麻元通便止痛湯調控AMPK/eNOS信號通路改善大鼠慢傳輸型便秘的作用機制

謝昌營 余緒超 葛巍 吳成成 肖慧榮 林申奇 劉金連

關鍵詞麻元通便止痛湯;慢傳輸型便秘;AMPK/eNOS信號通路;作用機制

慢傳輸型便秘（slow-transmission constipation，STC）主要是因腸道蠕動功能及傳輸速度下降而引起的一種臨床常見疾病，其主要表現(xiàn)為大便干燥、排便困難、排便次數(shù)及便意減少[1-2]。目前，該病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且該病患者常伴有腹脹，日常生活備受影響，患者情緒也愈發(fā)焦慮，極易誘發(fā)其他基礎性疾病。因此，STC 已成為一個公共健康問題[3]。目前，該病的發(fā)病機制還不夠明確，許多研究結果也并未對其進行深入探索，因此，臨床一般多采用瀉藥或者促腸胃蠕動的藥物進行治療，但是此類藥物一般存在不良反應。由此可知，尋找有效且安全的藥物是目前亟待解決的問題。

麻元通便止痛湯是專業(yè)醫(yī)師通過多年研究而得，并已在臨床中證實該方具有潤腸通便、止痛止血的功效[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，STC 的發(fā)生與能量代謝紊亂密切相關，其中AMP活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）作為能量代謝調節(jié)的中樞，可調節(jié)蛋白質代謝、脂質代謝、糖類代謝、自噬和線粒體穩(wěn)態(tài)，對生理代謝活動具有重要意義[5-6]。內皮型一氧化氮合酶（endothelialnitric oxide synthase，eNOS）是抑制胃腸道運動的重要分子，其涉及的eNOS/一氧化氮（nitric oxide，NO）信號通路是AMPK的重要下游信號[7]。eNOS 是一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的亞型之一，也是NO合成的關鍵酶;NO作為一種消化道抑制性神經(jīng)遞質，主要作用于胃腸道平滑肌，可抑制平滑肌收縮，減少胃腸道蠕動[8]。由此推測，AMPK/eNOS信號通路對STC具有一定調控作用。但是麻元通便止痛湯是否可以通過調控AMPK/eNOS 信號通路治療STC 尚不明確。因此，本研究建立STC 大鼠模型，觀察麻元通便止痛湯對大鼠STC 的改善效果，并初探其作用機制，以期為該病的臨床治療提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有TDL-5-A 型高速離心機、Type T2A 型全自動凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司），DYY-12C 型電泳儀[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司]，F(xiàn)SH-2A型組織勻漿機（江蘇常州朗越儀器制造有限公司），WGLL823BE型恒溫箱（天津市泰斯特儀器有限公司），BP310P 型稱量天平（德國Sartorius 公司），BX53 型顯微鏡（日本Olympus 公司），RT-6100 型酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

麻元通便止痛湯由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房自制（取火麻仁30 g、苦杏仁10 g、大黃6 g、郁李仁20 g、厚樸10 g、枳殼20 g、生地20 g、玄參20 g、槐花10 g、地榆10 g、延胡索12 g、白芍10 g、甘草10 g 加1 500 mL水熬煎，熬至400 mL即可）;其他主要藥品與試劑有磷酸鹽緩沖液（PBS，成都中仕石化有限公司，批號2026067），石蠟（瑞沃德生命科技有限公司，批號69019361），NO、NOS 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號分別為20190310K8、218360343），eNOS 分析試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號PL107]，兔源AMPK多克隆抗體、兔源eNOS多克隆抗體、兔源哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）多克隆抗體、兔源結節(jié)性硬化復合物1（tuberous sclerosiscomplex 1，Tsc-1）單克隆抗體、兔源Tsc-2 單克隆抗體、兔源真核啟動因子4E 結合蛋白（4E binding protein，4ebp）多克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體（上海碧云天生物科技有限公司，批號分別為AF1617、AF1587、AF1627、AF2677、AF6792、AF5812、AF1186），羊抗兔免疫球蛋白G二抗（美國Abcam 公司，貨號211-035-109）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用SD雄性大鼠50 只，9 周齡左右，體質量約260 g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2018-0010。大鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度為27 ℃，濕度為55%，自由進食，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠分為空白組、模型組和麻元通便止痛湯低、中、高劑量組，每組10 只。參照文獻[9]方法進行造模：除空白組外，其余各組大鼠均灌胃2.5 mg/L 復方地芬諾酯混懸液（0.02 mL/g）進行造模，每日1 次，連續(xù)2 周。當大鼠體質量增長緩慢、糞便顆粒減少且干硬、精神較差時提示造模成功。本實驗所有大鼠均造模成功。造模成功后第2 天，麻元通便止痛湯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃麻元通便止痛湯6、12、18 mg/kg（根據(jù)前期預實驗結果設置[10]，以生藥量計），模型組與空白組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)2 周，給藥期間所有大鼠自由飲食。

