p-AKT-mTOR-p70S6K信號(hào)通路蛋白與卵巢癌化療耐藥相關(guān)性的研究

劉文涓　　葉孜淵　　曹蘭琴

[摘要] 目的 探討p-AKT-mTOR-p70S6K信號(hào)通路蛋白與卵巢癌化療耐藥相關(guān)性。 方法 選取2007年2月～2014年5月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院收治的卵巢癌患者43例，其中18例患者為耐藥組，25例患者為敏感組，對(duì)43例患者均實(shí)施免疫組化方法檢測(cè)，對(duì)患者p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在兩組患者中的表達(dá)量情況進(jìn)行觀察。 結(jié)果 p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有明顯較高的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 p-AKT-mTOR-p70S6K信號(hào)通路中p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有較高的陽性表達(dá)率，具有較高的臨床推廣價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌;化療;耐藥;p-AKT蛋白;mTOR蛋白;p70S6K蛋白

[中圖分類號(hào)] R737.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）17-0084-03

Study on the correlation between p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway protein and chemotherapy resistance in ovarian cancer

LIU Wenjuan1? ?YE Ziyuan1? ?CAO Lanqin2

1.General Hospital of Pingxiang Mining Group Co.， Ltd.， Pingxiang 337000， China;2.Department of Obstetrics and Gynecology， Xiangya Hospital Central South University，Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To explore the correlation between p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway protein and chemotherapy resistance in ovarian cancer. Methods A total of 43 ovarian cancer patients who were admitted to Xiangya Hospital Central South University from February 2007 to May 2014 were selected. Among them， 18 patients were in the drug-resistant group， 25 patients were in the drug-sensitive group. Immunohistochemical methods were performed in all 43 patients. The expression levels of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in the two groups of patients were observed. Results The positive expression rates of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in ovarian cancer chemotherapy-resistant tissues were significantly higher than those in sensitive tissues， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion In the p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway， the positive expression rates of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in ovarian cancer chemotherapy-resistant tissues are significantly higher， which can be used as clinical markers to predict ovarian cancer chemotherapy resistance and have high clinical promotion value.

[Key words] Ovarian cancer; Chemotherapy; Drug resistance; p-AKT protein; mTOR protein; p70S6K protein

卵巢癌在臨床中十分常見，具有較高的病死率與發(fā)病率，由于卵巢癌早期并未具有顯著的臨床癥狀表現(xiàn)，因而當(dāng)患者被確診時(shí)多發(fā)展至臨床晚期，對(duì)其造成較大的不良影響[1]。且通過觀察發(fā)現(xiàn)，晚期腫瘤會(huì)發(fā)生盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，患者5年生存率僅為45%[2]。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及鉑類聯(lián)合紫杉醇的系統(tǒng)化療是臨床中醫(yī)生較多使用的方式，雖然能獲得一定的效果，但仍會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)耐藥的不良情況[3]。大鼠磷酸化AKT（p-AKT）蛋白、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶（mTOR）蛋白、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）蛋白能夠?qū)?xì)胞凋亡與增殖起到有效的調(diào)節(jié)作用，明確其含量，則能夠采取有效的措施進(jìn)行應(yīng)對(duì)，從而降低耐藥性，確?；颊攉@得良好的化療效果，最終可有效改善患者的健康水平[4]。本研究對(duì)其進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦產(chǎn)科2007年2月～2014年5月間收治的43例原發(fā)性卵巢上皮癌患者首次手術(shù)切除且保存在我院病理科的組織標(biāo)本石蠟切片。將43例患分為耐藥組18例與敏感組25例。耐藥組年齡31～62歲，平均（49.21±6.82）歲;敏感組年齡31～63歲，平均（49.73±7.21）歲。兩組病例的臨床特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有患者均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者進(jìn)行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及全面的分期手術(shù)后幾乎無殘留病灶;②經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)所有患者的疾病類型均為上皮性卵巢癌;③行卵巢癌減滅術(shù)及予以6～8個(gè)療程的紫杉醇及鉑類基礎(chǔ)化療的患者，半年內(nèi)未復(fù)發(fā)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未完成治療患者;②患有其他婦科惡性腫瘤疾病。

