組糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

表4 HLAP組和非HLAP組糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

組別 擬桿菌屬 雙歧桿菌屬 瘤胃球菌屬 梭菌屬 鏈球菌屬HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）t P 19.43±5.08 22.14±5.12 2.041 0.045 2.45±0.51 0.43±0.28 21.945＜0.001 2.53±0.42 3.61±0.38 10.338＜0.001 5.41±1.42 11.87±1.54 16.877＜0.001 5.65±0.42 0.32±0.24 58.530＜0.001

續(xù)表4 HLAP組和非HLAP組治療后糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

續(xù)表4 HLAP組和非HLAP組治療后糞便菌群屬豐度水平對比(±s)

組別 薩特菌屬 艾克曼菌屬 戴阿利斯特菌屬 巨單胞菌屬 巨球菌屬HLAP組（n=33）非HLAP組（n=27）t P 3.89±0.43 1.24±0.46 23.015＜0.001 3.75±0.48 1.15±0.42 22.064＜0.001 0.88±0.43 2.78±0.31 19.221＜0.001 3.65±1.54 8.79±1.68 12.344＜0.001 0.54±0.28 3.89±0.41 37.484＜0.001