2.2 大鼠糞便數(shù)量及含水率的檢測

收集各組大鼠治療前（制備STC 模型前14 d）和治療后（藥物治療期間14 d）每天的全部糞便，計算糞便總數(shù)量，并稱質量（即濕糞質量）。然后將全部糞便置于恒溫箱中烘烤，烘烤溫度為90 ℃，時間為3 h，烘干后再次稱糞便質量（即干糞質量），計算糞便含水率[糞便含水率=（濕糞質量-干糞質量）/濕糞質量×100%]。

2.3 大鼠炭末推進率的檢測

大鼠治療結束0.5 h 后，將2 mL質量濃度為50 g/L的炭末懸濁液灌入大鼠胃中，25 min 后處死大鼠，將小腸（幽門至回盲部）取出，自然平鋪于桌面上，自由伸展后測量小腸總長度及炭末混懸液在小腸內推進的距離，然后計算炭末推進率（炭末推進率=炭末推進距離/小腸總長度×100%）。

2.4 大鼠結腸組織的病理觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察。各組大鼠取結腸組織3 塊，用生理鹽水沖洗腸內容物后，將其中2 塊組織置于10%甲醛溶液中保存;另外1 塊組織裝入凍存管中，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)實驗。將于10%甲醛溶液中保存的結腸組織以流水沖洗并用乙醇脫水，再將該組織置于既溶于乙醇、又溶于石蠟的透明劑中，放入保溫箱中;待石蠟完全浸入組織后進行包埋、切片（5 μm）、染色，然后采用顯微鏡觀察各組大鼠結腸組織的病理學變化。

2.5 大鼠結腸組織中NO、NOS水平的檢測

采用ELISA 法檢測。取各組大鼠凍存的結腸組織適量，置于液氮中，然后將其剪碎倒入勻漿管中勻漿，離心收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書相關方法檢測大鼠結腸組織中NO、NOS的水平。

2.6 大鼠結腸組織中AMPK/eNOS信號通路相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法檢測。取各組大鼠凍存的結腸組織適量，加入裂解液裂解，以14 000 r/min 離心15min，取上清液，以BCA 法測定蛋白含量。蛋白經(jīng)煮沸變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h;以TBST洗膜10 min×4次，加入AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST 洗膜10 min×4 次，加入二抗（稀釋度為1 ∶2 500），室溫孵育2 h;以TBST洗膜10 min×4次，加入ECL試劑顯色5 min，采用全自動凝膠成像儀顯影曝光。采用Image J v1.8.0軟件對條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 麻元通便止痛湯中活性成分的篩選

麻元通便止痛湯中的君藥包括火麻仁、枳殼、生地，其中火麻仁具有潤腸、滑腸的功效，枳殼行氣消積，生地泄腸道實火、瀉下攻積，三者相輔相成[9]。為研究麻元通便止痛湯中活性成分與AMPK/eNOS信號通路的關聯(lián)，筆者首先通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，網(wǎng)址為http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）檢索麻元通便止痛湯中火麻仁、枳殼、生地的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選麻元通便止痛湯中活性較高的成分，并參考文獻[11]進行補充，即得麻元通便止痛湯的活性成分。