1.2 方法

1.2.1 組織切片的制備? 將組織切片后使用10%福爾馬林溶液對(duì)其進(jìn)行24～48 h的固定;首先采用梯度乙醇脫水方式對(duì)組織進(jìn)行脫水處理，使用二甲苯對(duì)切片組織進(jìn)行透明處理，然后將組織切片溶融石蠟中，每次浸泡30 min，共3次，再包埋;將包埋好的石蠟塊制作成為5μm的切片;之后使用蘇木精-伊紅對(duì)切片進(jìn)行染色處理。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)? 對(duì)染色后的切片進(jìn)行脫蠟與水化處理;使用PBS沖洗液進(jìn)行2次沖洗，每次各沖洗5 min;用蒸餾水或PBS配置新鮮的3% H2O2，在室溫環(huán)境下進(jìn)行5～10 min的封閉，使用蒸餾水進(jìn)行3次沖洗;對(duì)切片實(shí)施抗原修復(fù)，之后使用PBS沖洗液進(jìn)行5 min的沖洗;滴加正常山羊血清封閉液，在室溫環(huán)境下進(jìn)行約20 min的封閉，之后將多余液體甩去;滴加Ⅰ抗（p-AKT：1：100、mTOR：1：80、o70s6K：1：100），在37℃的條件下孵育1 h，之后使用PBS沖洗液進(jìn)行3次沖洗，每次各2 min;滴加生物素化二抗，在20～37℃的條件下孵育20 min，之后使用PBS沖洗液進(jìn)行三次沖洗，每次各2 min;滴加試劑SABC，在20～37℃的條件下孵育20 min，之后使用PBS沖洗液進(jìn)行4次沖洗，每次各5 min;使用DAB顯色試劑盒使其顯色;使用蒸餾水進(jìn)行沖洗，之后使用蘇木素進(jìn)行2 min的復(fù)染，鹽酸酒精進(jìn)行分化;最后脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.3 拍照? 每張片子在4倍鏡下拍3張、20倍鏡下拍3張。依據(jù)Fromowitz綜合計(jì)分方式對(duì)免疫組化結(jié)果實(shí)施判定。染色強(qiáng)度判定結(jié)果如下：無染色、淡黃色、淺棕黃色、大量深棕黃色顆粒的計(jì)分分別為0～3分;陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：0～4分分別代表<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%;兩者之和<2分計(jì)陰性（-），弱陽性（+）、中度陽性（++）、強(qiáng)陽性（+++）的計(jì)分范圍分別是2～3分、4～5分、6～7分。

1.3 觀察指標(biāo)

①p-AKT蛋白的表達(dá)與耐藥、敏感的關(guān)系。②mTOR蛋白的表達(dá)與耐藥、敏感的關(guān)系。③p70S6K蛋白的表達(dá)與耐藥、敏感的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。相關(guān)性采用Spearman分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-AKT蛋白的表達(dá)與卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感的關(guān)系

p-AKT蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中的陽性表達(dá)率顯著較高，相較于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 mTOR蛋白的表達(dá)與卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感的關(guān)系

mTOR蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有顯著較高的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 p70S6K蛋白的表達(dá)與卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感的關(guān)系

p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有顯著較高的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