2.8 麻元通便止痛湯中活性成分與AMPK、eNOS的分子對接分析

選擇麻元通便止痛湯君藥各藥材Degree 值最高的活性成分進行分子對接[12]。檢索并下載TCMSP數(shù)據(jù)庫中活性成分的2D結構和3D結構，采用YASARA分子模擬軟件經(jīng)去H2O、加H質子化和添加缺失原子后，運用PyMOL、AutoDockVina等軟件進行分子對接。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 大鼠糞便數(shù)量、含水率及炭末推進率的檢測結果

治療前后，與空白組比較，模型組大鼠糞便數(shù)量、含水率及炭末推進率均顯著減少或降低（P<0.05）。治療后，與模型組比較，麻元通便止痛湯各劑量組大鼠糞便數(shù)量、含水率及炭末推進率均顯著增加或升高（P<0.05）。與治療前比較，麻元通便止痛湯各劑量組大鼠糞便數(shù)量及含水率均顯著增加或升高（P<0.05）。結果見表1。

3.2 大鼠結腸組織病理觀察結果

HE染色結果顯示，空白組大鼠結腸組織結構清晰，黏膜上皮結構較好，細胞排列整齊均勻;模型組大鼠結腸組織結構紊亂，肌層較薄，黏膜下層見大量炎癥細胞浸潤;麻元通便止痛湯各劑量組大鼠結腸組織結構逐漸清晰，黏膜下層炎癥細胞浸潤明顯減少，且隨劑量的增加，黏膜排列結構和肌層厚度與空白組差異不大。結果見圖1。

3.3 大鼠結腸組織中NO、NOS水平的檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中NO、NOS水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，麻元通便止痛湯各劑量組大鼠結腸組織中NO、NOS（麻元通便止痛湯低劑量組除外）水平均顯著降低（P<0.05）。結果見表2。

3.4 大鼠結腸組織中AMPK/eNOS信號通路相關蛋白表達水平的檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，麻元通便止痛湯各劑量組大鼠結腸組織中上述指標表達水平均顯著降低（P<0.05）。結果見表3、圖2。

3.5 麻元通便止痛湯活性成分的篩選結果

麻元通便止痛湯的君藥包括火麻仁、枳殼和生地，設置OB≥30%，DL≥0.18，同時去除無對應靶點的成分，最終篩選出火麻仁活性成分6 種、枳殼活性成分5種、生地活性成分2 種，結果見表4。

3.6 麻元通便止痛湯活性成分與AMPK、eNOS的分子對接結果

根據(jù)Degree 值得出火麻仁中評分最高的活性成分為（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide，枳殼中評分最高的活性成分為nobiletin，生地中評分最高的活性成分為stigmasterol等。運用PyMOL、AutoDockVina 等軟件對AMPK、eNOS 蛋白進行分子對接，并測定結合能。結果顯示，AMPK 與（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide 的結合能為- 5.15kJ/mol，與nobiletin 的結合能為-4.61 kJ/mol，與stigmasterol的結合能為- 4.83 kJ/mol;eNOS 與（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide 的結合能為-6.11 kJ/mol，與nobiletin 的結合能為-5.40 kJ/mol，與stigmasterol 的結合能為-5.91kJ/mol。具體結合模式見圖3、圖4。