卵巢癌在臨床中十分常見，臨床醫(yī)生于1996年開始將鉑類藥物與紫杉醇作為治療卵巢癌的常用化療藥物;然而由于部分卵巢癌患者并未對(duì)化療具有較高的敏感度因而無法獲得理想的治療效果。在對(duì)患者實(shí)施手術(shù)與化療后，約超過一半的患者發(fā)生急性化療耐藥并死亡現(xiàn)象，因此需要采取有效的措施改善其耐藥情況，以使患者獲得良好的治療效果，并提升其生存率。目前相關(guān)的專家學(xué)者發(fā)現(xiàn)卵巢癌耐藥與許多化療藥物相關(guān)靶標(biāo)分子與信號(hào)通路存在密切關(guān)聯(lián)[6，7]。臨床醫(yī)生多使用紫杉醇等一線化療藥物對(duì)患者實(shí)施化療治療，通過對(duì)患者的隨訪觀察可知，雖然該藥物能夠使患者獲得良好的效果，但也將產(chǎn)生較為嚴(yán)重的耐藥情況，從而最終無法使患者獲得良好的康復(fù)效果[8]。通過研究分析可知，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與增殖的過程中，p-AKT/mTOR/p70S6K蛋白具有重要的參與作用，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長使患者產(chǎn)生較大的化療耐藥情況，因此若能夠?qū)ζ浔磉_(dá)量進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)量，并采取針對(duì)性的措施進(jìn)行應(yīng)對(duì)處理，從而能夠有效降低甚至避免耐藥情況的發(fā)生，確?；颊攉@得良好的化療與康復(fù)效果[9，10]。依據(jù)本研究結(jié)果可知，p-AKT-mTOR-p70S6K信號(hào)通路中的3種蛋白在卵巢癌化療耐藥組中均具有顯著較高的表達(dá)。紫杉醇在臨床中多被用于治療卵巢癌與乳腺癌，能夠獲得較佳的療效;若AKT表達(dá)發(fā)生較大的不良情況，則會(huì)在較大程度上發(fā)生耐藥情況。依據(jù)國內(nèi)相關(guān)學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)，耐藥性會(huì)隨著p-AKT蛋白的陽性表達(dá)的提升而提升。本研究中，AKT蛋白在卵巢癌化療耐藥組中具有較高的表達(dá)，提示卵巢癌耐藥可能與AKT信號(hào)通路的異常活化存在密切關(guān)聯(lián)[11，12]。

p-AKT蛋白是57 kD的絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究顯示，活化的p-AKT蛋白對(duì)細(xì)胞增殖具有十分重要的調(diào)控作用，AKT蛋白能夠有效促進(jìn)下游蛋白的合成與活化，且能夠促進(jìn)mTOR蛋白的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯;通過其他研究可知，在腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移過程中，p-AKT蛋白信號(hào)通路也具有重要的參與作用?；颊咧詿o法獲得良好的預(yù)后效果，原因在于紫杉醇對(duì)卵巢癌與乳腺癌存在較高的耐藥性[13～16]。

當(dāng)前的研究成果多集中于細(xì)胞研究方面，關(guān)于在腫瘤組織及其腫瘤微環(huán)境中涉及到的機(jī)制方面并未有過多研究[17，18]。通過對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行的總結(jié)顯示，mTOR/p70S6K信號(hào)通路的激活會(huì)在較大程度上影響化療療效，與化療耐藥存在密切關(guān)聯(lián)[19，20]。本研究顯示，p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中的陽性表達(dá)率明顯高于敏感組織，提示其可作為預(yù)測(cè)耐藥發(fā)生的標(biāo)志，但依然需要加強(qiáng)研究，以便能夠獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，本研究認(rèn)為pAKT-mTOR-p70S6K信號(hào)通路中p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有顯著較高的陽性表達(dá)率，可作為重要的預(yù)測(cè)標(biāo)志。但依然需要進(jìn)一步的深入研究，以便能夠獲得更加準(zhǔn)確的研究結(jié)果，便于為臨床治療提供可靠保障。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?張艷，劉耀基，侯桂琴，等.mTOR通路增強(qiáng)宮頸癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株HeLa/PTX對(duì)紫杉醇的敏感性[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，36（3）：254-260.