4 討論

STC是病因極為復雜的疾病，且隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快及精神壓力的加重，該病的發(fā)病率也越來越高[13]?，F(xiàn)有的研究對該病發(fā)生的病理生理機制并不深入，治療方法雖然較多，但是效果并不理想。除此之外，已有研究指出，許多患者存在抑郁和焦慮等問題，且與病情發(fā)展密切相關[14-15]。因此，該病的治療越來越受到臨床關注。中醫(yī)認為STC 屬于“便秘”的范疇。在《諸病源候論·大便難候》中也有記載“大便難者，由五臟不調，陰陽偏有虛實，謂三焦不和則冷熱并結故也”，并指出該病的病因與機體臟腑的寒熱虛實有關[16]。本研究中的麻元通便止痛湯由中藥火麻仁、苦杏仁、大黃、郁李仁、厚樸、枳殼、生地、玄參、槐花、地榆、延胡索、白芍、甘草組成，其中火麻仁、苦杏仁、郁李仁共同增強潤腸、滑腸的功效;大黃、生地泄腸道實火，瀉下攻積;厚樸、枳殼行氣消積;玄參清胃腸虛熱的同時，解大黃藥性的峻烈;槐花、地榆止血;延胡索、白芍止痛;甘草清熱解毒，調和諸藥;最終達到潤腸攻積、行氣清熱、止血止痛的功效[13]。本課題組前期研究已證實，麻元通便止痛湯對便秘有明確療效，但是具體機制并不明確[17]。已有研究表明，AMPK/eNOS 信號通路可以抑制內皮細胞氧化應激反應和炎癥反應，從而促進內皮修復，發(fā)揮抗炎、抗凋亡的作用[18-19]。其中，抑制eNOS信號通路可減少結腸組織中NO、eNOS 的含量，從而抑制平滑肌收縮，減少胃腸道的蠕動[20-21]。目前，尚未有相關研究提到此通路與STC有相關性，基于此，本研究針對AMPK/eNOS 信號通路研究麻元通便止痛湯改善STC 的作用機制。

STC主要因腸道傳輸減慢，導致糞便在腸道中滯留過久，水分重吸收增加，致使大便干硬、排便時間延長、糞便排出困難。目前STC 的發(fā)病機制尚不明確。本研究首先觀察了大鼠治療前后糞便數(shù)量和含水率的變化，結果顯示，治療后，與模型組比較，麻元通便止痛湯各劑量組大鼠糞便數(shù)量及含水率均顯著增加，表明麻元通便止痛湯可改善大鼠便秘情況。而經(jīng)麻元通便止痛湯干預后，大鼠炭末推進率顯著增加，表明麻元通便止痛湯可改善大鼠的腸道蠕動功能。此外，本研究還觀察了大鼠的結腸組織病理變化，結果顯示，經(jīng)麻元通便止痛湯干預后，大鼠結腸組織結構逐漸清晰，黏膜下層炎癥細胞浸潤明顯減少，且隨劑量的增加，黏膜排列結構和肌層厚度與空白組差異不大，表明麻元通便止痛湯對STC的療效較好。而經(jīng)麻元通便止痛湯干預后，大鼠結腸組織中NO、NOS水平顯著降低，表明該藥可能對大鼠胃腸道功能有一定的改善作用。

研究發(fā)現(xiàn)，Tsc-1、Tsc-2 是mTOR活性調控的關鍵抑制因子，活化后的Tsc-1、Tsc-2 可以抑制mTOR的活性，從而抑制細胞生長;其次，mTOR可進一步激活其下游因子4ebp，發(fā)揮調節(jié)下游蛋白翻譯的作用[22 - 23]。而AMPK 位于mTOR 的上游，AMPK 的活化可正向促進mTOR的表達，但mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp 是否也可參與調控STC 尚不明確?；诖?，筆者采用Western blot法同時檢測大鼠結腸組織中AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp 蛋白的表達水平，結果顯示，經(jīng)麻元通便止痛湯干預后，大鼠結腸組織中上述蛋白表達水平均顯著降低。這表明，麻元通便止痛湯可通過抑制AMPK/eNOS 信號通路改善STC 模型大鼠的便秘癥狀及腸道功能。

火麻仁、枳殼和生地為麻元通便止痛湯的君藥，分子對接分析結果顯示，火麻仁、枳殼、生地中Degree 值評分最高的活性成分分別為（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide、nobiletin、stigmasterol，這3 種成分與AMPK的結合能分別為-5.15、-4.61、-4.83 kJ/mol，與eNOS的結合能分別為- 6.11、- 5.40、- 5.91 kJ/mol，且這3 種成分與AMPK、eNOS 的構象穩(wěn)定、結合活性較高，進一步說明麻元通便止痛湯對STC模型大鼠的改善作用與AMPK/eNOS信號通路有關。

綜上所述，麻元通便止痛湯可改善STC模型大鼠的便秘癥狀和腸道功能，其作用機制可能與抑制AMPK/eNOS信號通路有關。