[2]? ?栗浩然，王雅莉，李紅娟，等.lncRNAFAL1通過調(diào)控MAPK通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療耐藥性的影響及其機(jī)制[J].腫瘤防治研究，2021，48（4）：333-340.

[3]? ?李嬋玉，鄧潔，羅劍波，等.miR-10b通過mTOR/P70S6K信號(hào)通路對(duì)宮頸癌大鼠的作用機(jī)制研究[J].腫瘤藥學(xué)，2020，10（2）：185-190.

[4]? ?張亞萍，李衛(wèi)紅，李婧，等.蠲痛飲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（16）：24-30.

[5]? ?李寶成.舉重運(yùn)動(dòng)員的衛(wèi)星細(xì)胞活化和信號(hào)通路對(duì)阻力或聯(lián)合運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2020， 39（2）：309-314.

[6]? ?陳鑫培，蘇松，周鵬程，等.MiR-494通過激活PI3K/AKT通路減輕大鼠肝缺血-再灌注損傷[J].器官移植，2019， 10（3）：89-95.

[7]? ?樊陽陽，王影，袁峰，等.MALAT1靶向miR-142-3p在卵巢癌化療耐藥中的機(jī)制研究[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2020，47（2）：82-89.

[8]? ?夏霽，韓鳳娟.基于中藥藥性理論的中藥單體聯(lián)合治療化療耐藥型復(fù)發(fā)性卵巢癌可行性分析[J].江蘇中醫(yī)藥，2020，52（5）：75-78.

[9]? ?程琛，具晟，戴建榮，等.基于開放數(shù)據(jù)的卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥機(jī)制分析和治療藥物選擇研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2020，36（24）：3928-3935.

[10]? 馮旻璐，許海燕，賀海波，等.木瓜總?cè)仆ㄟ^調(diào)節(jié)miR-10a和PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[J].中藥材，2019，42（12）：2929-2935.

[11]? 張繼方，呂慶杰.漿液性卵巢癌中GPSM2的表達(dá)與化療耐藥及預(yù)后的相關(guān)性[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2020， 36（11）：1307-1312.

[12]? 王根生，王悅.卵巢癌微環(huán)境與化療耐藥發(fā)生相關(guān)的研究進(jìn)展[J].腫瘤，2020，40（1）：68-75.

[13]? 牛星燕、張冬萍、彭蕓花.卵巢癌鉑耐藥機(jī)制及相關(guān)靶向治療研究進(jìn)展[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2020，21（6）：108-110.

[14]? 趙楠，李玉花，王桂媛，等.PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及其在卵巢癌治療中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2019， 30（2）：264-268.

[15]? 潘忠勉，譚芳春，陳昌賢，等.卵巢上皮性癌耐藥相關(guān)ceRNA的生物信息學(xué)分析及臨床驗(yàn)證[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2021，56（2）：121-130.

[16]? 于哲，李曉敏，槐梅，等.核仁紡錘體相關(guān)蛋白1激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)肺癌進(jìn)展[J].中華腫瘤雜志，2020，42（7）：551-555.

[17]? 周丹. ZEB1與卵巢上皮癌化療耐藥相關(guān)的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤生物治療雜志，2020，27（3）：327-332.

[18]? 王安鳳，潘晨，童曉文.TLR4/MyD88信號(hào)通路在卵巢癌紫杉醇化療抵抗中的研究進(jìn)展[J].外科研究與新技術(shù)，2019，8（1）：49-53.

[19]? 何湛春，王敏，李艷華.腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)USP11/Twist1/Snail基因表達(dá)與卵巢癌預(yù)后和耐藥性的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2020，20（4）：586-588，591.

[20]? MI C，MA J，SHI H，et al. 4′，6-Dihydroxy-4-methoxyisoaurone inhibits the HIF-1α pathway through inhibition of AKt/mTOR/p70S6K/4E-BP1 phosphorylation[J].Journal of Pharmacological Sciences，2014，125（2）：193-201.

（收稿日期：2021-06-25）